コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

要約

この記事では、マウスの脳にウイルスベクターを顕微注入すると、その後買収、絶滅と回復期を含む条件付け場所嗜好パラダイムでテストする方法を説明します。

要約

興味のある選択的にノックアウト遺伝子に異なるマウス脳領域にCreリコンビナーゼを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）ベクトルをマイクロインジェクションすると、既存の方法に比べ、遺伝子欠失の強化された時間的及び地域固有の制御を可能にします。条件付き欠失はまた、loxPにはさまれた遺伝子を有するマウスと特異的遺伝子プロモーターの制御下でマウスを発現するCreリコンビナーゼを交配することによって達成することができるが、定位マイクロインジェクションは、関心のある実験的に決定時点で離散的な脳の領域の標的を可能にする。コカイン条件付け場所嗜好のコンテキスト、および撤退、消滅、および/または復職段階を含むことができるような自己管理や精神運動感など他のコカイン行動のパラダイムでは、この手法では、これらの個別に標的遺伝子のユニークな貢献を探索に特に有用であるコカイン誘発性可塑性のビヘイビア·モデルの位相。具体的には、この手法は、時間を越え行動への貢献をテストするための行動の離散段階で標的遺伝子の選択的切除が可能になります。最終的には、このような理解は、中毒性の行動の各段階の間に自分自身を提示する最も強力なリスク要因に対処する最善のことができる、よりター​​ゲットを絞った治療を可能にします。

概要

コカインは非常に強化精神刺激薬である。反復暴露に続いて、いくつかの分子や細胞適応が強迫的になると考えられている報酬関連脳回路で発生する薬物探索重大な臨床的問題¹ポーズ再発率の高さを促し、行動を。コカインは、遺伝子発現を調節することによって、これらの長期的な行動効果を発揮する。慢性コカインの使用から生じる適応を研究するために、前臨床げっ歯類モデルは、広く使用されている。そのようなモデルは、条件付け場所嗜好（CPP）パラダイムである。このモデルは、以前に中立的な環境とコカインのやりがいの特性と学び関連の開発が含まれます。特定の室とコカインのいくつかのペアリング後、動物を自由にコカインペアと非コカインペア環境を探索するために許可されていると、彼らは薬物ペアコンパートメントを好む場合は、それらは、コカイン誘発性のプラクを取得していると言われています電子好み。また、絶滅の訓練期間の後、このパラダイムはコカイン探索行動のコンテキスト固有の復職を研究するために使用することができます。

より正確に中毒性の模倣するように考えられているような長期的なコカイン誘発行動と分子可塑^2,3と自己管理（SA）を研究するために使用されている精神感、などの中毒性のような行動、他のビヘイビア·モデルに比べのような人間に見られる行動、CPPパラダイムは、コカイン文脈学習^4を勉強するための簡単な手順です。 CPPプロトコルは便利に薬物渇望のメカニズムと再発^5-7との調査を可能にSA、同様に、絶滅と復職段階を含むように拡張することができ、人間の薬物探索行動と薬物で発生するものの側面を要約すると考えられている-とキュー誘発再発^8-10。

その根底に一つのメカニズム買収、絶滅、そして復職など、CPPの異なる相のそれぞれの特徴であるコカイン誘発性行動の可塑性、異なる脳領域内の遺伝子発現のユニークな署名の活性化である。直接コカイン誘発性の行動変化を仲介報酬関連脳領域内のどの遺伝子テストするには、それは、地域固有の方法で選択的にそれらを操作できるようにすると便利です。これを達成する1つの方法は明白CreリコンビナーゼはloxP部位（loxPにはさまれたマウス）に挟まれた標的遺伝子を有するマウスの脳の異なる領域に、定位手術を使用している組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）ベクターを顕微注入することである。この方法では、いつ、どこで遺伝子が^11-13免疫応答を誘発することなく、両方の分割および非分割ニューロンにおいて、アブレーションさにわたって非常に正確な時間的·地域的に制御できます。このレベルの制御は、loxP導入マウスのw繁殖の伝統的なCRE-のLoxP技術上の重要な利点を表しという点で、内因性遺伝子プロモーターの制御下でCreリコンビナーゼを発現するマウスは、i番目のタイミングおよび遺伝子欠失の分布をより強固に規制することができる。また、ウイルスベクター媒介遺伝子ノックアウトは、伝統的なノックアウト戦略を使用して発生する可能性のある潜在的な発達代償効果を回避。

ここに記載されているコカインCPPに加えて、特定の遺伝子の役割を評価するためのloxPにはさまれたマウスの脳内のrAAV-Creのマイクロインジェクションは、自己投与及び精神運動感作を含む別々の相を含む行動のパラダイムに遍在的に適用することができる。例えば、我々の研究室では、コカイン精神運動感¹⁴中のCa _V 1.2 L型Ca ^{2 +}チャネルの役割を研究するためのrAAV-Creの技術を利用しています。具体的には、するrAAV-Creをを実証するためにコードする遺伝子のCa _V 1.2 loxP導入によるマウスの側坐核（NAC）にマイクロインジェクションしたことのCa _V 1.2この領域を仲介に精神感^14,15の発現位相を演技。精神感中のCa _V 1.3 L型Ca ^{2 +}チャネルの役割を評価する際に、目的のloxP導入遺伝子を持つマウスが存在しない場合は、するrAAV-Creの戦略を使用することができない、などの私たちの経験であった。条件付きマウスは、関心のある特定の遺伝子のために存在しない場合、したがって、のrAAV-Creリコンビナーゼを用いた制限は、それ自身を示す。しかし、我々はカルシウム_{バージョン} 1.3チャンネル^14,15の役割を調べるために行ったように明白なsiRNAは、ノックダウンの標的遺伝子に使用することができることrAAVs。

loxP導入マウスの離散的な脳領域にするrAAV-Creををマイクロインジェクションした後、CPPパラダイムでそれらをテストする中毒性のような行動の様々な段階を媒介し、彼らが行動している特定の遺伝子の調査を可能にします。このパラダイムを使用するには、本質的に繰り返しコカイン投与がBrをハイジャックする方法についての我々の理解で支援しているAINSの報酬回路は中毒状態^1,16,17につながることを分子シグナル伝達経路と遺伝子発現の不適応な変化を引き起こす。

プロトコル

すべての手順は、ワイルコーネル医科大学制度動物実験委員会の規則に従って行われている。

1。ウイルスベクターの定位配信のための準備とセットアップ

1. 楽器、滅菌綿棒、または滅菌手袋を着用して手が非滅菌表面に接触し、破棄するかホットビーズ滅菌器を使用して再滅菌する器具によって汚染されている場合は、新しい滅菌手袋に綿棒または変更を破棄します。
2. 術後の回復のために温めるヒートブロックで寝具とマウスのケージを置きます。
3. 頭皮を殺菌するために頭とエタノールとヨウ素を剃るための電気かみそりを設定します。
4. 70％エタノールでstereotaxの耳のバーや口のホールドを拭う。
5. 5μlのハミルトンシリンジを用いて、ウイルスベクター（1×10 ⁶ウイルス粒子/μl）を5μlのを策定し、stereotaxにシリンジホルダーに設置した。
6. マイクロ波加熱パッドまたは上の電気パッドを回すstereotax上番目の場所。火傷のリスクを軽減するために、クリーン吸収パッドでカバーしています。モニタ、マウス体温（97から99.5°Fの間に）頻繁に手順全体。
7. ケタミン（100 mg / kg体重）およびキシラジン（20 mg / kg体重）の混合物でマウス（22〜35グラムの間で計量）を注入。マウスを麻酔したら、マウスの反射神経をチェックして、マウスが十分に麻酔であることを保証するために、任意の動きや反応を注意するの尾先端をつまむ。
8. 耳と目の間に頭を剃る。
9. エタノールとヨウ素滅菌綿アプリケーターを交互に坊主頭を清掃します。
10. stereotax上の加熱パッドにマウスを転送します。

2。ウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

1. 手術全体に滅菌手袋を着用してください。手袋非滅菌表面に触れることにより、任意の時点で汚染されている場合は、手袋を変更してください。
2. ゼロの歯バーと耳のバースケール。
3. 歯バーに歯をセットします。
4. 銃口のネジ。揺らすまたはウィスカ移動した場合リーメントはいつでも注目される、ケタミン（100 mg / kg体重）およびキシラジン（20 mg / kg体重）の混合物の腹腔内ブースター用量（0.05〜cc）で管理する。
5. 耳バーのネジ。
6. PuraLubeで目に注油。
7. メスでただ後ろに耳に開いて頭皮をカットします。
8. 皮膚剥がれ頭蓋骨から頭皮の角の上に置いてブルドッグクリップ。ブレグマとラムダが簡単に表示されるはずです。
9. ブレグマからラムダへの縫合糸がまっすぐに整列していることを確認してください。縫合糸は、頭部の曲がっ再調整ポジショニングである場合。
10. stereotax上のすべての設定がゼロにされていることを確認してください。
11. ブレグマで所定の位置に針先を入れてください。
12. ブレグマとラムダの両方のすべての座標を測定します。これは、腹側/背内側/横と前方/後方の座標が含まれています。
13. ブレグマとラムダのために腹座標が互いに0.02 mm以内になるまで頭を調整します。
14. 一度内側/横（M / L）座標に内側に出かけるブレグマから、整列。ことを確認してください左右両側が互いに0.02 mm以内に整列される。
15. ブレグマ上で、そこから再センター針の先端は、目的の前方/後方の座標に（/ P）前方/後方方向に移動する。
16. 必要に応じて、角度一方向に針とstereotaxがロックされていることを確認してください。 （ - 1.52 + / - ）左M / Lの座標に出て行く
17. ボーリング孔を掘削した後にリファレンスとして使用するために頭蓋骨の上部の腹の位置を測定します。
18. 希望の座標に無菌のドリルビットを使用して掘削孔を開けます。針が頭蓋骨を通して中断なく入力することができますことを確認します。
19. 希望の腹側の座標に針を下ろし。
20. 一度座標はディップ0.015ミリメートルはウイルスベクターのための小さなポケットを作成するために〜10秒以下、到達する。
21. 〜0.1μL/分の速度でウイルスベクターの所望の体積を注入する。完全に拡散するウイルスベクターのために3分待ちます。針先0.015ミリメートルを上げ、さらに2分待つ。
22. 反対方向に針を（斜め注射を行う場合）を浸します。繰り返しになりますが、頭蓋骨の上部の基準として腹位置を記録。
23. （二国間の注射をしている場合）の反対側にウイルスベクターを注入する第一の側と同じ手順を繰り返します。
24. 滅菌綿棒先端の木製の終わりを使用してそれらを密封するために、両方の穴に骨ワックスを適用します。
25. 頭皮を縫合。
26. 負傷者の領域に神経ブロックを適用します。
27. 45分間回復するためのヒートブロック上で温めケージにstereotaxから、マウスと場所を削除します。
28. 含む痛みの兆候を監視します、全体的な活動や落ち着きのなさを減少させた食品や水の消費または増大発声を減少させた。ブプレノルフィン（0.05から0.2 mg / kg体重）は、痛みのため、必要に応じて一週間、毎日二回投与することもできる。許容可能な選択肢が含まれます：メペリジン（20-60 mg / kg）を、ペンタゾシン（10 mg / kg）を、ナルブフィン（4-8 mg / kg）を。

3。条件付け場所の人種：Acquisitionは、絶滅、そして復活

1. ギロチンドアが60秒の馴化期間の3室の場所嗜好装置（メッドアソシエーツ社、セントオールバンズ、VT、USA）の中央の室へ場所マウスは閉じた。
2. 馴化後、オープンギロチンドアやMedPC IVソフトウェア（メッドアソシエイツ社）を用いて記録されている各チャンバーに費やされる時間と1200のためのすべての3室のマウス自由探査秒、許す。
3. プレテストの間に彼らのパフォーマンスに基づいて空調室にマウスを割り当てます。ベースラインの事前テスト中に最も好まれたコンパートメントとのその後の3日間、バイアス設計、ペア薬物投与を使用。
4. 午前中のセッション中に、注射の直後1200秒、割り当てられた部屋でそれらを閉じ込める、次の3のコンディショニング日の間に、コカイン（IP 10 mg / kg体重）をマウスに注入する。セッションの後に自分のホームケージにマウスを返します。 4時間後、生理食塩水（0.01ミリリットル/ gのマウスに注入する体重）と1,200秒午後のセッションのために反対室にそれらを閉じ込める。
5. 取得のためにテストするには、ギロチンドアと中央のチャンバー内の場所のマウスは60秒の馴化期間のため閉鎖。オープンギロチンドアやMedPC IVソフトウェア（メッドアソシエイツ社）によって記録されたすべての室で過ごした時間を1,200秒のための無料の探査を可能にします。コカインペア室に費やされる時間の量から生理食塩水対のチャンバ内で費やされた時間を減算することにより優先順位を計算する。
6. 同一装置で毎日無料探査の2 20分のセッションにマウスを公開、場所嗜好を消​​すためには、買収のためのテスト後24時間を開始し、少なくとも2時間で区切られています。すべてのチャンバに費やされた時間は再度記録し、初期CPPの大きさがそれぞれ消光セッションのそれと比較されるべきである。
7. マウスはPAR用かどうかの好みを評価することによって、薬剤誘発性の好みを消滅しているかどうかを判断する二つの連続消光日にわたるticular室は、取得嗜好に比べて著しく低い。
8. コカインのプライミング用量（5または10 mg / kg体重、腹腔内）でマウスを元に戻すと無料探査を許可装置に再公開し、各区画にかかった時間を記録します。
9. Euthasol安楽死溶液（150 mg / kg）を管理します。 Transcardially 4％パラホルムアルデヒド（PFA）をマウスに灌流し、正しいマイクロインジェクションの配置を検証するための組織学的検査を行う。

結果

CPP

マイクロインジェクションマウスでCPPを実行した後、一方は制御注入のコホート（のrAAV-GFP）マウスは、通常の薬物ペアリング室（ 図1A、1B）の優先順位を取得していることを確認する必要があります。マウスは、コカインの好み（生理食塩水ペアリング室で過ごしたコカインペア室マイナス時間で費やされた時間）がベースライン嗜好（ 図1B、対B）<...

ディスカッション

絶滅と復職段階を含むCPPと組み合わせてウイルスベクターの定位マイクロインジェクション経由地域と時間的に特異的な遺伝子アブレーションは中毒性の​​ような行動の3つの異なる段階に遺伝子の特定の貢献の調査を可能にします。伝統的なCRE-のLoxPシステムを利用して達成され、条件付きノックアウトは空間、時間的制限遺伝子アブレーションに提供していますが、定位loxP導入マウスの...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004