Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

Riepilogo

Questo articolo viene descritto come microinject vettori virali nel cervello di topo e poi prova in un luogo climatizzato preferenza paradigma che comprende una fase di acquisizione, l'estinzione e la reintegrazione.

Abstract

Microinjecting virali (rAAV) vettori ricombinanti adenoassociated esprimono Cre ricombinasi in distinte regioni del cervello del mouse in modo selettivo i geni knockout di interesse permette maggiore controllo temporalmente e specifici per ogni regione di delezione genica, rispetto ai metodi esistenti. Mentre delezione condizionale può essere ottenuto anche con accoppiamento topi che esprimono ricombinasi Cre sotto il controllo di promotori genici specifici con i topi che portano un gene floxed, microiniezione stereotassico consente per il targeting delle aree cerebrali discrete a sperimentatore-determinati punti di tempo di interesse. Nel contesto di cocaina luogo preferenza condizionata, e altri paradigmi comportamentali della cocaina come l'auto-somministrazione o psicomotorio sensibilizzazione che può coinvolgere recesso, estinzione e / o fasi di rimessa, questa tecnica è particolarmente utile a esplorare il contributo unico di geni bersaglio di questi distinti fasi di modelli comportamentali di cocaina indotta plasticità. Specificamente,Questa tecnica permette di ablazione selettiva di geni bersaglio durante fasi distinte di un comportamento di testare il loro contributo al comportamento nel tempo. In definitiva, questa comprensione permette terapeutica più mirati che sono meglio in grado di affrontare i fattori di rischio più potenti che si presentano nel corso di ogni fase del comportamento di dipendenza.

Introduzione

La cocaina è uno psicostimolante altamente rinforzo. A seguito di esposizione ripetuta, diversi adattamenti molecolari e cellulari che si verificano in ricompensa rilevanti circuiti cerebrali che si ritiene di provocare compulsivo di droga in cerca di comportamento, provocando alti tassi di recidiva che presentano un grave problema clinico ^1. La cocaina esercita questi effetti comportamentali di lunga durata di regolare l'espressione genica. Per studiare gli adattamenti derivanti da uso cronico di cocaina, roditori modelli preclinici sono stati ampiamente utilizzati. Uno di questi modelli è il luogo preferenza paradigma condizionata (CPP). Tale modello prevede lo sviluppo di una associazione tra un ambiente appreso precedentemente neutro e le proprietà gratificanti della cocaina. Dopo diversi abbinamenti di cocaina con una particolare camera, sono ammessi animali di esplorare liberamente gli ambienti di cocaina-accoppiati e non-cocaina-appaiati e se preferiscono il vano droga appaiati, si dice che essi hanno acquisito un cocaina-indotta place preferenza. Inoltre, a seguito di un periodo di formazione estinzione, questo paradigma può essere usato per studiare al contesto specifico ripristino di cocaina comportamento di ricerca.

Rispetto ad altri modelli comportamentali di dipendenza comportamento simile, come sensibilizzazione psicomotorio, che viene utilizzato per studiare lungo termine indotta dalla cocaina comportamentale e plasticità molecolare ^2,3 e di auto-somministrazione (SA), che si ritiene più esattamente imitare coinvolgente comportamento simile trovato negli esseri umani, il paradigma CPP è una procedura semplice per studiare la cocaina apprendimento contestuale ^4. Protocolli CPP possono essere convenientemente estesi per includere l'estinzione e le fasi di reintegrazione, in modo simile a SA, che consentono di studiare i meccanismi alla base di craving e la ricaduta ^5-7 e che si ritiene di ricapitolare gli aspetti di ciò che avviene in umana droga in cerca di comportamento e droga - e cue-indotto ricaduta ^8-10.

Un meccanismo che sta alla base delcocaina-indotta plasticità comportamentale che è caratteristica di ciascuna delle distinte fasi di CPP, compresa l'acquisizione, estinzione e reintegrazione, è l'attivazione di firme uniche di espressione genica in differenti regioni cerebrali. Per testare direttamente quali geni all'interno di regioni cerebrali premio rilevanti mediare cocaina-indotta cambiamenti comportamentali, è utile essere in grado di manipolare selettivamente in maniera regionalmente specifico. Un modo per raggiungere questo obiettivo è quello microinject vettori ricombinanti adenoassociated virali (rAAV) che esprimono la ricombinasi Cre che utilizzano la chirurgia stereotassica, in aree distinte del cervello dei topi che hanno geni bersaglio affiancati da siti LoxP (topi floxed). Questo metodo consente il controllo temporale e regionale molto preciso quando e dove i geni vengono asportate, in entrambi i neuroni divisione e non la divisione, senza indurre risposte immunitarie ^11-13. Questo livello di controllo rappresenta un importante vantaggio rispetto tecnologia tradizionale Cre-loxP di allevamento topi floxed with topi esprimenti ricombinasi Cre sotto il controllo di un promotore del gene endogeno, in quanto i tempi e la distribuzione di delezione del gene possono essere più strettamente regolata. Inoltre, virali knockout genico mediata da vettori aggira potenziali effetti compensativi inerenti allo sviluppo che possono verificarsi utilizzando strategie di eliminazione diretta tradizionali.

Oltre alla cocaina CPP, che è descritto qui, la microiniezione di rAAV-Cre nel cervello di topi floxed per valutare il ruolo di specifici geni può essere applicato ubiquitariamente a paradigmi comportamentali che coinvolgono fasi distinte, tra cui l'auto-amministrazione e psicomotorio sensibilizzazione. Ad esempio, il nostro laboratorio ha utilizzato la tecnologia rAAV-Cre per studiare il ruolo del Ca _v 1.2 di tipo L Ca ^{2 +} canali in cocaina psicomotorio sensibilizzazione ^14. In particolare, rAAV-Cre stato microiniettato nel nucleo accumbens (NAc) di topi con il gene che codifica Ca _v 1.2 floxed, per dimostrare che Ca _v 1.2 che agisce in questa regione media la fase di espressione di sensibilizzazione psicomotoria ^14,15. Tuttavia, la strategia rAAV-Cre non può essere utilizzato se non esistono topi con un gene floxed di interesse, come era la nostra esperienza nel valutare il ruolo del Ca _v 1.3 di tipo L Ca ^{2 +} canali di sensibilizzazione psicomotoria. Quindi, una limitazione di utilizzo rAAV-Cre si presenta se non esistono topi condizionali per un particolare gene di interesse. Tuttavia, rAAVs che esprimono siRNA può essere utilizzato per geni bersaglio atterramento, come abbiamo fatto per esaminare il ruolo del Ca _{V 1.3} canali ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre in regioni cerebrali discrete di topi floxed e poi testarle nel paradigma CPP permette di indagine i geni specifici che mediano le varie fasi del comportamento di dipendenza, come e dove operano. L'utilizzo di questo paradigma ha aiutato nella nostra comprensione di come la somministrazione ripetuta di cocaina in sostanza dirotta il brains circuito ricompensa causando cambiamenti adattativi nel molecolari di trasduzione del segnale e l'espressione genica che portano allo stato di tossicodipendente ^1,16,17.

Protocollo

Tutte le procedure sono condotte in conformità con il Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care e Usa regole del Comitato.

1. Preparazione e configurazione di consegna stereotassico di vettori virali

1. Se uno strumento, tampone sterile, o della mano indossando guanti sterili è contaminata da entrare in contatto con una superficie non sterile, eliminare o ri-sterilizzare lo strumento con un caldo tallone sterilizzatore, scartare il tampone o passare a nuovi guanti sterili.
2. Posizionare una gabbia del mouse con biancheria da letto su un blocco di calore per riscaldare per il recupero post-operatorio.
3. Impostare rasoio elettrico per radersi la testa e l'etanolo e iodio per sterilizzare il cuoio capelluto.
4. Pulire le orecchie bar e bocca stretta della stereotax con il 70% di etanolo.
5. Utilizzando un 5 microlitri siringa Hamilton, redigere 5 ml di vettore virale (1 x 10 ⁶ particelle virali / mL) e istituito nel supporto siringa sul stereotax.
6. Riscaldamento a microonde pad o accendere pad elettrica su una° posto su stereotax. Coprire con un tampone assorbente pulita per ridurre il rischio di ustioni. Controllo della temperatura corporea del mouse (tra 97-99,5 ° F) frequentemente durante procedura.
7. Iniettare topo (peso compreso tra 22-35 g) con una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg). Una volta che un topo è anestetizzato, punta della coda pizzico di verificare i riflessi del mouse e osserva qualsiasi movimento o risposta per garantire che il mouse è adeguatamente anestetizzato.
8. Radersi la testa tra le orecchie e gli occhi.
9. Pulire la testa rasata con alternanza di etanolo e iodio sterili applicatori di cotone.
10. Passa il mouse a pad riscaldato stereotax.

2. Microiniezione stereotassica di vettori virali

1. Indossare guanti sterili durante l'intervento chirurgico. Se i guanti sono contaminati in qualsiasi momento toccando superfici non sterili, cambiare i guanti.
2. Zero bar e con i denti bar scale orecchio.
3. Set denti in bar dente.
4. Vite in museruola. Se dimenando o baffo mossazione è notato, in qualsiasi momento, somministrare una dose di richiamo ip (~ 0,05 cc) di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg).
5. Vite in barre orecchio.
6. Lubrificare gli occhi con PuraLube.
7. Tagliare cuoio capelluto aperta a appena dietro le orecchie con un bisturi.
8. Luogo bulldog clip su angoli del cuoio capelluto per sbucciare la pelle dal cranio. Bregma e lambda dovrebbe essere facilmente visibile.
9. Assicurati di sutura dal bregma al lambda sia allineata. Se la sutura è storto riaggiustare posizionamento della testa.
10. Verificare che tutte le impostazioni sulla stereotax sono azzerati.
11. Mettere la punta dell'ago in atto a bregma.
12. Misurare tutte le coordinate per entrambi bregma e lambda. Questo include coordinate dorsale / ventrale, mediale / laterale e anteriore / posteriore.
13. Regolare la testa fino a quando le coordinate ventrali per bregma e lambda sono a 0,02 millimetri l'uno dall'altro.
14. Una volta allineata, dal bregma medialmente andare fuori alle coordinate mediale / laterale (M / L). Assicurarei lati sinistro e destro sono allineate all'interno di 0,02 mm di vicenda.
15. Punta dell'ago ri-center su bregma e da lì muoversi nella direzione anteriore / posteriore (A / P) per la coordinata anteriore / posteriore desiderato.
16. Se necessario, ago angolo in una direzione e assicurarsi che il stereotax è bloccato. Uscire alla M / L coordinata sinistra (+ / - 1,52)
17. Misurare la posizione ventrale della parte superiore del cranio da utilizzare come riferimento dopo il pozzo viene perforato.
18. Praticare un foro con una punta sterile alla coordinata desiderata. Controllare che l'ago può entrare senza interruzioni attraverso il cranio.
19. Abbassare l'ago alla coordinata ventrale desiderato.
20. Una volta che la coordinata è raggiunto, dip 0,015 millimetri sotto per ~ 10 sec per creare una piccola tasca per il vettore virale.
21. Iniettare il volume desiderato di vettore virale a una velocità di ~ 0,1 ml / min. Attendere 3 minuti per il vettore virale per diffondere completamente. Sollevare la punta dell'ago 0,015 millimetri e attendere un ulteriore 2 min.
22. Immergere l'ago (se facendo iniezioni angolati) nella direzione opposta. Ancora, registrare la posizione ventrale come riferimento per la parte superiore del cranio.
23. Ripetete la stessa procedura sul primo lato di iniettare vettore virale sul lato opposto (se facendo iniezioni bilaterali).
24. Applicare la cera ossea per entrambi i fori per sigillarli con il fine di legno di una sterile cotton-fioc.
25. Suturare il cuoio capelluto.
26. Applicare il blocco del nervo alla zona ferita.
27. Rimuovere il mouse da stereotax e mettere in gabbia riscaldata sul blocco di calore per recuperare per 45 min.
28. Monitorare i segni di dolore, tra cui: riduzione dell'attività complessiva o irrequietezza, diminuzione del consumo di cibo e acqua o maggiore vocalizzazione. Buprenorfina (0,05 - 0,2 mg / kg) può essere somministrato due volte al giorno per una settimana, se necessario, per il dolore. Alternative accettabili includono: meperidina (20-60 mg / kg), pentazocina (10 mg / kg), nalbufina (4-8 mg / kg).

3. Condizionata Luogo Preferenza: Acquisition, Extinction e Ripristino

1. Topi posto nella camera centrale di un luogo apparato preferenza a tre camere (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) per un secondo periodo di 60 assuefazione con porte a ghigliottina chiusi.
2. Dopo assuefazione, porte a ghigliottina aperti e consentire topi libera esplorazione di tutti e 3 camere per 1.200 secondi, con il tempo trascorso in ciascuna camera di essere registrati utilizzando il software MedPC IV (Med Associates, Inc.).
3. Assegnare topi per camere di condizionamento in base al loro rendimento durante il pre-test. Usando un disegno di parte, coppia somministrazione del farmaco durante i successivi 3 giorni con il vano che era meno preferito durante la linea di base pre-test.
4. Nel corso dei prossimi 3 giorni di condizionamento, iniettare topi con la cocaina (10 mg / kg, ip), durante la sessione del mattino e li limita nella loro camera assegnata per 1.200 sec immediatamente dopo l'iniezione. Topi tornare alle loro gabbie a casa dopo la sessione. Dopo 4 ore, iniettare topi con soluzione salina (0,01 ml / gdi peso corporeo) e relegarli alla camera opposto per il secondo turno pomeridiano 1.200.
5. Per eseguire il test per l'acquisizione, posto topi in camera centrale con porte a ghigliottina chiuse per un secondo periodo di adattamento 60. Porte a ghigliottina aperte e consentire l'esplorazione libera per 1.200 secondi, con il tempo trascorso in tutte le camere registrati dal software MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calcola preferenza sottraendo la quantità di tempo trascorso nella camera salina-accoppiati dalla quantità di tempo trascorso nella camera di cocaina ea coppia.
6. Per spegnere la preferenza luogo, esporre topi per due sessioni di 20 min di libera esplorazione quotidiana dello stesso apparato, separati da almeno 2 ore, con inizio 24 ore dopo la prova di acquisto. Tempo trascorso in tutte le camere occorre nuovamente registrata e la grandezza del CPP iniziale deve essere confrontata con quella di ogni sessione estinzione.
7. Determinare se i topi hanno spento la preferenza indotta da farmaci da valutare se la preferenza per un parcamera di particolare attraverso due giorni di estinzione consecutivi è significativamente inferiore rispetto al punteggio di preferenza acquisizione.
8. Reintegrare topi con una dose primaria di cocaina (5 o 10 mg / kg, ip), e ri-esporre l'apparecchio che consente di esplorazione libera e registrare il tempo trascorso in ogni vano.
9. Somministrare soluzione eutanasia Euthasol (150 mg / kg). Transcardially perfusione topi con 4% paraformaldeide (PFA) ed effettuare un esame istologico per confermare il posizionamento corretto microiniezione.

Risultati

CPP

Dopo aver eseguito CPP sui topi microiniettati, si dovrebbe verificare che il gruppo di controllo a iniezione (rAAV-GFP) topi hanno normalmente acquisito preferenza per la camera di farmaco-accoppiato (Figura 1A, 1B). I topi sono considerati di aver acquisito la preferenza per una particolare camera di preferenza quando la cocaina (tempo trascorso nella camera di cocaina-accoppiato meno tempo trascorso in camera salina-accoppiato) è significativamente più alto rispetto al...

Discussione

Regionalmente e temporalmente specifici ablazione genica tramite microiniezione stereotassico di vettori virali combinati con CPP che include estinzione e le fasi di rimessa permette di indagine dei contributi specifici di geni di tre distinte fasi di comportamenti di dipendenza simile. Mentre knockout condizionale che viene realizzato utilizzando il sistema Cre-loxP tradizionale prevede spazio-temporalmente limitato ablazione genica, stereotaxically microinjecting Cre-ricombinasi in aree distinte del cervello di topi f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004