<em&gt; חוץ גופייה</em&gt; הכנה של נוירונים enteric המבודדים וגליה ממקלעת Myenteric של העכבר הבוגר

Summary

אנו מדגימים פרוטוקול תרבית תאים למחקר הישיר של רכיבים עצביים וגליה של מערכת העצבים enteric. נוירון / תרבות מעורבת גליה על coverslips מוכן ממקלעת myenteric של עכבר בוגר מתן היכולת לבחון נוירון בודד ופונקציה על ידי גליה electrophysiology, immunohistochemical, וכו '.

Abstract

מערכת העצבים enteric היא רשת עצומה של תאי עצב וגליה לאורכו של מערכת העיכול ששולטת תפקודי תנועתיות מערכת העיכול. הליך לבידוד והתרבות של אוכלוסייה מעורבת של תאי עצב וגליה ממקלעת myenteric מתואר. יכולות להישמר בתרבויות העיקריות במשך 7 ימים, עם קשרים המתפתחים בין תאי עצב וגליה. רצועת השריר האורכי עם myenteric מקלעת המצורפת הוא נגזל השריר המעגלי הבסיסי של המעי גס והעכבר או נתון לעיכול אנזימטי. בתנאים סטריליים, האוכלוסייה העצבית וגליה המבודדת נשמרות בתוך צנטריפוגה הבאה גלולה ומצופית על coverslips. בתוך 24-48 שעות, תוצאה neurite מתרחשת ויכול להיות מזוהה על ידי תאי עצב סמני הפאן עצביים. לאחר יומיים בתרבות, פוטנציאל פעולת אש נוירונים בודד כפי שנצפה על ידי מחקרי מהדק תיקון. יתר על כן, גליה enteric יכולה להיות גם identifמטען חבלה על ידי צביעת GFAP. רשת של נוירונים וגליה בפרד קרוב יוצרת בתוך 5 - 7 ימים. נוירונים מעיים יכולים להיות פרטני וישירות נחקרו באמצעות שיטות כגון אימונוהיסטוכימיה, electrophysiology, הדמיה סידן, ותא בודד PCR. יתר על כן, ניתן לבצע הליך זה בבעלי חיים מהונדסים גנטי. מתודולוגיה זו היא פשוטה לביצוע ולא יקר. באופן כללי, פרוטוקול זה חושף את המרכיבים של מערכת העצבים enteric באופן מניפולציות בקלות, כך שאנו עשויים לגלות טובים יותר את הפונקציונליות של ENS במדינות נורמליות ומחלה.

Introduction

מערכת העצבים enteric (ENS) היא רשת עצומה של עצבים וגליה שפועלת לכל האורך של מערכת העיכול (GI). ENS פונקציונלי שולט בכל ההיבטים של מערכת העיכול, כולל תנועת מעיים, קליטה / הפרשת נוזלים, תחושה של גירויים, וכו '(לסקירה ראה ^1). הוא מכיל מעל 500 מיליון נוירונים, יותר מאשר נמצא בחוט השדרה, והוא מכיל בכל כיתת מוליך עצבי במוח. יתר על כן, ENS הוא ייחודי בכך שהוא יכול לתפקד רפלקסיבי ללא קלט ממערכת העצבים המרכזית ^2. הבנה של ENS היא קריטית, לא רק כדי להבין את התפקיד הפיזיולוגי הרגיל שלו, אבל כדי להבין את מעורבותה במגוון רחב של neuropathies אשר יכולה להיות מולדים (מחלת הירשפרונג של), שנרכשה (Chagas), משנית למחלת הברית (gastroparesis הסוכרתי), תרופה המושרה (תסמונת מעי אופיואידים), או עקב פציעה (ileus לאחר ניתוח) ^1. בנוסף לכך, תאי עצב מעיים יכולים להיות מחדשservoir לזיהום נגיפי (אבעבועות רוח זוסטר) ^3. בגלל דמיונה למוח ואת הרמות הגבוהות של סרוטונין במעיים, לעתים קרובות יש תרופות שנועדו לטיפול בליקויים במערכת עצבים מרכזיים תופעות לוואי בלתי רצויות על ENS ^2. זה גם ראוי לציין כי neuropathies רבים כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון מראה שינויים תאיים דומים בתאי העצב, הרבה לפני ההופעה שלהם בתאי עצב מרכזיים המעיים, מה שהופך ENS מודל נגיש ללמוד פתוגנזה של מחלות אלו ^4. לכן, הבנה מעמיקה של ENS היא הכרח בהבנת מצבי מחלה ומניעה / ניבוי תופעות לוואי תרופתי.

הנוירונים של ENS נחקרו באופן מסורתי בחזיר באמצעות הכנות wholemount ^5-7 או נוירונים בתרבית ^8. למרות הקלות שבה ניתן ללמוד נוירונים בחיה הגדולה הזה, מודל זה יש מגבלות רבות, כוללחוסר של זנים מהונדסים גנטי, חוסר של חומרים כימיים ספציפיים למין זה, ואת העלות הגבוהה הקשורה עם ההזמנה ודיור נושאים אלה. יש ההתפתחות של מודל מערכת עצבים enteric עכברי את היתרון הייחודי של דפיקה שונות מתוך מערכות, מגוון רחב של שיטות אחרות שהוקמו, שניתן להשתמש בשילוב עם טכניקת תרבית התאים, ואת היכולת לספק אימות למודל חזיר גינאה .

ENS מורכב משלושה plexi הפועלים אורך של מערכת העיכול: myenteric מקלעת החיצונית (בין השריר האורכי וחוזר) האחראית בעיקר לפעולות הנפיחה של המעיים, כמו גם plexi submucosal והרירי, ( מצא מתחת ובתוך הרירית, בהתאמה), אשר במידה רבה שולטת בקליטה / הפרשת נוזלים וזיהוי של גירויים ^1. שיטה זו מתחילה בבידוד של הכנת מקלעת שרירים / myenteric האורך (LMMP) על ידי קילוףאת השכבה החיצונית של השרירים מערכת העיכול. כך יצמצם את הזיהום באופן דרמטי בנושאים שעולים כאשר השכבה הרירית מעורבת בבידוד. כתוצאה מכך, תהליך זה הוא אידיאלי ללימוד שליטה העצבית של תנועתיות ולא פעולות הפרשה של ENS.

השיטה שהוצגה כאן תוצאות בתרבות מעורבת של תאי עצב וגליה מעיים. לפחות שני סוגים שונים של תאי עצב מבוססים על תצפיות בהווה ואלקטרו immunocytochemical קודמות ^9. הנוכחות של גליה היא יתרון מאוד, כפי שהם לא רק סוג תא חשוב ללמוד בזכות עצמם, אבל הם תורמים להישרדות של תאי עצב enteric ¹⁰ ולשמור על ביטוי הקולטן מולדת על פני התא העצבי ^11. יתר על כן, ליקויים של גליה enteric עלולים להוביל למצבים חריגים במערכת העיכול מחלות תנועתיות, טבע ¹² 'נוירו gliopathies'. לכן, תרבות ENS מוצגת כאן Results בכמה סוגי תאים כי הם בשלים לחקירה.

היתרונות למתודולוגיה זו הם להקל על בידוד, דרישות כלי זולות, וזמן קצר כדי ללמוד את הטכניקה על ידי אנשי מעבדה מנוסים. מגבלות המתודולוגיה כוללות תשואה נמוכה כוללת של תאים מרקמות כרכים גבוהים והרחקה של נוירונים ENS מplexi הרירי וsubmucosal. הליך זה יהיה יתרון מאוד לחוקרים המתמחים באלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, תא בודד PCR, ושיטות אחרות.

Protocol

כל הטיפול בבעלי החיים ופרוצדורות היו בהתאם ובאושר על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדת שימוש באוניברסיטת וירג'יניה.

1. הכנת coverslips הזכוכית פולי-D-ליזין וLaminin מצופה סטריליים ב24 גם צלחות

1. כל הנהלים לשלב 1 מבוצעים בתנאים סטריליים; מתחת למכסת מנוע, ועם חומרים כימיים סטריליים. coverslips זכוכית והמים deionized כפולים (DDH ₂ O) צריכים להיות מעוקרים מראש. הכנת צלחות ניתן לעשות עד שבועיים לפני בידוד תא עצב.
2. מתחת למכסה המנוע, להשתמש במלקחיים סטריליים למקום coverslips זכוכית autoclaved ב12 בארות של צלחת 24 באר.
3. הכן את מניית פולי-D-ליזין מבעוד מועד. הוסף 50 מ"ל של ddH2O סטרילי עד 5 פולי-D-ליזין מ"ג. וורטקס וחנות ב3 aliquots מ"ל ב -20 ° C. הפשירי aliquots לפני השימוש.
4. לריכוז סופי של מניית פולי-D-ליזין 1 מ"ל לכל 25 ס"מ ^2: 80 פיפטה μlמניית של פולי-D-ליזין על גבי כל כוס coverslip (2 ² ס"מ). תנו פתרון להתפשר על 10 דקות.
5. הסר ואקום באמצעות פולי-D-ליזין ולשטוף coverslips 3x עם סטרילי DDH ₂ O.
6. לאפשר צלחות להתייבש במשך לפחות שעה 2 מתחת למכסת המנוע.
7. צלחות עשויות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או - 20 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לציפוי laminin.
8. הכן את מניית laminin מבעוד מועד. הפשירי laminin על קרח ולשמור על קרח בעת השימוש. לדלל את ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ"ל; לשים לב לריכוז הרבה, כל מגרש יהיה שונה. בהתאם לריכוז רב, כ 20 מיליליטר DDH ₂ O יתווסף לכל בקבוקון של laminin. Aliquot (5 מ"ל) ולאחסן ב -80 ° C. הפשירי aliquots על קרח לפני השימוש.
9. coverslips מעיל עם 5 מיקרוגרם / ² ס"מ; laminin μl פיפטה 200 מניות laminin על כל coverslip.
10. דגירה פתרון laminin על coverslips במשך שעה 1.
11. לשאוב פתרון laminin שנותר ולשטוף coverslips פעם אחת עםDDH ₂ O. הימנע מגירוד פני השטח של coverslips.
12. צלחות לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים.

2. הכנה מראש של Neuron פתרונות בידוד

1. הכן את פתרון קרבס (מ"מ: 118 NaCl, KCl 4.6, 1.3 אא ₂ PO _4, 1.2 MgSO _4, 25 NaHCO _3, 11 גלוקוז, ו2.5 CaCl _2). מקום 13.79 גרם NaCl (FW 58.44), 0.686 גרם KCl (FW 74.55), 0.312 גרם לאא ₂ PO ₄ (FW 120), .289 גרם MgSO ₄ (FW 120.4), 4.20 גר 'NaHCO ₃ (FW 84.01), גרם גלוקוז 3.96 (FW 180.2), ו0.555 גרם CaCl ₂ (FW 111) ב2 ליטר DDH ₂ 0. לצנן עד 4 ° C.
2. הכן לשטוף תקשורת (F12 תקשורת עם 10% עוברי שור בסרום (FBS) ואנטיביוטיקה / antimycotic): לבקבוק 500 מ"ל של F12 תקשורת, להוסיף 50 מ"ל FBS ו5 מ"ל של נוזל אנטיביוטי 100x / antimycotic (Gibco).
3. הכן תקשורת נוירון enteric (Neurobasal מדיה עם B-27, L-גלוטמין,, Neurotr 2 מ"מ 1% FBS 10 ng / ml, גליה נגזרפקטור ophic (GDNF), ונוזלי 100x אנטיביוטיקה / antimycotic). כדי להפוך את מניית GDNF, להוסיף 1 מיליליטר ddH2O לGDNF מיקרוגרם 10 ולהקפיא בחזרה ב50 aliquots μl, חנות ב -80 ° C. לבקבוקון 50 מ"ל של תקשורת נוירון השלם, לשלב 47.5 מ"ל Neurobasal מדיה, 50 מניות 1 מיליליטר B-27 (50x), 500 FBS μl, 500 μl 200 מ"מ L-גלוטמין (Gibco) μl GDNF ו500 אנטיביוטי / μl נוזלי 100x antimycotic. תקשורת נעשית בקבוצות קטנות 50 מ"ל על מנת להבטיח טריות GDNF וכדי למנוע זיהום של כמויות גדולות של תערובת תקשורת סלולארי יקרה זה.

3. קציר הכנת מקלעת שריר / Myenteric אורכית (LMMP) מעכברים

1. אתיקה לאומית ומוסדית מתאימה צריכה להיות במקום לפני ביצוע ניסויים בבעלי חיים. עכברים וובסטר שוויצרי למבוגרים במשקל מעל 25 גרם (בדרך כלל מעל 8 שבועות של גיל) הם שוכנו בקבוצות של 6 לפני ניסויים. רקמות משני עכברים המשמשות לבידוד של נוירונים enteric ileal וגליה ושלושה עכברים משמשיםבידוד של תאי מעי הגס.
2. הכן את אזור ניתוח. אסוף את המספריים קטנים כירורגיות, מלקחיים זווית, צמר גפן, שלוש כוסות זכוכית 200 מ"ל, ומוט זכוכית / פלסטיק (מכחול). ודא כי כל הציוד נשטפים ביסודיות ושטף לפני השימוש כדי למזער את הזיהום. צעד זה יכול להתבצע ביום שלפני הניסוי.
3. הנח פתרון קרבס על קרח ואת הבועה עם carbogen (חמצן 95%, 5% CO ₂₎ במשך לפחות 30 דקות כדי לייצב את רמת החומציות.
4. הפעל ציוד שונים וכימיקלים חמים לייצב בטמפרטורות רצויות; אמבט מים חום (ים) עד 37 מעלות צלזיוס צנטריפוגות מגניבה, עד 4 מעלות צלזיוס, מקום הפתרון של האנק מאוזן מלח (HBSS) וטריפסין 0.5% באמבט מים (37 מעלות צלזיוס ). תקשורת נוירון השלמה ומדיה לשטוף צריכה להישאר בקירור.
5. קרח קר מקום 150 מ"ל בעבע קרבס בשלוש כוסות זכוכית 200 מ"ל שכותרתו 'מלוכלכת', 'נקי', ו 'LMMP'. כוס בועה שכותרתו 'LMMP' עם carbogen.
6. בעקבות אישור מועדת אתיקה, להרדים מ 'ouse על ידי נקע בצוואר רחם או במשותף מחנק _2.
7. מקם את העכבר בrecumbence הגבי על פני השטח, עור נקי כירורגית עם EtOH 70%, ולהרים את עור בטן באמצעות מלקחיים. בעזרת מספריים, חלל בטן פתוח ולחשוף את איברי עיכול פנימיים.
8. הסר את האורך של מערכת העיכול על ידי הרמת חלק של מעי ומגלה לפדרו. חיתוך באמצעות לפדר עם מספריים כדי להסיר בעדינות ולפענח מעי ומעי גס, נזהר שלא למשוך לפדר מהמעי / המעי הגס.
9. לאחר באורך המלא של מעי נפרם, הסר את המעי על ידי חיתוך דרך המעי הדיסטלי ולקיבת פרוקסימלי לcecum. הערה: הליך זה יכול גם להתבצע עם רקמת המעי הגס על ידי הסרת המעי הגס דיסטלי לcecum להפרוקסימלי ל פי הטבעת.
10. רקמות ניתן לחלוקה נוספת בין מעי גס הפרוקסימלי ודיסטלי, וjejenum, ומעי. שאר הליך זה יתייחס לבידוד של המעי; לאהוא התהליך זהה לבידודה של LMMP מעי גס. הנח את כל המעי במכל זכוכית עם הקרח הקר קרבס מסומן 'מלוכלך'.
11. ליצור כלי לניקוי המעי; בוטה מחט גדולה 20 G באמצעות אבן הגשה ולצרף אותו למזרק גדול (10 מ"ל) המכיל קרח קר קרבס.
12. יש לנקות את צואה מהמעי על ידי חתך המעי לשלוש או יותר חתיכות גדולות. הסר סעיף ileal מהכוס ומניח את המחט הקהה לסוף פיסת ileal.
13. בעדינות תריץ את קרבס דרך סעיף הבטן עד שכל החומר צואתי יוסר לתוך מיכל פסולת נפרד. הנח את הסעיף ניקה לתוך המכל של קרבס המסומן "נקי". חזור על פעולה עד כל המעי הוא ניקה.
14. כדי להסיר LMMP, לחתוך את המעי למקטעים קטנים, כ 4 - 2 ס"מ. הנח קטע של מעי בפלסטיק או מוט זכוכית; מעי צריך להתאים מלבב, אבל לא יהיה רופף או מתוח (~ 2 מ"מ). בגין הסרת LMMP בעדינות על ידי הסרת פיסות לפדר עדיין לצרףאד לדרכים (GI) במערכת העיכול באמצעות מלקחיים. למנוע את מערכת העיכול ממסתובב סביב מוט בעדינות על ידי הצמיד לצינור המוט באמצעות האגודל.
15. הפרד LMMP מהשריר מעגלי הבסיס; ראשון לשפשף בעדינות את הקצה של המלקחיים לאורך כל הקו שבו לפדר צורף, מלמעלה עד למטה של ​​המגזר, בעדינות יוצר פער בשריר האורכי. ואז בעדינות להקניט אחד את השריר האורכי באמצעות מקלון צמר גפן רטוב עם קרבס.
16. מתחיל בחלק העליון של הפער בשריר האורכי ולהקניט מרחק באמצעות שבץ האופקי הקל תוך הפעלת לחץ קל מאוד עד שהשריר האורכי רק מתחיל להיפרד מהשריר המעגלי; לעשות את זה לאורך כל הרצועה לאורך נקודת החיבור לפדר.
17. ואז בעדינות מתחיל לעקוף את צינור העיכול; נע מלמעלה למטה ובחזרה כמו השריר האורכי מופרד לאט מהשריר המעגלי כל הדרך סביב הצינור. כאשר שלם,LMMP יבוא ממני באופן טבעי את השארית של צינור העיכול.
18. מניחים הרצועה דקה כתוצאה של שריר האורכי בכוס המסומנת "LMMP '. חזור על פעולה עבור כל המגזרים.
19. לאחר שכל הרצועות של LMMP כבר נאספו מעכבר אחד, חזור על תהליך עבור כל עכברים אחרים בשימוש. יש לשטוף היטב את הכוסות 'מלוכלכות' ו 'נקיות' לפני השימוש חוזר.
20. יש לשטוף את LMMP 3x להסיר זיהום ביולוגי. מלא שלושה 2 מ"ל אפנדורף צינורות עם הקרח הקר קרבס. מניחים את רצועות LMMP בצינור הספין הראשון במשך 30 שניות ב356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C. מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ולהעביר את רצועות LMMP לצינור מלא נקי קרבס הבא. חזור על תהליך זה עבור כל צינור הנותר.

4. תקציר LMMP

1. הכן את פתרון עיכול על ידי הצבת 13 מ"ג collagenase סוג 2 ו 3 מ"ג BSA בcarbogen-בעבע פתרון 10 מ"ל קרבס.
2. מגזרי מקום LMMP השטוף לפתרון עיכול וscis שימושsors כדי לגזור LMMP לחתיכות קטנות.
3. תקציר LMMP למשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עם שייקר בזמן שמבעבע בעדינות עם carbogen.
4. לאחר העיכול יושלם, לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ל8 דקות ב 356 XG בצנטריפוגה מקורר 4 ° C.
5. מכאן ולהבא צריכים לעשות את כל ההליכים בתנאים סטריליים במכסת מנוע תרבית תאים! כל חומרים כימיים ומכלי צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש.
6. במהלך צנטריפוגה, להכין פתרון טריפסין 0.05% על ידי הצבת 1 מ"ל חימם טריפסין 0.25% ו 4 מ"ל חימם HBSS לתוך צינור תא 50 מיליליטר סטרילי תרבות.
7. לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. לא להשתמש בשואב אבק, זה כנראה יהיה למצוץ את התא גלולה עקב מהירויות נמוכות צנטריפוגה. מוציא בזהירות את התא גלולה והמקום לתוך צינור נקי עם 5 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.05%.
8. לעכל את התאים בתמיסת טריפסין 0.05% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם הרעד במשך 7 דקות. לא תעלה על 7 ק"מn טיפול טריפסין מוחלט או נוירונים יאבדו.
9. לנטרל טריפסין עם 10 מ"ל של תקשורת לשטוף קרה אחרי 7 דקות של הטיפול בטריפסין.
10. צנטריפוגה תאים ל8 דקות ב 356 x גרם. להסיר ולסלק תקשורת.
11. במהלך צנטריפוגה, לאזן את קטע של רשת Nitex עיקור על גבי תא צינור 15 מ"ל סטרילי תרבות.
12. לאחר צנטריפוגה, להסיר ולהשליך supernatant. בעדינות תערובת תאי resuspend ידי triturating ב3 תקשורת נוירון שלמה מ"ל. הימנע מיצירת בועות אוויר בשלב זה וכל הצעדים העתידיים שבו תערובת תא triturated. צריך לעשות את כל triturations בעדינות רבה. פתרון תא סינון דרך Nitex הרשת לתוך צינור 15 מיליליטר תרבית תאים הנקי.
13. אופציונלי: צינור תרבית תאים שווי ומניח במיקסר חולה בקירור (או כל מיקסר המספק סיבוב) עם גלגול והטיה עדינים למשך 30 דקות. שלב זה הוא אופציונלי, אך מומלץ.
14. אופציונלי: לאחר מיקסר חולה, להוסיף 2 תקשורת לשטוף קרה מ"ל לשטוף את התאים.
15. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה (8 דקות, 356 XG). להסיר ולהשליך supernatant.
16. Resuspend תאים ב-1,200 תקשורת נוירון המלאה μl. Triturate תאים בעדינות באמצעות קצה פיפטה פלסטיק 1 מ"ל. לא ליצור בועות אוויר. פיפטה לאט ובעדינות עד שרוב הגושים שבורים ותאים מושעים לנוזל.
17. הוסף 750 μl של מדיה מלאה לכל אחת מהבארות המכילות 12 coverslip זכוכית מצופה מראש ולהוסיף 100 μl של פתרון תא triturated.
18. דגירה נוירונים בתרבית תאי חממה ב 37 ° C עם 5% CO _2.
19. שינוי מחצית התקשורת הסלולרי כל 2 ימים.
20. הנוירונים הם מוכנים להקלטות אלקטרו לאחר 1 - 2 ימים בתרבות.

תוצאות

מייד לאחר הבידוד של תאים שמקורם LMMP, נוירונים וסוגי תאים אחרים לא יהיה מוכן מאליו. חיים, ניתן לראות תאים עגולים של הפנוטיפ לא ברור, כמו גם שאריות רקמה מברי רקמה מתעכלים חלקי ורקמות חיבור. סחופה זה לא עניין ויוסרה במידה רבה עם שינוי התקשורת הראשונה ביומיים. אל תנסו לנ?...

Discussion

בעלי חיים המשמשים

פרוטוקול זה כבר מותאם לעכברים וובסטר שוויצרי. עם זאת, שיטה זו היא להתאמה בקלות ליונקים אחרים בינוני וקטנים כגון חולדות ולזנים אחרים של עכברים. יש לנו לבצע בהצלחה בידודים ראשוניים עם C57 עכברים וקולטניים μ-אופיואיד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)	Fisher Scientific	12-545-82
Poly-D-lysine	Sigma	P6407- 5 mg
24-well cell culture plate	CELLTREAT	229124	May use any brand
Laminin	BD Biosciences	354 232
ddH2O			Can prepare in lab
15 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	188261	May use any brand
50 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	227261	May use any brand
NaCl	Fisher BioReagents	BP358-212	MW 58.44
KCl	Fisher BioReagents	BP366-500	MW 74.55
NaH2PO4 .2H2O	Fisher Chemicals	S369-3	MW137.99
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506-500G	MW 120.4
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014-5KG	MW 84.01
glucose	Fisher Chemicals	D16-1	MW 180.16
CaCl22H2O	Sigma Aldrich	C5080-500G	MW 147.02
F12 media	Gibco	11330
Fetal Bovine Serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
Antibiotic/antimycotic 100x liquid	Gibco	15240-062
Neurobasal A media	Gibco	10888
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164
Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Neuromics	PR27022
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101	May use any brand
250 ml Graduated Glass Beaker	Fisher Scientific	FB-100-250	May use any brand
2 L Glass Erlenmyer flask	Fisher Scientific	FB-500-2000	May use any brand
Plastic rod (child's paint brush)	Crayola	05 3516	May use any brand
Carbogen	Airgas	UN 3156	5% CO2
10 ml Leur-lock Syringe	Becton Dickinson	309604	May use any brand
21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle	Becton Dickinson	305167	May use any brand
Collagenase type 2	Worthington	LS004174
Bovine Serum Albumin	American Bioanalytical	AB00440
2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes	Fisher Scientific	13-864-252	May use any brand
Nitrex Mesh 500 µM	Elko Filtering Co	100560	May use any brand
Pipette Set	Fisher Scientific	21-377-328	May use any brand
Sharpeining Stone	Fisher Scientific	NC9681212	May use any brand
Equipment
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)	Nuaire	NU-425-400	May use any brand
10 L Shaking Waterbath	Edvotek	5027	May use any brand
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	5417R	May use a single larger centrifuge with size adapters
Allegra 6 Series Centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
HuluMixer Sample Mixer	Invitrogen	15920D
AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator	Nuiare	NU-4750	May use any brand
Analytical Balance Scale	Mettler Toledo	XS104	May use any brand