Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

Resumen

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

Resumen

El sistema nervioso entérico es una vasta red de neuronas y glía que recorren la longitud del tracto gastrointestinal que funcionalmente controla la motilidad gastrointestinal. Se describe un procedimiento para el aislamiento y cultivo de una población mixta de neuronas y células gliales del plexo mientérico. Los cultivos primarios se pueden mantener durante más de 7 días, con conexiones en desarrollo entre las neuronas y la glía. La tira de músculo longitudinal con el adjunto del plexo mientérico se extrae del músculo circular subyacente del íleon o colon del ratón y se sometió a digestión enzimática. En condiciones estériles, la población de neuronas y glía aislado se conservan dentro del sedimento después de la centrifugación y se sembró en cubreobjetos. Dentro de 24 a 48 horas, neuritas se produce y las neuronas se pueden identificar por marcadores pan-neuronal. Después de dos días en cultivo, aisladas neuronas potenciales de acción del fuego como se observa en los estudios de patch clamp. Por otra parte, la glía entérico también puede ser identifdiado por tinción GFAP. Una red de neuronas y células gliales en estrecha aposición se forma dentro de 5 - 7 días. Neuronas entéricas pueden ser individualmente y estudiado directamente utilizando métodos tales como la inmunohistoquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio, y la PCR de una sola célula. Por otra parte, este procedimiento se puede realizar en animales modificados genéticamente. Esta metodología es simple de realizar y de bajo costo. En general, este protocolo expone los componentes del sistema nervioso entérico de una manera fácil de manipular por lo que podemos descubrir mejor la funcionalidad de la ENS en estados normales y de enfermedad.

Introducción

El sistema nervioso entérico (ENS) es vasta red de nervios y glía que recorre toda la longitud del tracto gastrointestinal (GI). La ENS controla funcionalmente todos los aspectos de la digestión, incluyendo el peristaltismo, la absorción / secreción de fluidos, sensación de estímulos, etc (para revisión ver ^1). Contiene más de 500 millones de neuronas, más que las encontradas en la médula espinal, y contiene todas las clases neurotransmisor encontrado en el cerebro. Por otra parte, la ENS es única, ya que puede funcionar sin reflejo de entrada desde el sistema nervioso central ^2. La comprensión de la ENS es crucial, no sólo para comprender su papel fisiológico normal, pero para comprender su participación en una variedad de neuropatías que pueden ser congénito (enfermedad de Hirschsprung), adquirida (enfermedad de Chagas), secundaria a estados de enfermedad (gastroparesia diabética), drogas inducida (síndrome de intestino narcótico), o debido a una lesión (íleo posoperatorio) ^1. Además, las neuronas entéricas pueden ser un reSERVOIR para la infección viral (varicela zoster) ^3. Debido a sus similitudes con el cerebro y los altos niveles de serotonina en el intestino, medicamentos destinados a tratar los defectos del sistema nervioso central a menudo tienen efectos secundarios no deseados en la ENS ^2. También es digno de mención que muchas neuropatías tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson muestran cambios celulares similares en las neuronas entéricas mucho antes de su aparición en las neuronas centrales, por lo que la ENS un modelo accesible para estudiar la patogénesis de estas enfermedades ^4. Por lo tanto, un conocimiento profundo de la ENS es una necesidad en la comprensión de los estados de enfermedad y la prevención / la predicción de efectos secundarios farmacológicos.

Las neuronas de la ENS se han estudiado tradicionalmente en el conejillo de indias usando preparaciones de wholemount ^5-7 o neuronas cultivadas ^8. A pesar de la facilidad con la que las neuronas pueden ser estudiados en este gran animal, este modelo tiene muchas limitaciones comofalta de cepas modificadas genéticamente, la falta de reactivos específicos para esta especie, y el alto costo asociado con el pedido y albergar estos temas. El desarrollo de un modelo de sistema nervioso entérico murino tiene la ventaja única de diversos sistemas de golpe hacia fuera, una amplia gama de otras metodologías establecidas que pueden ser utilizados en conjunción con la técnica de cultivo celular, y la capacidad de proporcionar una validación para el modelo de cobaya .

La ENS se compone de tres plexi que corren a lo largo del tracto gastrointestinal: el plexo mientérico exterior (entre el músculo longitudinal y circular), que es principalmente responsable de las acciones peristálticos del intestino, así como los plexos submucosa y la mucosa, ( encontrado en y dentro de la mucosa, respectivamente), que controla en gran medida la absorción / secreción de fluido y la detección de los estímulos ^1. Este método comienza con el aislamiento de la preparación del plexo muscular / mientérico longitudinal (LMMP) por peladofuera de la capa muscular exterior del tracto GI. Esto reduce drásticamente los problemas de contaminación que surgen cuando la capa de la mucosa está involucrado en el aislamiento. Como resultado, este proceso es ideal para el estudio del control neuronal de la motilidad en lugar de acciones de secreción de la ENS.

El método que aquí se presenta resultados en un cultivo mixto de las neuronas y células gliales entéricas. Al menos dos tipos diferentes de neuronas se basan presente en las anteriores observaciones electrofisiológicas y inmunocitoquímico ^9. La presencia de la glía es muy ventajoso, ya que no sólo son un importante tipo de células a estudiar en su propio derecho, pero que contribuyen a la supervivencia de las neuronas entéricas ¹⁰ y mantener la expresión del receptor nativo en la superficie celular neuronal ^11. Por otra parte, las deficiencias de la glía entérica pueden conducir a estados de enfermedad motilidad gastrointestinal anormal, acuñadas ¹² 'neuro-gliopathies. Por lo tanto, la cultura ENS presenta aquí resultados en varios tipos de células que están maduras para la investigación.

Las ventajas de este método son la facilidad de aislamiento, requerimientos de herramientas de bajo costo y muy poco tiempo para dominar la técnica por personal de laboratorio con experiencia. Limitaciones de la metodología incluyen el rendimiento general de la célula baja de volúmenes de los tejidos y la exclusión de las neuronas del plexo ENS mucosa y submucosa. Este procedimiento será muy ventajoso para los estudiosos especializados en electrofisiología, inmunohistoquímica, PCR de una sola célula, y otras metodologías.

Protocolo

Todo el cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se ajustaron y aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Virginia Commonwealth.

1. Preparación de cubreobjetos de vidrio estériles de poli-D-lisina y laminina revestida en placas de 24 pocillos

1. Todos los procedimientos para el paso 1 se llevan a cabo en condiciones estériles; debajo de una campana, y con reactivos estériles. Cubreobjetos de vidrio y agua desionizada doble (ddH ₂ O) deben ser esterilizados de antemano. Preparación de las placas puede hacerse hasta dos semanas antes del aislamiento neurona.
2. Bajo el capó, use pinzas estériles para colocar cubreobjetos de vidrio esterilizados en autoclave de 12 pocillos de una placa de 24 pocillos.
3. Prepare Stock poli-D-lisina antes de tiempo. Añadir 50 ml de ddH2O estéril a 5 mg de poli-D-lisina. Mezclar y almacenar en 3 ml alícuotas a -20 ° C. Descongele alícuotas antes de su uso.
4. Para obtener una concentración final de 1 ml de caldo de poli-D-lisina por 25 cm ^2: pipeta de 80 lde stock poli-D-lisina en la parte superior de cada cubreobjetos de vidrio (2 cm ^2). Deje que la solución reposar durante 10 min.
5. Retire poli-D-lisina de vacío y enjuague utilizando cubreobjetos de 3x con estéril ddH ₂ O.
6. Permitir que las placas se sequen durante al menos 2 horas bajo el capó.
7. Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C o - 20 ° C antes de proceder al recubrimiento laminina.
8. Prepare Stock laminina antes de tiempo. Descongele laminina en hielo y mantener en hielo durante el uso. Diluir a una concentración de 50 g / ml; prestar atención a concentración mucho; cada lote será diferente. Dependiendo de la concentración mucho, se añadieron aproximadamente 20 ml de ddH ₂ O a cada vial de laminina. Alícuota (5 ml) y se almacena a -80 ° C. Descongele alícuotas en hielo antes de su uso.
9. Cubreobjetos Abrigo con 5 mg / cm ² laminina; Añadir 200 L de stock laminina en cada portaobjetos.
10. Incubar solución de laminina en cubreobjetos durante 1 hora.
11. Aspirar solución de laminina restante y enjuagar una vez con cubreobjetosddH ₂ O. Evite raspar la superficie del cubreobjetos.
12. Placas se almacenan a 4 ° C durante un máximo de dos semanas.

2. Una preparación previa de la neurona Aislamiento Solutions

1. Prepare una solución de Krebs (en mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH ₂ PO _4, 1,2 _MgSO4, 25 NaHCO _3, 11 glucosa y 2,5 _CaCl2). Place 13,79 g NaCl (FW 58,44), 0,686 g KCl (FW 74,55), 0,312 g NaH ₂ PO ₄ (FW 120), 0,289 g _MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g de _NaHCO3 (FW 84,01), 3,96 g de glucosa (FW 180,2) y 0.555 g de _CaCl2 (FW 111) en 2 l ddH ₂ 0. Enfriar a 4 ° C.
2. Preparar enjuague medios (medio F12 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y antibiótico / antimicótico): A una botella ml de medio F12 500, añadir 50 ml de FBS y 5 ml de líquido 100x de antibiótico / antimicótico (Gibco).
3. Preparar los medios de comunicación neurona entérica (Neurobasal A los medios de comunicación con B-27, 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 10 ng / ml, Neurotr derivado de la glíaFactor de ophic (GDNF), y de antibiótico / antimicótico líquido 100x). Para hacer un caldo GDNF, añadir 1 ml ddH2O GDNF a 10 mg y congelar de nuevo en 50 alícuotas, almacenar a -80 ° C. Para un ml frasco de medios de comunicación neurona completos 50, combinar ml Unos medios de comunicación 47.5 Neurobasal, 1 ml de B-27 (50x), 500 l de FBS, 500 mM de L-glutamina (Gibco) 50 de stock GDNF l l, 200 y 500 l antibióticos / Liquid 100x antimicótico. Los medios de comunicación se hace en pequeños lotes de 50 ml para garantizar la frescura de GDNF y para evitar la contaminación de grandes cantidades de esta mezcla de medios de comunicación celular caro.

3. Harvest Longitudinal Plexus (LMMP) Preparación del músculo / mientérico de ratones

1. Éticos nacionales e institucionales apropiadas deben estar en su lugar antes de realizar experimentos con animales. Adultos ratones Swiss Webster que pesan más de 25 g (generalmente más de 8 semanas de edad) se encuentran en grupos de 6 antes de los experimentos. Los tejidos de dos ratones se utilizan para el aislamiento de las neuronas y células gliales entéricas ileales y tres ratones se utilizan paraaislamiento de las células del colon.
2. Prepare el área quirúrgica. Reunir pequeñas tijeras quirúrgicas, pinzas anguladas, hisopos de algodón, tres vasos de vidrio de 200 ml, y una varilla de vidrio / plástico (pincel). Asegúrese que todos los materiales son lavados y enjuagados antes de su uso para minimizar la contaminación de fondo. Este paso puede realizarse el día antes del experimento.
3. Coloque solución de Krebs en hielo y la burbuja con carbógeno (95% de oxígeno, 5% de CO ₂₎ durante al menos 30 minutos para estabilizar el pH.
4. Encienda diversos equipos y los productos químicos calientes para estabilizar a temperaturas deseadas; baño de agua de calor (s) a 37 ° C, centrífuga fresco a 4 ° C, lugar de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y 0,5% de tripsina en baño de agua (37 ° C ). Medios de neuronas completas y enjuague medios de comunicación deben permanecer refrigerados.
5. Colocar 150 ml helada burbujea Krebs en tres vasos de vidrio de 200 ml etiquetados 'sucia', 'limpio', y 'LMMP'. Vaso de burbuja etiqueta 'LMMP' con carbógeno.
6. Tras la aprobación del comité de ética, la eutanasia mouse por dislocación cervical o la asfixia de CO _2.
7. Coloque el ratón en decúbito dorsal en la superficie quirúrgica, la piel limpia con un 70% EtOH, y levantar la piel del abdomen con unas pinzas. Con unas tijeras, la cavidad abdominal abierta y revelar órganos digestivos internos.
8. Retire la longitud del tracto gastrointestinal mediante el levantamiento de una sección de íleon y revelando su mesenterio. Snip través mesenterio con tijeras para quitar suavemente y desentrañar íleon y colon, con cuidado de no tirar de mesenterio del íleon / colon.
9. Después de que se descubrió la longitud completa del intestino grueso, eliminar el íleon cortando a través del intestino distal al estómago y proximal al intestino ciego Nota:. Este procedimiento también se puede realizar con el tejido del colon mediante la eliminación de los dos puntos de distal a la proximal al ciego hasta el ano.
10. Los tejidos se pueden dividir entre colon proximal y distal, y yeyuno, e íleon. El resto de este procedimiento se referirá al aislamiento del íleon; tque procedimiento es el mismo para el aislamiento de LMMP de colon. Coloque todo el íleon en un recipiente de vidrio con helado Krebs marcado "sucio".
11. Crear una herramienta para limpiar el íleon; contundente una gran aguja de calibre 20 con una piedra de archivo y adjuntarlo a una jeringa grande (10 ml) que contiene helado Krebs.
12. Limpiar la materia fecal desde el íleon mediante el seccionamiento del íleon en tres o más piezas de gran tamaño. Eliminar una sección ileal del vaso de precipitados y colocar la aguja roma en el extremo de una pieza ileal.
13. Pase suavemente Krebs a través de la sección de intestino hasta que toda la materia fecal se elimina en un contenedor de residuos por separado. Coloque la sección de limpieza en el recipiente de Krebs marcada "limpia". Repita hasta que se limpie toda íleon.
14. Para quitar el LMMP, corte el íleon en pequeños segmentos, aproximadamente 2-4 cm. Coloque un segmento de íleon en un plástico o varilla de vidrio; íleon debe encajar cómodamente, pero no estar suelto o tenso (~ 2 mm). Comienza la retirada del LMMP suavemente quitando trozos de mesenterio todavía adjuntared en el tracto gastrointestinal (GI) usando un fórceps. Evitar que el tracto GI de girar alrededor de la varilla por el fijar suavemente el tubo para la varilla con el pulgar.
15. Separar la LMMP del músculo circular subyacente; primera frotar suavemente el borde de las pinzas a lo largo de toda la línea donde se conecta el mesenterio, desde la parte superior a la parte inferior del segmento, creando suavemente un vacío en el músculo longitudinal. A continuación, se burlan suavemente el músculo longitudinal con un bastoncillo de algodón humedecido con Krebs.
16. Comience en la parte superior de la brecha en el músculo longitudinal y se burlan de distancia usando el trazo horizontal ligero mientras se aplica una presión muy ligera hasta que el músculo longitudinal empiece a separarse del músculo circular, hacer esto por toda la franja a lo largo del punto de fijación mesenterio.
17. Entonces comienzan suavemente para evitar el tubo gastrointestinal, moviéndose de arriba a abajo y de atrás como el músculo longitudinal se separa lentamente del músculo circular todo el camino alrededor del tubo. Cuando esté completo, elLMMP forma natural desprenderse del resto del tubo digestivo.
18. Coloque la tira fina resultante de músculo longitudinal en el vaso de precipitados con la indicación «LMMP '. Repita este procedimiento para todos los segmentos.
19. Después de todas las franjas de LMMP presentadas proceden de un ratón, repita el procedimiento con los otros ratones que se utilizan. Enjuague los vasos 'sucias' y 'limpio' antes de volver a usarla.
20. Enjuague el LMMP 3x para eliminar la contaminación biológica. Llenar tres 2 ml tubos Eppendorf con helada Krebs. Coloque las tiras LMMP en el primer tubo y girar durante 30 segundos a 356 xg en una centrífuga enfriada a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y mover las tiras a LMMP siguiente tubo lleno de Krebs limpio. Repita este procedimiento para cada tubo restante.

4. Resumen LMMP

1. Preparar la solución de la digestión mediante la colocación de 13 mg de colagenasa de tipo 2 y 3 mg de BSA en 10 ml de solución de Krebs-burbujeó carbógeno.
2. Coloque los segmentos de LMMP enjuagado en solución de digestión y uso LICsores para cortar LMMP en pequeños pedazos.
3. Resumen LMMP durante 60 min a 37 ° C en baño de agua con agitador mientras se burbujeaba suavemente con carbógeno.
4. Después de la digestión es completa, recoger las células por centrifugación durante 8 minutos a 356 xg en centrífuga enfriada a 4 ° C.
5. De aquí en adelante todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo celular! Todos los reactivos y los contenedores deberán ser esterilizados antes de su uso.
6. Durante la centrifugación, preparar una solución de tripsina 0,05% mediante la colocación de 1 ml calentó 0,25% de tripsina y 4 ml de HBSS calentado en un tubo de ml de cultivo celular estéril 50.
7. Después de la centrifugación, extraer y desechar el sobrenadante. No utilice una aspiradora, lo que probablemente va a chupar el pellet celular debido a la baja velocidad de centrifugación. Retire cuidadosamente el sedimento celular y el lugar en el tubo limpio con 5 ml de solución de tripsina 0,05%.
8. Digerir las células en solución de tripsina 0,05% en baño de agua a 37 ° C con agitación durante 7 min. No exceda 7 min del tratamiento total de tripsina o neuronas perecerá.
9. Neutralizar la tripsina con 10 ml de enjuague medios fríos después de 7 min de tratamiento con tripsina.
10. Centrifugar las células durante 8 min a 356 x g. Retire y deseche los medios de comunicación.
11. Durante la centrifugación, equilibrar una sección de malla Nitex esterilizado en la parte superior de un tubo de 15 ml de cultivo celular estéril.
12. Después de la centrifugación, extraer y desechar el sobrenadante. Suavemente mezcla de células se resuspende por trituración en ml de medio de neuronas completos 3. Evitar la generación de burbujas de aire durante esta etapa y todos los pasos futuros en los que se tritura mezcla de células. Todas las trituraciones se debe hacer con mucho cuidado. Filtrar a través de solución de células Nitex de malla limpia en 15 ml de tubo de cultivo de células.
13. Opcional: tubo de cultivo de células de Cap y el lugar en el mezclador de Hula refrigerado (o cualquier mezclador que proporciona una rotación) con el balanceo y la inclinación suave durante 30 min. Este paso es opcional pero recomendado.
14. Opcional: Después de mezclador de Hula, añadir 2 ml de enjuague medios fría para lavar las células.
15. Reunir las células por centrifugación (8 min, 356 xg). Quitar y desechar el sobrenadante.
16. Resuspender las células en los medios de comunicación 1200 neurona completos l. Triturar las células utilizando suavemente 1 ml de plástico punta de la pipeta. No generar burbujas de aire. Pipetear lenta y suavemente hasta que la mayoría de los bloques se dividen y las células se suspenden en líquido.
17. Añadir 750 l de medio completo a cada uno de los 12 pocillos que contenían un cubreobjetos de vidrio pre-recubiertas y añadir 100 ml de la solución de células triturado.
18. Incubar las neuronas en cultivo celular incubadora a 37 ° C con 5% de CO _2.
19. Cambie la mitad de los medios celulares cada 2 días.
20. Las neuronas son listos para las grabaciones electrofisiológicas después de 1 - 2 días en cultivo.

Resultados

Immediately following isolation of LMMP-derived cells, neurons and other cell types will not be readily evident. Living, round cells of indistinct phenotype can be seen as well as tissue detritus from incompletely digested tissue fragments and connective tissue. This flotsam is of no concern and will be largely removed with the first media change in two days. Do not attempt to clean the slides before this as the healthy, viable cells will be removed as well.

After one day in culture, neurons w...

Discusión

Animals Used

This protocol has been optimized for Swiss Webster mice. However, this method is easily adaptable to other small-sized mammals such as rats and to other strains of mice. We have successfully performed preliminary isolations with C57 mice and μ-opioid receptor knock-outs. However, it is also possible that other strains of mice may be problematic due to morphological variations in the GI tract. Furthermore, there are known differences between mouse strains (C57Bl/6 vs. Balb/c) in th...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)	Fisher Scientific	12-545-82
Poly-D-lysine	Sigma	P6407- 5 mg
24-well cell culture plate	CELLTREAT	229124	May use any brand
Laminin	BD Biosciences	354 232
ddH2O			Can prepare in lab
15 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	188261	May use any brand
50 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	227261	May use any brand
NaCl	Fisher BioReagents	BP358-212	MW 58.44
KCl	Fisher BioReagents	BP366-500	MW 74.55
NaH2PO4 .2H2O	Fisher Chemicals	S369-3	MW137.99
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506-500G	MW 120.4
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014-5KG	MW 84.01
glucose	Fisher Chemicals	D16-1	MW 180.16
CaCl22H2O	Sigma Aldrich	C5080-500G	MW 147.02
F12 media	Gibco	11330
Fetal Bovine Serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
Antibiotic/antimycotic 100x liquid	Gibco	15240-062
Neurobasal A media	Gibco	10888
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164
Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Neuromics	PR27022
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101	May use any brand
250 ml Graduated Glass Beaker	Fisher Scientific	FB-100-250	May use any brand
2 L Glass Erlenmyer flask	Fisher Scientific	FB-500-2000	May use any brand
Plastic rod (child's paint brush)	Crayola	05 3516	May use any brand
Carbogen	Airgas	UN 3156	5% CO2
10 ml Leur-lock Syringe	Becton Dickinson	309604	May use any brand
21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle	Becton Dickinson	305167	May use any brand
Collagenase type 2	Worthington	LS004174
Bovine Serum Albumin	American Bioanalytical	AB00440
2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes	Fisher Scientific	13-864-252	May use any brand
Nitrex Mesh 500 µM	Elko Filtering Co	100560	May use any brand
Pipette Set	Fisher Scientific	21-377-328	May use any brand
Sharpeining Stone	Fisher Scientific	NC9681212	May use any brand
Equipment
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)	Nuaire	NU-425-400	May use any brand
10 L Shaking Waterbath	Edvotek	5027	May use any brand
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	5417R	May use a single larger centrifuge with size adapters
Allegra 6 Series Centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
HuluMixer Sample Mixer	Invitrogen	15920D
AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator	Nuiare	NU-4750	May use any brand
Analytical Balance Scale	Mettler Toledo	XS104	May use any brand