Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

Resumo

Nós demonstramos um protocolo de cultura de células para o estudo directo de componentes neuronais e gliais do sistema nervoso entérico. Um neurônio / glia cultura mista em lamelas é preparado a partir do plexo mioentérico de rato adulto fornecendo a capacidade de examinar neurônio individual e função glia por eletrofisiologia, imuno-histoquímica, Etc.

Resumo

O sistema nervoso entérico é uma vasta rede de neurónios e células da glia a todo o comprimento do tracto gastrointestinal que funcionalmente controla a motilidade gastrointestinal. Um procedimento para o isolamento e cultura de uma população mista de neurónios e células da glia do plexo mientérico é descrito. As culturas primárias podem ser mantida durante mais de 7 dias, sendo as ligações entre os neurónios em desenvolvimento e glia. A tira de músculo longitudinal com o plexo mientérico é anexa separada do músculo circular subjacente do cólon ou do íleo do rato e submetidos a digestão enzimática. Em condições estéreis, a população de neurónios e células gliais isolado são conservados no interior do sedimento após centrifugação e semeadas em lamelas. Dentro de 24-48 horas, neuritos ocorre e os neurónios podem ser identificados por meio de marcadores pan-neuronais. Depois de dois dias em cultura, os neurônios disparam potenciais de ação isolados, como observado por estudos patch clamp. Além disso, a glia entérico também podem ser identifIED, pela coloração GFAP. A rede de neurônios e células gliais em estreita aposição forma dentro de 5-7 dias. Neurónios entéricos podem ser individualmente e directamente estudada usando métodos tais como a imuno-histoquímica, electrofisiologia, imagiologia de cálcio, e PCR de uma única célula. Além disso, este procedimento pode ser realizado em animais geneticamente modificados. Esta metodologia é simples de executar e barato. Em geral, este protocolo apresenta os componentes do sistema nervoso entérico de uma forma facilmente manipulada de modo a que podemos descobrir melhor a funcionalidade do ENS em estados normais e de doença.

Introdução

O sistema nervoso entérico (ENS) é vasta rede de nervos e células da glia, que corre todo o comprimento do tracto gastrointestinal (GI). A ENS funcionalmente controla todos os aspectos da digestão, incluindo o peristaltismo, a absorção / secreção fluida, sensação de estímulos, etc (para revisão ver ^1). Contém mais de 500 milhões de neurónios, mais do que o encontrado na medula espinhal, e contém todas as classes neurotransmissor que se encontra no cérebro. Além disso, o ENS é único na medida em que ele pode funcionar por reflexo, sem entrada a partir do sistema nervoso central ^2. Compreender do ENS é crucial não apenas para compreender o seu papel fisiológico normal, mas entender seu envolvimento numa variedade de neuropatias, que podem ser congénita (doença de Hirschsprung), adquirida (Chagas), secundário para os estados de doença (gastroparesia diabética), a droga induzida (síndrome do intestino opióides), ou devido a uma lesão (íleo pós-operatório) ^1. Além disso, os neurónios entéricos pode ser um reservoir para infecções virais (varicela zóster) ^3. Devido às suas semelhanças com o cérebro e os elevados níveis de serotonina no intestino, os medicamentos que visam o tratamento de defeitos do sistema nervoso central, têm frequentemente efeitos secundários indesejáveis ​​sobre o ENS ^2. É também de notar que muitas neuropatias tais como a doença de Alzheimer e doença de Parkinson mostra alterações celulares semelhantes nos neurónios entéricos longos antes da sua aparência em neurónios centrais, tornando-o acessível a ENS um modelo para estudar a patogénese destas doenças ^4. Portanto, uma compreensão completa do ENS é uma necessidade em compreender os estados de doença e prevenir / prever os efeitos secundários farmacológicos.

Os neurónios do ENS terem sido tradicionalmente estudada em cobaias utilizando preparações Wholemount ^5-7 ou culturas de neurónios ^8. Apesar da facilidade com que os neurônios podem ser estudados neste grande animal, este modelo tem muitas limitações, incluindofalta de linhagens geneticamente modificadas, a falta de reagentes específicos para a espécie, eo alto custo associado com ordenação e abrigando esses assuntos. O desenvolvimento de um modelo de sistema nervoso entérico murino tem a vantagem única de várias knock out sistemas, uma vasta gama de outras metodologias estabelecidas que podem ser usados ​​em conjunção com a técnica de cultura de células, e a capacidade de fornecer uma validação para o modelo de cobaia .

O SNE é composta por três plexos que correm o comprimento do tracto gastrointestinal: o exterior do plexo mientérico (entre o músculo longitudinal e circular), que é o principal responsável pelas acções peristálticos do intestino, bem como os plexos submucosa e mucosa, ( encontrado em e dentro da mucosa, respectivamente), que controla em grande parte a absorção de fluido / secreção e a detecção de estímulos ^1. Este método começa com o isolamento do músculo / plexo mientérico (PMLM) preparação longitudinal por raspagemfora a camada exterior do músculo do tracto GI. Isto reduz drasticamente a contaminação problemas que surgem quando a camada mucosa está envolvida no isolamento. Como um resultado, este processo é ideal para o estudo de controlo neuronal da motilidade em vez de acções secretoras do ENS.

O método aqui apresentado resulta numa cultura mista de neurónios entéricos e glia. Pelo menos dois tipos diferentes de neurónios estão presentes, com base em observações anteriores, electrofisiológicos e imunocitoquímica ^9. A presença de células gliais é altamente vantajosa, uma vez que não só são um importante tipo de células a estudar, por direito próprio, mas contribuem para a sobrevivência dos neurónios entéricos ¹⁰ e manter a expressão do receptor nativo na superfície de células neuronais ^11. Além disso, as deficiências da glia entérico pode levar a doenças gastrointestinais, estados anormais de motilidade, cunhados ¹² 'neuro-gliopathies'. Portanto, a cultura ENS aqui apresentados resultados em vários tipos de células que estão maduros para a investigação.

As vantagens desta metodologia são a facilidade de isolamento, os requisitos de ferramentas de baixo custo, e um curto espaço de tempo para dominar a técnica por pessoal de laboratório experientes. Limitações da metodologia incluem o baixo rendimento das células em geral a partir de volumes elevados de tecido ea exclusão de ENS neurônios de plexi da mucosa e submucosa. Este procedimento será altamente vantajosa para os estudiosos especializados em eletrofisiologia, imuno-histoquímica, PCR de uma única célula, e outras metodologias.

Protocolo

Todo cuidado com os animais e os procedimentos experimentais foram de acordo e aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use a Virginia Commonwealth University.

1. Preparação de lamelas de vidro estéreis de poli-D-lisina e laminina revestidos em placas de 24 poços

1. Todos os procedimentos para o passo 1 são realizados em condições estéreis, sob um capuz e com reagentes estéreis. Lamínulas de vidro e água deionizada duplo (DDH ₂ O) devem ser esterilizados com antecedência. Preparação das placas pode ser feita de até duas semanas antes do isolamento do neurónio.
2. Sob o capô, use uma pinça estéril para colocar lamelas de vidro autoclavados em 12 poços de uma placa de 24 poços.
3. Prepare estoque poli-D-lisina antes do tempo. Adicionar 50 ml de ddH2O estéril a 5 mg de poli-D-lisina. Vortex e armazenar em 3 ml alíquotas a -20 ° C. Descongele alíquotas antes do uso.
4. Para uma concentração final de 1 ml de caldo de poli-D-lisina por cada 25 ^cm2: pipeta 80 ulEstoque de poli-D-lisina na parte superior de cada lamela de vidro (2 cm ^2). Vamos solução para resolver 10 min.
5. Remover poli-D-lisina utilizando vácuo e lave com lamelas 3x estéril DDH ₂ O.
6. Permitir que as placas para secar por pelo menos 2 horas sob o capô.
7. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C ou - 20 ° C antes de se proceder ao revestimento da laminina.
8. Prepare estoque laminina antes do tempo. Descongele laminina no gelo e manter em gelo durante o uso. Dilui-se a uma concentração de 50 ug / ml; prestar atenção a concentração do lote; cada lote será diferente. Dependendo da concentração muito, cerca de 20 ml de _ddH2O serão adicionados a cada frasco de laminina. Alíquotas (5 ml) e armazenar a -80 ° C. Descongelar as aliquotas sobre gelo antes da utilização.
9. Lamelas de revestimento com 5 mg / cm ² laminina, pipeta de 200 mL de estoque laminina em cada lamela.
10. Incubar a solução de laminina em lamelas de 1 hora.
11. Aspirar solução laminina restante e lave uma vez com lamelasDDH ₂ O. Evite superfície de lamelas de raspagem.
12. Loja de placas a 4 ° C por até duas semanas.

2. Preparação Prévia do Neuron Isolation Solutions

1. Preparar a solução de Krebs (em mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH ₂ PO _4, 1,2 _MgSO4, 25 _{de NaHCO3,} 11 de glucose, e 2,5 CaCl _2). Lugar 13,79 g NaCl (FW 58.44), 0,686 g KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH ₂ PO ₄ (FW 120), 0,289 g _MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g _{de NaHCO3} (FW 84.01), 3,96 g de glicose (FW 180,2) e 0,555 g de _CaCl2 (FW 111) em 2 L DDH ₂ a 0. Frio a 4 ° C.
2. Prepara enxaguar meios (F12 com soro de bovino fetal a 10% (FBS) e antibiótico / antimicótico a): A uma garrafa de 500 ml de meio F12, adicionar 50 ml de FBS e 5 ml de Antibiótico / antimicótica líquido 100x (Gibco).
3. Prepara entérico meios neurónios (Neurobasal Um media com B-27, 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 10 ng / ml, Glia Neurotr DerivadoFator ophic (GDNF), e Antibiótico / antimicótica líquido 100x). Para fazer estoque GDNF, adicionar 1 ml ddH2O a 10 mg GDNF e congelar volta em 50 mL alíquotas, armazenar a -80 ° C. Para um frasco para injectáveis ​​de suportes completos 50 neurónios, combinar 47,5 ml por meio Neurobasal, 1 ml de B-27 (50x), 500 ul de FBS, 500 ul mM de L-glutamina (Gibco), 50 ul de banco de GDNF, 200 e 500 ul de Antibiótico / Líquido 100x antimicótico. Meios é feita em pequenos lotes de 50 ml para assegurar a sua frescura de GDNF e para evitar a contaminação de grandes quantidades desta mistura de meios de comunicação celular caros.

3. Colheita Longitudinal Muscle / plexo mioentérico (PMLM) Preparação de Ratos

1. Ética nacionais e institucionais apropriadas devem estar no local antes de realizar experimentos com animais. Adultos ratinhos Swiss Webster com um peso superior a 25 g (em geral, ao longo de 8 semanas de idade) são alojados em grupos de 6, antes das experiências. Os tecidos de dois ratos são usados ​​para o isolamento de neurónios entéricos ileal e glia e três ratinhos são usados ​​paraisolamento das células do cólon.
2. Prepare área cirúrgica. Reúna pequenas tesouras cirúrgicas, fórceps angulares, cotonetes, três copos de vidro de 200 ml e um copo de plástico / haste (pincel). Certifique-se de todas as fontes são muito bem lavados e lavados antes de usar para minimizar a contaminação. Esta etapa pode ser realizada um dia antes da experiência.
3. Colocar em solução de Krebs gelada e borbulhas com carbogénio (95% de oxigénio, 5% de CO ₂₎ durante pelo menos 30 minutos para estabilizar o pH.
4. Ligar vários equipamentos e produtos químicos quentes para estabilizar a temperatura desejada; banho de água de calor (s) a 37 ° C, centrífuga legal para solução de 4 ° C, o lugar de Hank salina balanceada (HBSS) e 0,5% de tripsina em banho-maria (37 ° C ). Mídia neurônios completos e enxaguar mídia deve permanecer refrigerado.
5. Coloque 150 ml gelada borbulhava Krebs em três copos de vidro de 200 ml rotulados 'sujo', 'limpo' e 'PMLM. Bolha copo rotulado 'PMLM' com carbogen.
6. Após a aprovação do Comitê de Ética, euthanize mouse por deslocamento cervical ou asfixia CO _2.
7. Coloque o rato em decúbito dorsal sobre a superfície, a pele limpa cirúrgico com etanol 70%, e levantar a pele abdominal usando uma pinça. Com uma tesoura, a cavidade abdominal aberta e revelar órgãos digestivos internos.
8. Remover o comprimento do tracto gastrointestinal, levantando uma secção do íleo e revelando a sua mesentério. Snip através mesentério com uma tesoura para remover suavemente e desvendar o íleo eo cólon, tendo o cuidado para não puxar mesentério do íleo / cólon.
9. Depois de todo o comprimento do intestino é desvendado, remover o íleo, cortando através do intestino distal e proximal do estômago ao ceco Nota:. Este procedimento também pode ser realizada com o tecido do cólon através da remoção do cólon de distal para proximal do ceco para a o ânus.
10. Os tecidos podem ser divididos entre cólon proximal e distal, e jejenum e íleo. O restante deste procedimento irá se referir ao isolamento do íleo; tele é o mesmo procedimento para o isolamento de PMLM cólon. Coloque todo o íleo em um recipiente de vidro com gelo frio Krebs marcado 'sujo'.
11. Criar uma ferramenta para limpar o íleo; contundente uma grande agulha de 20 G com uma pedra de arquivamento e anexá-lo a uma grande seringa (10 ml) contendo gelo frio Krebs.
12. Limpar a matéria fecal a partir do íleo pela secção do íleo em três ou mais peças de grandes dimensões. Remover uma secção do íleo do recipiente e colocar a agulha embotada para a extremidade de um pedaço do íleo.
13. Suavemente executar Krebs a seção do intestino até que toda a matéria fecal é removido em um recipiente separado. Coloque a secção limpa no recipiente de Krebs marcado "limpa". Repita até íleo inteiro é limpo.
14. Para remover o PMLM, cortar o íleo em segmentos pequenos, cerca de 2-4 cm. Coloque um segmento de íleo numa vareta de vidro ou de plástico; íleo deve caber confortavelmente, mas não ser solto ou tenso (~ 2 mm). Comece a remoção do PMLM removendo delicadamente pedaços de mesentério ainda anexared para o tracto gastrointestinal (GI), utilizando um fórceps. Impedir que o tracto GI de rodar em torno da haste, fixando o tubo suavemente para a haste com o polegar.
15. Separa-se a PMLM a partir do músculo circular subjacente; primeiro esfregar suavemente a ponta da pinça segundo a linha inteira onde o mesentério foi ligado, a partir de cima para baixo do segmento, criando uma abertura suavemente no músculo longitudinal. Então provocar suavemente o músculo longitudinal com um cotonete umedecido com Krebs.
16. Comece na parte superior da abertura no músculo longitudinal e provocar distância utilizando o mais leve traço horizontal enquanto que a aplicação de pressão muito leve até ao músculo longitudinal só começa a separar a partir do músculo circular; fazer descer toda a faixa ao longo do ponto de fixação do mesentério.
17. Em seguida, começa a funcionar suavemente em torno do tubo gastrointestinal; movimento de cima para baixo e de trás como o músculo longitudinal é lentamente separada do músculo circular por todo o caminho volta do tubo. Quando concluído, oPMLM virão naturalmente fora o resto do tubo gastrointestinal.
18. Coloque a tira fina resultante do músculo longitudinal no copo marcado 'PMLM. Repetir para todos os segmentos.
19. Depois de todas as faixas de PMLM foram recolhidas a partir de um mouse, repita o procedimento para todos os outros ratos sendo usados. Lave os copos 'sujos' e 'limpo' antes de re-uso.
20. Lavar o PMLM 3x para remover a contaminação biológica. Preencha três 2 ml tubos Eppendorf com gelo frio Krebs. Coloque as tiras PMLM no primeiro tubo e centrifugação durante 30 segundos a 356 xg numa centrifugadora de refrigeração a 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e mover as tiras PMLM para a próxima Krebs tubo cheio limpo. Repita este procedimento para cada um dos tubos restantes.

4. Digest PMLM

1. Preparar a solução de digestão colocando 13 mg de colagenase de tipo 2 e 3 mg de BSA, em 10 ml de solução de Krebs-borbulhar carbogénio.
2. Segmentos lugar do PMLM lavadas em solução de digestão e uso scissores para cortar PMLM em pedaços minúsculos.
3. Digest PMLM durante 60 min a 37 ° C em banho-maria com agitador enquanto era feito borbulhar suavemente com carbogénio.
4. Após a digestão completa é, recolher as células por centrifugação durante 8 min a 356 xg centrifugadora arrefecida até 4 ° C.
5. Deste ponto em diante, todos os procedimentos devem ser feitos em condições estéreis em uma capa de cultura celular! Todos os reagentes e recipientes devem ser esterilizados antes do uso.
6. Durante a centrifugação, preparar uma solução de tripsina 0,05% colocando 1 ml de tripsina a 0,25% aquecida e 4 ml de HBSS aquecida num tubo ml de cultura de células estéril 50.
7. Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Não use um aspirador, o que provavelmente vai sugar o pellet celular, devido à baixa velocidade de centrifugação. Cuidadosamente remover o pelete de células e colocar em tubo limpo com 5 ml de solução de tripsina a 0,05%.
8. Digerir células em solução de tripsina a 0,05%, em banho de água a 37 ° C com agitação durante 7 min. Não exceda 7 min de tratamento de tripsina, total ou neurônios perecerá.
9. Neutralizar a tripsina com 10 ml de frio Enxaguada mídia após 7 min de tratamento tripsina.
10. Centrifugar as células durante 8 minutos a 356 x g. Remova e descarte de mídia.
11. Durante a centrifugação, o equilíbrio de uma secção de malha Nitex esterilizado no topo de um tubo de 15 ml de cultura de células estéril.
12. Após a centrifugação, remover e descartar o sobrenadante. Gentilmente mistura de células ressuspender por trituração em 3 ml de mídia neurônios completos. Evitar a formação de bolhas de ar durante este passo e todos os passos futuros em que mistura de células é triturado. Todas as triturações deve ser feito com muito cuidado. Filtrar a solução da célula através de Nitex de malha no tubo de 15 ml de cultura de células limpo.
13. Opcional: tubo de cultura de células Cap e coloque no misturador Hula refrigerado (ou qualquer mixer que proporciona rotação), com rolamento suave e inclinação para 30 min. Este passo é opcional, mas recomendada.
14. Opcional: Após misturador Hula, adicionar 2 ml a frio Enxaguada media para lavar as células.
15. Recolher as células por centrifugação (8 min, 356 x g). Retire e elimine o sobrenadante.
16. Ressuspender as células em 1200 ul de mídia neurônios completos. Triturar as células suavemente usando 1 ml ponteira de plástico. Não gera bolhas de ar. Pipeta lenta e suavemente até que a maioria dos pedaços são quebrados e as células são suspensas em líquido.
17. Adicionar 750 ul de meio completo para cada um dos 12 poços contendo uma lamela de vidro pré-revestido e adicionar 100 ul da solução de células trituradas.
18. Incubar neurónios em cultura celular incubadora a 37 ° C com 5% de CO _2.
19. Alterar metade dos media celulares a cada dois dias.
20. Os neurônios estão prontos para registros eletrofisiológicos após 1-2 dias em cultura.

Resultados

Imediatamente a seguir ao isolamento de células PMLM derivados, neurónios e outros tipos de células não serão prontamente evidentes. Estar, células redondas de fenótipo indistinta pode ser visto, bem como detritos de tecido a partir de fragmentos de tecido digerido e do tecido conjuntivo. Este destroços é de nenhum interesse e será em grande parte removido com a primeira mudança de media em dois dias. Não tente limpar os slides antes disso, como as células viáveis ​​saudáveis ​​serão removi...

Discussão

Animais usados

Este protocolo foi otimizado para camundongos Swiss Webster. No entanto, este método é facilmente adaptável a outros mamíferos de pequeno porte, tais como ratos, e outras estirpes de ratinhos. Temos realizado com sucesso isolamentos preliminares com C57 e receptores μ-opióide knock-outs. No entanto, também é possível que outras estirpes de ratinhos pode ser problemática devido às variações morfológicas no tracto GI. Além disso, existem diferenças entre as estirpes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses (12 mm diameter)	Fisher Scientific	12-545-82
Poly-D-lysine	Sigma	P6407- 5 mg
24-well cell culture plate	CELLTREAT	229124	May use any brand
Laminin	BD Biosciences	354 232
ddH2O			Can prepare in lab
15 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	188261	May use any brand
50 ml Sterile Centrifuge Tube	Greiner Bio-one	227261	May use any brand
NaCl	Fisher BioReagents	BP358-212	MW 58.44
KCl	Fisher BioReagents	BP366-500	MW 74.55
NaH2PO4 .2H2O	Fisher Chemicals	S369-3	MW137.99
MgSO4	Sigma Aldrich	M7506-500G	MW 120.4
NaHCO3	Sigma Aldrich	S6014-5KG	MW 84.01
glucose	Fisher Chemicals	D16-1	MW 180.16
CaCl22H2O	Sigma Aldrich	C5080-500G	MW 147.02
F12 media	Gibco	11330
Fetal Bovine Serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
Antibiotic/antimycotic 100x liquid	Gibco	15240-062
Neurobasal A media	Gibco	10888
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164
Glial Derived Neurotrophic Factor (GDNF)	Neuromics	PR27022
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101	May use any brand
250 ml Graduated Glass Beaker	Fisher Scientific	FB-100-250	May use any brand
2 L Glass Erlenmyer flask	Fisher Scientific	FB-500-2000	May use any brand
Plastic rod (child's paint brush)	Crayola	05 3516	May use any brand
Carbogen	Airgas	UN 3156	5% CO2
10 ml Leur-lock Syringe	Becton Dickinson	309604	May use any brand
21 G x 1 1/2 in. Hypodermic Needle	Becton Dickinson	305167	May use any brand
Collagenase type 2	Worthington	LS004174
Bovine Serum Albumin	American Bioanalytical	AB00440
2 ml Microcentrifuge Eppendorf tubes	Fisher Scientific	13-864-252	May use any brand
Nitrex Mesh 500 µM	Elko Filtering Co	100560	May use any brand
Pipette Set	Fisher Scientific	21-377-328	May use any brand
Sharpeining Stone	Fisher Scientific	NC9681212	May use any brand
Equipment
LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cell culture hood)	Nuaire	NU-425-400	May use any brand
10 L Shaking Waterbath	Edvotek	5027	May use any brand
Microcentrifuge 5417R	Eppendorf	5417R	May use a single larger centrifuge with size adapters
Allegra 6 Series Centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
HuluMixer Sample Mixer	Invitrogen	15920D
AutoFlow Water Jacket CO2 Incubator	Nuiare	NU-4750	May use any brand
Analytical Balance Scale	Mettler Toledo	XS104	May use any brand