אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית ​​השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

Daniel P. Vang; Gregory T. Wurz; Stephen M. Griffey; Chiao-Jung Kao; Audrey M. Gutierrez; Gregory K. Hanson; Michael Wolf; Michael W. DeGregorio

doi:10.3791/50868

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Method Article

אינדוקציה של קרצינומה של תאי מעבר שלפוחית השתן פולשנית בMUC1 עכברים הטרנסגניים חיסוניים אנושיים שלמים: מודל לפיתוח חיסוני

DOI:

10.3791/50868

⸱

October 30th, 2013

Daniel P. Vang¹, Gregory T. Wurz¹, Stephen M. Griffey², Chiao-Jung Kao¹, Audrey M. Gutierrez¹, Gregory K. Hanson¹, Michael Wolf³, Michael W. DeGregorio¹

¹Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, ²Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, ³Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Summary

N-בוטיל-N-(4-hydroxybutyl) ניטרוזמין-Induced מודל סרטן שלפוחית השתן פותח בmucin האנושי 1 (MUC1) עכברים מהונדסים לצורך בדיקות MUC1 מכוון החיסוני. לאחר מתן חיסון פפטיד MUC1 ממוקד, תגובת הלימפוציטים T ציטוטוקסי לMUC1 אושרה על ידי רמות ציטוקינים בסרום ופעילות תאי T ספציפית מדידה.

Abstract

מודל קליני של סרטן שלפוחית השתן פולשנית פותח בmucin האנושי 1 (MUC1) מהונדסים (MUC1.Tg) עכברים לצורך ההערכה חיסוני ו / או כימותרפיה רעילה לתאים. כדי לגרום לסרטן שלפוחית השתן, עכברי C57BL / 6 (סוג MUC1.Tg ופראי) טופלו דרך הפה עם N-בוטיל-N-(4-hydroxybutyl) ניטרוזמין קרצינוגן (OH-BBN) על 3.0 מ"ג / יום, 5 ימים / שבוע במשך 12 שבועות. כדי להעריך את ההשפעות של OH-BBN על פרופיל של ציטוקינים בסרום במהלך התפתחות גידול, כולה דם נאסף באמצעות מדמם submandibular לפני טיפול ואחת לארבעה שבועות. בנוסף, חיסון פפטיד MUC1 ממוקד ופלצבו ניתנו לקבוצות של עכברים לשבוע במשך שמונה שבועות. immunoanalyses microbead fluorometric זמנית של ציטוקינים בדם במהלך התפתחות וגידול החיסון הבא בוצעו. בסיום, אינטרפרון גאמא (IFN-γ) / אינטרלויקין 4 (IL-4) ניתוח ELISPOT לתגובת MUC1 ספציפי T-תא חיסון והערכות histopathological של סוג הגידולוכיתה בוצעה. התוצאות הראו כי: (1) את השכיחות של סרטן שלפוחית השתן בעכברים מסוג שניהם MUC1.Tg ופראיים הייתה 67%, (2) קרצינומה של תאי מעבר (TCC) שפותחה בביחס של 2:1 בהשוואה לקרצינומה של תאי קשקש (SCC) (3) ציטוקינים דלקתיים מוגבר עם זמן במהלך התפתחות גידולים, וכן (4) מתן החיסון גורם לפפטיד פרופיל ציטוקינים סרום Th1-מקוטב ותגובת תא T MUC1 ספציפית. כל הגידולים בעכברי MUC1.Tg היו חיוביים לMUC1 ביטוי, ומחצית מכל הגידולים בעכברים מסוג MUC1.Tg ופראיים היו פולשני. לסיכום, שימוש בגישה צוות באמצעות התיאום של מאמציהם של רוקחים, אימונולוגים, פתולוגים, ביולוגים מולקולריים, פיתחנו מודל עכבר מהונדס חיסונית שלם של סרטן שלפוחית השתן המבטא hMUC1.

Introduction

סרטן שלפוחית השתן הוא הצורה הנפוצה ביותר של הסרטן הרביעית ושמיני גורם מוביל למוות מהסרטן בגברים אמריקאים. בארצות הברית, כ 72,500 מקרים חדשים ו -15,000 מקרי מוות מסרטן שלפוחית השתן צפויים בקרב גברים ונשים גם יחד בשנת 2013 ^1. השכיחות של סרטן שלפוחית השתן היא כשלוש פעמים כגבוהות אצל גברים בהשוואה לנשים. בארצות הברית, קרצינומה של תאי מעבר (TCC) הדין וחשבון על יותר מ -90% מהמקרים, בעוד קרצינומה של תאי קשקש (SCC) יש שכיחות של פחות מ -2% ^2. שיעור ההישרדות היחסי ל -5 השנים הכולל לTCC פפילרי הוא 91.5% לעומת רק 30.9% עבור SCC ^2. למרות TCCs papillary פולשנית מהווה כ 75% מהמקרים בזמן אבחנה, אפילו עם טיפול יותר מ -50% מהחולים חווים הישנות בתוך 5 שנים, עם עד 30% מהחולים הללו התקדמות למחלה פולשנית שריר ^3,4 . משטרי טיפול אופייניים עבור inv הלא שרירהמחלה asive כוללת כריתה (טור) ואחריו כימותרפיה שלפוחית. בחולים עם טא בדרגה גבוהה או גידולי T1, TUR חוזר עשויה להתבצע לפני טיפול כימותרפי ^3,4. עבור אותם חולים עם הישנויות Ta בדרגה נמוכה או בדרגה גבוהה Ta או נגעי T1, TUR ואחריו כימותרפיה adjuvant או טיפול חיסוני בצורה של Bacillus Calmette-גרן (BCG) עשוי לשמש ^3,4. שלפוחית BCG הוכח להיות עדיף על C mitomycin שלפוחית ביחס לזמן עד להשנות ^5. למחלה פולשנית שריר T2, כריתת שלפוחית עם או בלי neoadjuvant כימותרפיה היא כמובן המומלץ של טיפול ^3. בחולים עם SCC, כריתת שלפוחית נראית כטיפול היעיל ביותר ^6. בהתחשב בשיעורים הגבוהים מאוד של הישנות למרות הטיפולים הטובים ביותר הקיימים, יש בבירור צורך בטיפולים חדשים, יעילים יותר לסרטן שלפוחית השתן.

הרחבת immunotherapies החדש לbladdסרטן ER הוא גישה אפשרית אחת שעשוי לקיים הבטחה להארכת הישרדות ללא מחלה. מבחינה היסטורית, BCG כבר החיסוני היעילה רק לסרטן שלפוחית השתן. מנגנון פעולה שלה הוא חשב לערב אינדוקציה ספציפי של תגובה חיסונית מסוג T-helper 1 (Th1) באמצעות הגדלת רמות של אינטרלויקין -2 (IL-2) ואינטרפרון גאמא (IFN-γ) ^4. נייד, או Th1 חסינות, היא קריטי בטיפול חיסוני סרטן כלחות, או Th2, חסינות מעולם לא הוכח כיעיל נגד גידולים מוצקים, למעט של נוגדנים המכוונים נגד קולטני גורמי גדילה ^7. בניסיון לשפר את היתרונות של טיפול יחיד BCG, אימונותרפיה שילוב 2B/BCG IFN-α הוערכה בניסוי שלב II בתרופה עם תוצאות חד משמעיות ^8. גישה חלופית לטיפול חיסוני לסרטן שלפוחית השתן עשויה להיות למקד אנטיגנים הקשורים גידולים (תעש), זיהוי שנעשה חיסוני סרטן ספציפיים יותר ⁷ .

TAA אחד כזה הוא mucin 1 (MUC1), שהוא גליקופרוטאין פני תא ביטוי יתר בסרטן רבים תאי אפיתל, כגון שלפוחית השתן, סרטן שד, סרטן ריאות, סרטן הלבלב ^ו9,10. הביטוי והשינוי של MUC1 גם שינו באופן משמעותי במהלך היווצרות הסרטן, underglycosylation כזה שחושף את הרצפים של חומצות אמינו אנטיגני המכונים מספר משתנה של חזרות טנדם (VNTR) על ליבת פפטיד. בעוד MUC1 הוא מולקולה עצמית, אזורי VNTR immunodominant אלה בדרך כלל לא נחשפו בשל glycosylation הנרחבת, וכך הם נתפסים על ידי המערכת החיסונית ^כ11,12 זר. ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (הרג) כי דווקא מכיר MUC1 epitopes היה מבודד מבלוטות הלימפה הניקוז-גידול של חולות סרטן שד ^13, כמו גם את הדם ומח עצם של חולי מיאלומה ^14,15, מה שהופך MUC1 יעד פוטנציאלי עבור תגובה חיסונית תאית. את VNTRs immunodominant של underglycosylateהטופס של ד MUC1 מוכר על ידי הרג, וכתוצאה מכך להרס של תאים סרטניים ^16-19. תגובה חיסונית תאית ו / או הלחות יליד MUC1 הסרטנית, לעומת זאת, אינה חזקה מספיק כדי לחסל גידולים. כדי להגדיל את התגובה החיסונית החלשה שכבר קיימת לMUC1, יכולים להיות הציגו פפטידים סינטטיים immunodominant באמצעות חיסון ליצור תגובת CTL חזק מספיק כדי להיות של תועלת קלינית ^18,20. חיסון liposomal MUC1 כבר הוכח להגדיל את ההישרדות בחולי סרטן ריאות ^21,22, ליצור הרג מסוגל להרוג תאים סרטניים MUC1 חיוביים, ולייצר תגובת ציטוקינים Th1-מקוטבת ^23,24. עם רמה גבוהה של MUC1 ביטוי ^9,11,25, סרטן שלפוחית השתן הוא מועמד הגיוני לבדיקת MUC1 מכוונת אימונותרפיה ^26,27. יתר על כן, יש לו פוטנציאל MUC1 כגורם מנבא בשלפוחית שתן הסרטן ^28, MUC1 ביטוי בTCC קשור באופן משמעותי עם במה וכיתה, והגרורה TCCהוכח ממשיך להביע MUC1 ^29.

על מנת להעריך את התועלת הפוטנציאלית של טיפול חיסוני MUC1 מכוון בסרטן שלפוחית השתן, פיתחנו MUC1 חיסונית אנושי שלם (hMUC1) להביע מודל של סרטן שלפוחית השתן מהונדס congenic (MUC1.Tg) עכבר על רקע C57BL / 6 ^30. MUC1 האנושי מתבטא כחלבון עצמי תחת השליטה של האמרגן שלה, וכתוצאה מדפוס ביטוי רקמה בקנה אחד עם זה שנצפה בבני האדם ^30,31. העכברים היו מושרה עם הסרטן הידוע שלפוחית N-בוטיל-N-(4-hydroxybutyl) ניטרוזמין (OH-BBN) ^32, ולאחר מכן את הגידולים כתוצאה הוערכו על hMUC1 ביטוי וסוג ודרגת גידול. כדי להעריך את ההשפעה של החומר מהסרטן בTh1/Th2 רמות ציטוקינים במהלך התפתחות גידול, דגימות סרום שנאספו מעת לעת לצורך הניתוח זמנית. עכברים לאחר מכן טופלו בחיסון פפטיד MUC1 ממוקד, וציטוקינים בסרום ותגובות חיסוניות היו מסגרת הערכהטד על ידי immunoassay microbead fluorometric זמנית וELISPOT.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים והניסויים שנערכו תחת פרוטוקול שאושר על ידי אוניברסיטת קליפורניה, טיפול בבעלי חיים מוסדיים דייויס והשתמש הוועדה מייעצת מנהלית.

1. רביית MUC1.Tg מאוס ורבייה

התכנית לביולוגית UC Davis העכבר (MBP) עכברי גזעים פראיים סוג C57BL / 6 גברים עם הטרוזיגוטיים MUC1.Tg C57BL / 6 נקבות עכברים להקמת מושבת הרבייה שלנו. צאצאי MUC1.Tg מועברים ללימודים כנדרשים.
אנשי MBP קליפ הבהונות של הצאצאים בתבנית מוגדרת (0-99) לזיהוי עכבר, וכשישים קליפ הזנב. הבוהן או רקמת זנב מעובד לgenotyping באמצעות מיצוי DNA סטנדרטי ותגובת שרשרת פולימרז (PCR) ניתוח.

2. עיצוב מחקר

ללמוד משימות קבוצתיות
1. לשקול כל עכבר בנפרד על איזון ולהקליט במשקל גרם לכל עכבר.
2. חלק זה של הליך involves המתודולוגיה והעיצוב של המחקר. לחלק הראשון של המחקר, להקצות עכברי סוג MUC1.Tg ופרועים גיל בהתאמה להתחיל אינדוקציה סרטן שלפוחית השתן עם OH-BBN. להרדים עכברים 8 שבועות לאחר מנת OH-BBN האחרון כדי לאשר הנוכחות של גידולים בשלפוחית שתן על ידי היסטולוגיה.
3. לחלק השני של המחקר, עכברי האקראי MUC1.Tg גברים למספר המתאים של טיפול וקבוצות ביקורת. עכברים אלו יהיו במעקב לציטוקינים בסרום ותגובות חיסוניות T-cell במהלך אינדוקציה והתפתחות גידול, ולאחר מכן בסיומו של המחקר 8 שבועות לאחר מנת OH-BBN שעבר.
אינדוקציה סרטן שלפוחית השתן
1. OH-BBN הוא חומר מסרטן ורעיל ביותר. אנא קרא ופעל בהתאם להנחיות בטיחות חומר גיליון נתונים בעת טיפול ואחסון של כימיקל זה.
2. חשב את ריכוז תמיסת המינון הדרוש כדי לספק את המינון המתאים (3 מ"ג), בהיקף של 100 μl, לכל עכבר מבוסס על המשקולות וnumbe ממוצעr של עכברים בכל מחקר וקבוצה.
3. לדלל את OH-BBN ב100% אתנול. תביא את הריכוז הסופי עד 30 מ"ג / מ"ל עם מים סטריליים. אתנול הסופי: ריכוז מים צריך להיות 20:80, V / נ
4. לנהל את הפה OH-BBN באמצעות נירוסטה, 20 מחטי gavage גרם ביום, 5 ימים / שבוע למשך 12 שבועות, המבוססת על משימת קבוצת הטיפול מתחילה בגיל 8 שבועות.
טיפולי חיסון
1. מחדש כל בקבוקון של חיסון פפטיד lyophilized ב600 μl של 0.9% סליין סטרילי וביסודיות על ידי ציור resuspend הפתרון באמצעות 0.5 אינץ 27 G מחט 6x. שימוש בתמיסת מלח, להתאים את הריכוז, כך שהמינון הרצוי מועבר בנפח של 100 μl.
2. החל מהשבוע 20, לאחר המנה האחרונה של OH-BBN, לנהל את החיסון על בסיס שבועי למחזור על ידי הזרקה תת עורית של 100 μl באמצעות מחט 25 G (מספר השבוע המתאים לגיל של העכברים) שמונה שבועות.
ניטור ואוסף דוגמאות
1. לשקול את כל העכברים ולמשש לנוכחותם של גידולים חדשים פעם אחת בכל שבוע. להרדים את כל עכברים שאיבדו ≥ 20% ממשקל גופו, או אם יש גידולים מוחשיים, דם בשתן ו / או אצירת שתן.
2. לאחר מכן לפני מנת OH-BBN הראשון ולאחר מכן במרווחים של 4 שבועות, לאסוף את כל דם דרך מדמם submandibular. לאסוף את הדם בצינורות קרישת דם (BD Microtainer), ולאפשר 30 דקות לדם להיקרש.
3. צנטריפוגה דגימות הדם בmicrocentrifuge ב 3500 XG במשך 10 דקות. להעביר את הסרום לדפוק cryotubes כובע בעזרת פיפטה בזהירות.
4. הקפאת פלאש בחנקן הנוזלי, ולאחסן ב -80 ° C עד לניתוח נוסף על ידי זמנית.
5. שמונה שבועות לאחר המנה האחרונה של OH-BBN, להרדים את כל העכברים בחנק CO _2.
6. מניחים כל עכבר על קרש חיתוך ולהצמיד על ידי כל ארבעת הגפיים.
7. בעזרת מלקחיים ומספריים, MAKe חתך אופקי באזור הבטן העליון. הכנס את המספריים לתוך החתך בין שכבת האפידרמיס ודופן בטן ובעדינות להפריד את העור מהרקמה הבסיסית בעזרת מלקחיים.
8. ביצוע חתך אנכי מהחתך האופקי בעקבות ציר האמצע לכיוון הקצה הקדמי של העכבר. להפריד את העור מכלוב הצלעות, ובאמצעות מזרק 1 מ"ל ו22 G מחט, לנקב את הלב ולאסוף דם עם תיקו חלק ויציב.
9. עיין בשלב 2.4.3 ו2.4.4 לבידוד ואחסון בסרום.
10. בעזרת מלקחיים ומספריים, לגזור ולקלף את שאר שכבת האפידרמיס. לחתוך את הקיר והצפק בבטן וסביבה נקי מחיידקים להסיר גידול שלפוחית השתן לאימונוהיסטוכימיה (IHC) וכתם מערבי.
11. לאסוף טחול לניתוח כדאיות תא (מוזה) וELISPOT. לIHC, דגימת מקום שלפוחית השתן גידול בקלטת ולתקן רקמות בלילה פורמלין צונן בטמפרטורת חדר.
12. למחרת, להחליף פורמלין עם 70% אתנול.
13. לניתוח כתם המערבי של גידול, homogenize הגידול, להוסיף למאגר מיצוי חלבון בתוספת מעכבי פרוטאז לעצור ולהעביר ל1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל.
14. וורטקס במשך 30-60 שניות והחזק על קרח למשך 5 דקות. פלאש להקפיא בחנקן נוזלי והפשרה במי הסביבה. חזור על התהליך של vortexing, הקפאה והפשרת פעמיים.
15. צנטריפוגה הדגימות ב10,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את התמציות הסלולריות לצינורות שכותרתו חדשים.
16. לכמת את הריכוז על ידי ביצוע assay חלבון חומצת Bicinchoninic (BCA) למדידות חלבון. דגימות חנות ב -80 ° C עד מוכנות לניתוח כתם מערבי.

3. ביולוגיה / מערבי מולקולרית

ההליכים הבאים בוצעו כדי לאמת את הביטוי של MUC1 ברקמת גידול בשלפוחית השתן באמצעות עכבר סטנדרטי כתם מערבי פרוטוקול (הנתונים לא מראיםn).

הפרד את תמציות חלבונים על ידי ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide (-SDS) ולאחר מכן להעביר על גבי קרום PVDF באמצעות מנגנון semidry.
לחסום את קרום החלבון הועבר עם חלב ללא שומן 5% ב0.1% Tween-20 בופר פוספט (PBS-T) pH 7.4 לשעה 1 בייקר מסלולית בטמפרטורת חדר.
דגירה הממברנה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר על שייקר עם נוגדן אנטי MUC1 או אנטי β-אקטין ב0.1% PBS-T.
שטוף את הקרום, באמצעות אחסון הפתרון והוסיף 0.1% PBS-T. מערבולת הקרום שבייקר למשך 5 דקות ולמזוג. חזור על פעולה זו פעמיים.
דגירה הממברנה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר עם צנון סוס peroxidase (HRP) נוגדנים משני מצומדות.
לשטוף 3x (עיין בשלב 3.4).
לעקוב אחר הפרוטוקול לערכה המשופרת Chemiluminesence (ECL) כדי להפעיל ולקרוא fluorography.

4. Immunoassay Microbead fluorometric זמנית

התקנה וחישובים
1. באמצעות מפת צלחת 96 היטב, להקצות כדורי סרק, תקנים, בקרות ונעלמת לבארות. לחשב את המספר והנפח של analytes, ללכוד נוגדנים וstreptavidin-phycoerythrin (SA-PE) נחוץ לassay.
2. לאפשר לכל מאגרי החומר המדלל כדי לאזן לטמפרטורת חדר. הכן את הסטנדרטים ודילולים באמצעות מדגם 96 גם צלחת ריקה.
3. לשקם את מטריצת הסרום והסטנדרטי lyophilized פי הפרוטוקול של היצרן ולעשות דילולים סדרו 1:5 של התקן עם המדלל המתאים בצלחת 96 היטב. לבארות הריקות, להשתמש במדלל המתאים.
4. לדלל את כל הבקרות ודגימות ידועות 01:02 במדלל המתאים בשאר 96 גם הצלחת.
5. לתמהיל חרוז, פיפטה הנפח הנדרש diluent המתאים לתוך צינור 15 מ"ל. מערבולת כל בקבוקון חרוז במשך 20 שניות ופיפטה הנפח הנדרש של כל אנליטי לתוך שפופרת 15 מ"ל.
6. תמיד להגן על חרוזים מאור, כדי למנוע photobleaching. אין למקם את הצלחת 96 היטב בחומר סופג כדי למנוע אובדן של מדגם דרך הפתילה.
Assay פרוטוקול
1. Prewet הצלחת התחתונה 96, גם המסנן עם 200 μl של הצפת Assay ולאפשר להשריית של המסנן מלא. לנקז בעדינות באמצעות מנגנון ואקום 96 גם הצלחת וכתם יבש תחתית הצלחת עם מגבת נייר.
2. באמצעות פיפטה רבה, פיפטה μl 25 של מטריצת סרום לבארות שמוקצות לחללים ואת הסטנדרטים וμl פיפטה 25 של הצפת Assay לבארות שהוקצו לבקרות ונעלמת.
3. פיפטה μl 25 של ריק, תקנים, בקרות, ונעלם לבארות שהוקצו בהתאמה. מערבולת תמהיל חרוז במשך 20 שניות ולהעביר את החרוזים למאגר.
4. פיפטה μl 25 של תמהיל חרוז לכל אחד. מכסה את הצלחת בנייר אלומיניום או מכסה צלחת אטום כדי להגן מפני אור.
5. הכן את פתרון הנוגדן ללכוד. פיפטה את הכמות הנדרשת של 0.1% PBS-T וללכוד נוגדן לתוך צינור 15 מ"ל ומערבולת עבור 10 שניות. העבר את תערובת הנוגדן ללכוד למאגר וμl פיפטה 25 לכל אחד.
6. לנער את הצלחת ב 500 סל"ד במשך שעה אחת בטמפרטורת חדר על שייקר צלחת. מסננים ולשטוף את הצלחת עם 200 μl של 0.1% PBS-T פעמיים. מסננים וכתם יבש.
7. הכן את פתרון SA-PE. פיפטה הנפח הנדרש של 0.1% PBS-T ו SA-PE לתוך צינור 15 מ"ל ומערבולת עבור 10 שניות. מעבירים את הפתרון למאגר וμl פיפטה 25 לכל אחד.
8. לנער את הצלחת ב 500 סל"ד במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר צלחת. מסננים ולשטוף את הצלחת עם 200 μl של 0.1% PBS-T פעמיים. ניקוז ו-Bהרבה יבש.
9. פיפטה μl 100 של 0.1% PBS-T ולנער על שייקר בצלחת 500 סל"ד במשך לפחות שתי דקות לresuspend את החרוזים. לקרוא ולנתח את הצלחת על המכונה Lx200 Luminex.

5. הכנת IFN-γ/IL-4 ELISPOT וניתוח

בארון בטיחות ביולוגי, לעבד את הטחולים דרך רקמות ניילון 100 מיקרומטר נפות לפוספט סטרילי 5 מ"ל נאגר מלוח (PBS) בצלחות פטרי סטרילית. שכבה על גבי splenocytes 3 מ"ל של מדיום הפרדת הלימפוציטים בצינורות 15 מ"ל סטריליים.
צנטריפוגה הצינורות ב 600 XG במשך 15 דקות כדי להפריד את הלימפוציטים מתאי הדם האדומים. העבר את הלימפוציטים מרובד מעל השיפוע לצינורות 15 מ"ל סטריליים חדשים.
התאם את עוצמת הקול עד 10 מ"ל עם PBS סטרילית. צנטריפוגה ההשעיה ב 600 XG במשך 10 דקות לגלולת התאים.
לשאוב supernatant ו resuspend התאים ב1 מ"ל של PBS לכדאיויות תא ולספור עם המוזהמנתח. בצע ספירת המוזה ופרוטוקול ערכה ליכולת הקיום.
הפוך דילולים סדרתי של לימפוציטים בצינורות 1.5 מ"ל בורג כובע צנטריפוגה בגורמי דילול של 1:10, 1:20, 1:40 ו( או לפי צורך) ברוזן ומגיב ליכולת הקיום (סה"כ μl מינימום נפח 300). פיפטה דילול כל מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב ולנתח במוזה.
הכן צלחת מפה של הדגימות והתנאים לצלחת ELISPOT. הכן צלחת ELISPOT פי הפרוטוקול של היצרן וμl פיפטה 100 של מדיום, פפטיד (10 מיקרוגרם / מ"ל), או הפפטיד (10 מיקרוגרם / מ"ל) היטב כל אחד לטרוף.
פיפטה μl 100 של השעיה תא, ומספק 1.0 x 10 ⁶ תאים לכל היטב דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
עקוב הפרוטוקול של היצרן עבור assay ELISPOT. לנתח את צלחת ELISPOT פותחה באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה.
לכמת את התוצאות על ידי ספירת מספר הנקודות צבעוניות corresponding לכל אנליטי בכל טוב. את הנקודות מתאימות למספר ספוט יוצרי התאים (SFC) בכל טוב.

6. אימונוהיסטוכימיה (IHC) ומכתים Hematoxylin & eosin (H & E)

קח את רקמת שלפוחית השתן גידול השתמרה כפי שתואר לעיל (סעיף 2.4.11), להטביע בפרפין וצעד בסעיף 4 מיקרומטר לניתוח immunohistochemical.
בצע IHC באמצעות נוגדן MUC1 שמכיר את האזור חוזר של טנדם MUC1. השתמש peroxidase ערכת המחקר בבעלי החיים כדי למזער את תגובתיות של נוגדני העכבר המשני עם אימונוגלובולינים אנדוגני נוכחים ברקמות.
לבצע צביעת H & E באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

7. שיטות סטטיסטיים

לImmunoassay Microbead fluorometric Multiplex, השתמש במבחן t של סטודנט שני זנב להשוות הממוצע נצפה ריכוזים ציטוקינים בסרום בין הטיפול וקבוצות ביקורת. לELISPOT, השתמש באחד wאיי ANOVA להשוות את המקום ויוצר מושבות בין שלט מדיה, מקושקשת וקבוצות פפטיד פפטיד. השתמש במבחן ההשוואה מרובה של Dunnett כדי להפחית את הסיכוי לתוצאה חיובית כוזבת. P-ערך של 0.05 ≤ נחשב שונה באופן משמעותי לכל הניתוח.

תוצאות

ההערכה קלינית של השפעת immunotherapies רומן ושילובים בסרטן שלפוחית השתן מחייבת הפיתוח של מודל חיה מתאים. במודל העכבר המהונדס שלנו, אינדוקציה עם החומר מהסרטן הכימי OH-BBN הביאה לשיעור גבוה של מקרי סרטן שלפוחית השתן של TCC בעיקר עם כמה SCC, שהוא דומה לסרטן שלפוחית השתן בבנ...

Discussion

האינדוקציה המוצלחת של קרצינומה של תאי מעבר בשלפוחית השתן וקשקש פולשני בעכברי MUC1.Tg אדם מציעה מודל קליני לפיתוח חיסוני. מחקרי immunotherapeutic דורשים שימוש במודל ספונטני, ללא פגע חיסונית על מנת להעריך את התגובה הדלקתית להתקדמות גידול לאורך זמן, כמו גם את התגובה החיסונית ל?...

Disclosures

DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, ומשרד GKH מצהירים שום אינטרסים מתחרים. MWD הוא החוקר הראשי של מענק שהתקבל מחברת Merck KGaA, וMW הנו עובד של חברת Merck KGaA.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לתכנית לביולוגית עכבר דייוויס UC לרבייה של העכברים. מחקר זה מומן על ידי מענק מהחברה Merck KGaA, דרמשטט, גרמניה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)	TCI America	B0938
20 G Gavage Needles	Popper Sons, Inc.	7921	Stainless steel
Peptide Vaccine	N/A	N/A	investigational agent
BD Microtainers	BD	365957
Tissue Cassettes	Simport	M490-12
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Lysis Buffer	Pierce	87787
Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail	Thermo Scientific	78444
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225
Mouse Cytokine 20plex Kit	Invitrogen	LMC006
Magnetic Microsphere Beads	Luminex	MC100xx-01	xx is the bead region
Anti-mouse TNF- Capture Antibody	BD Pharmingen	551225
Anti-mouse TNF- Detection Antibody	BD Pharmingen	554415
Anti-mouse IFN- Capture Antibody	Abcam	ab10742
Anti-mouse IFN- Detection Antibody	Abcam	ab83136
PBS, pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK
Tween-20	Fisher	BP337-500
Assay Buffer	Millipore	L-MAB
Cytokine Standard	Millipore	MXM8070
Multi-screen HTS 96well filter plates	Millipore	MSBVN1210
SA-PE	Invitrogen	SA10044
100 m Nylon Tissue Sieves	BD	352360
Splenocyte Separation Media	Lonza	17-829E
TNF- /IL-4 ELISpot plates	R&D Systems	ELD5217
Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody	Epitomics	2900-1
Goat Anti-actin monoclonal antibody	Sigma	A1978
Anti-rabbit HRP antibody	Promega	W401B
Goat anti-mouse HRP antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-2005
PVDF membrane	BioRad	162-0174
Mini Protean TGX Precast Gels	BioRad	456-1083
Muse Count & Viability Kit	Millipore	MCH100104
MUC1 Antibody	BD Pharmingen	550486	IHC antibody
Animal Research Peroxidase Kit	Dako	K3954	IHC staining
Equipment and Software
Millipore plate vaccum apparatus	Millipore	MSVMHTS00
Luminex Lx200	Millipore / Luminex	40-013	Manufactured by Luminex, distributed by Millipore
Luminex Xponent Software	Millipore / Luminex	N/A	Version 3.1; included with Luminex Lx200
Milliple Analyst Software	Milliplex / VigeneTech	40-086	Version 5.1
Muse Cell Analyzer	Millipore	0500-3115
Muse Software	Millipore	N/A	Version 1.1.0.0; included with Analyzer
Dissecting Microscope	Unitron	Z730
Graphpad Prism Software	Graphpad Software Inc.	N/A	Version 5.1
Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus	BioRad	165-8001
Trans Blot SD Cell and PowerPac	BioRad	170-3849

References

Siegel, R., Naishadham, D., et al. . CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
Lynch, C. F., Davila, J. A., Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. , 07-6215 (2007).
Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

80 C57BL 6 MUC1 Preclinical

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: