Induction du envahissantes Transitional cancer de la vessie cellulaire dans immunitaire humain MUC1 souris transgéniques intactes: un modèle pour le développement d'immunothérapie

Résumé

Une N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine induite modèle de cancer de la vessie a été développé en mucine humaine 1 (MUC1) de souris transgéniques à des fins de test MUC1-dirigé l'immunothérapie. Après l'administration d'un vaccin peptidique MUC1 ciblée, une réponse des lymphocytes T cytotoxiques pour MUC1 a été confirmée par la mesure des niveaux de cytokines plasmatiques et de l'activité cellulaire T spécifique.

Résumé

Un modèle préclinique de cancer invasif de la vessie a été développé en mucine humaine 1 (MUC1) (MUC1.Tg) de souris transgéniques à des fins d'évaluation de l'immunothérapie et / ou la chimiothérapie cytotoxique. Pour induire un cancer de la vessie, C57BL / 6 (type MUC1.Tg et sauvages) ont été traités par voie orale avec l'agent cancérigène N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) à 3,0 mg / jour, 5 jours / semaine pendant 12 semaines. Pour évaluer les effets de OH-BBN sur le profil des cytokines sériques au cours du développement tumoral, le sang total ont été recueillis par des saignements sous-maxillaires avant le traitement et toutes les quatre semaines. En outre, un vaccin contre le peptide MUC1 ciblée et un placebo ont été administrés à des groupes de souris par semaine pendant huit semaines. Multiplex fluorimétriques immunoanalyses de microbilles de cytokines sériques au cours du développement tumoral et après la vaccination ont été réalisées. A la fin, l'interféron gamma (IFN-γ) / interleukine-4 analyse (IL-4) ELISpot pour MUC1 réponse immunitaire des cellules T spécifiques et des évaluations histopathologiques de type de tumeuret la qualité ont été réalisées. Les résultats montrent que: (1) l'incidence du cancer de la vessie chez les souris de type sauvage et les deux MUC1.Tg était de 67%, (2) les carcinomes à cellules transitionnelles (TCC) développés à un ratio de 2:1 par rapport aux carcinomes spinocellulaires (CSC) , (3) des cytokines inflammatoires augmenté avec le temps au cours du développement tumoral, et (4) l'administration du vaccin peptide induit un profil de cytokines Th1 sérum-polarisé et une réponse des cellules T spécifiques MUC1. Tous les tumeurs chez les souris MUC1.Tg étaient positifs pour MUC1 expression, et la moitié des tumeurs chez les souris de type sauvage ont été MUC1.Tg et invasive. En conclusion, en utilisant une approche d'équipe à travers la coordination des efforts des pharmacologues, des immunologistes, des pathologistes et biologistes moléculaires, nous avons développé un modèle de souris transgénique intact immunitaire du cancer de la vessie qui exprime hMUC1.

Introduction

cancer de la vessie est le quatrième forme la plus commune de cancer et la huitième cause de décès par cancer chez les hommes américains. Aux États-Unis, on estime que 72.500 nouveaux cas et 15.000 décès par cancer de la vessie sont attendus entre hommes et femmes confondus en 2013 ^1. L'incidence du cancer de la vessie est environ trois fois plus élevé chez les hommes que chez les femmes. Aux États-Unis, les carcinomes à cellules transitionnelles (TCC) représentent plus de 90% des cas, tandis que les carcinomes spinocellulaires (CSC) ont une incidence de moins de 2% ^2. Le taux de survie à 5 ans par rapport global pour papillaire TCC est de 91,5% contre seulement 30,9% pour les CSC ^2. Bien que les TCC papillaires non invasives représentent environ 75% des cas au moment du diagnostic, même avec un traitement de plus de 50% des patients connaîtront une récidive dans les 5 ans, avec un maximum de 30% de ces patients évoluant vers muscle maladie invasive ^3,4 . Schémas thérapeutiques classiques pour non-musculaire invasive maladie comprennent la résection transurétrale (TUR) suivie d'une chimiothérapie intravésicale. Chez les patients atteints Ta haute qualité ou des tumeurs T1, une TUR de répétition peut être effectuée avant la chimiothérapie ^3,4. Pour ces patients présentant des récidives de Ta bas grade ou TA de haute qualité ou des lésions T1, TUR suivie d'une chimiothérapie adjuvante ou immunothérapie sous la forme de bacille de Calmette-Guérin (BCG) peut être utilisé ^3,4. Intravésicale BCG a été montré supérieur à intravésicale mitomycine C par rapport au temps de récurrence ^5. Pour la maladie invasive du muscle T2, cystectomie radicale avec ou sans chimiothérapie néoadjuvante est le traitement recommandé ^3. Chez les patients avec SCC, cystectomie radicale semble être le traitement le plus efficace ^6. Étant donné les taux très élevés de récidive malgré les meilleurs traitements disponibles, il ya clairement un besoin de nouvelles thérapies plus efficaces contre le cancer de la vessie.

L'expansion de nouvelles immunothérapies pour bladdcancer ER est une approche possible qui pourrait s'annoncer prometteuse pour prolonger la survie sans maladie. Historiquement, le BCG a été le seul immunothérapie efficace contre le cancer de la vessie. Son mécanisme d'action est pensé pour impliquer l'induction non spécifique d'une réponse immunitaire de type T-helper 1 (Th1) via des niveaux croissants de l'interleukine-2 (IL-2) et l'interféron gamma (IFN-γ) ^4. Cellulaire, ou Th1 immunité, est essentiel dans l'immunothérapie du cancer comme humorale, ou Th2, l'immunité n'a jamais été montré pour être efficace contre les tumeurs solides, à l'exception des anticorps dirigés contre les récepteurs du facteur de croissance ^7. Dans une tentative pour améliorer les avantages de BCG monothérapie IFN-α 2B/BCG immunothérapie combinaison a été évaluée dans un essai clinique de phase II avec des résultats peu concluants ^8. Une autre approche pour l'immunothérapie du cancer de la vessie peut être de cibler des antigènes associés aux tumeurs (TAA), l'identification de ce qui a rendu l'immunothérapie du cancer plus précis ⁷ .

Un tel TAA est une mucine (MUC1), qui est une glycoprotéine de surface de cellule surexprimé dans de nombreux cancers des cellules épithéliales, comme la vessie, du sein, du poumon et le cancer du pancréas ^9,10. L'expression et la modification de MUC1 est également substantiellement modifiées au cours de la carcinogenèse, de telle sorte que underglycosylation expose des séquences d'acides aminés antigéniques des dits nombre variable de répétitions en tandem (VNTR) sur la base des peptides. Alors que MUC1 est un auto-molécule, ces régions VNTR immunodominantes ne sont normalement pas exposés en raison des importants glycosylation, et donc ils sont vus par le système immunitaire ^11,12 étranger. Lymphocytes T cytotoxiques (CTL) qui reconnaissent spécifiquement MUC1 épitopes ont été isolés à partir de la tumeur ganglions lymphatiques de drainage des patients atteints de cancer du sein ^13, ainsi que le sang et la moelle osseuse des patients atteints de myélome ^14,15, ce qui MUC1 une cible potentielle pour une réponse immunitaire cellulaire. Les VNTRs immunodominantes du underglycosylateforme d de MUC1 sont reconnus par les CTL, ce qui entraîne la destruction des cellules tumorales ^16-19. Réponses immunitaires cellulaires et / ou humorale autochtones à MUC1 cancéreuses sont, cependant, pas assez forte pour éliminer les tumeurs. Pour augmenter la réponse immunitaire est affaibli déjà existant pour MUC1, peptides immuno-synthétiques peuvent être introduits par la vaccination pour générer une réponse CTL assez fort pour être d'avantage clinique ^18,20. Un vaccin liposomale MUC1 a déjà été montré pour augmenter la survie des patients atteints de cancer du poumon ^21,22, générer des CTL capables de tuer les cellules tumorales MUC1-positifs, et produire une réponse de cytokines Th1 polarisé ^23,24. Avec un haut niveau d'expression de MUC1 ^9,11,25, le cancer de la vessie est un candidat logique pour tester MUC1 dirigée immunothérapie ^26,27. En outre, MUC1 a un potentiel comme facteur pronostique dans cancer de la vessie ^28, expression de MUC1 dans TCC est significativement associée avec le stade et le grade, et métastatique TCCa été montré pour continuer à exprimer MUC1 ^29.

Afin d'évaluer l'utilité potentielle de l'immunothérapie dirigée MUC1 dans le cancer de la vessie, nous avons développé un MUC1 humaine intacte immunitaire (hMUC1) exprimant transgénique (MUC1.Tg) modèle murin de congénique cancer de la vessie sur le fond C57BL / 6 ^30. MUC1 humain est exprimé comme une protéine du soi sous le contrôle de son propre promoteur, résultant en un profil d'expression tissulaire conforme à celle observée chez l'homme ^30,31. Les souris ont été induites par le carcinogène de la vessie appelée N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) ^32, puis les tumeurs résultant ont été évalués pour hMUC1 expression et le type de tumeur et de qualité. Pour évaluer l'effet de la substance cancérigène sur Th1/Th2 niveaux de cytokines au cours du développement tumoral, des échantillons de sérum ont été prélevés périodiquement pour l'analyse multiplex. Les souris ont ensuite été traités avec un vaccin peptidique MUC1 ciblée, et la cytokine sérum et les réponses immunitaires étaient d'évaluationted par multiplex fluorimétrique immuno-microbille et ELISpot.

Protocole

Toutes les études et les expérimentations animales ont été effectuées en vertu d'un protocole approuvé par l'Université de Californie, Davis Institutional Animal Care et utiliser Comité consultatif administratif.

1. MUC1.Tg élevage de souris et propagation

1. Le Programme Davis Biologie souris UC (MBP) races type sauvage C57BL / 6 mâles avec hétérozygote MUC1.Tg C57BL / 6 femelles pour établir notre colonie de reproduction. Progéniture MUC1.Tg sont livrés à des études selon les besoins.
2. Personnel MBP coupent les doigts de la progéniture dans un modèle défini (0-99) pour l'identification de la souris, et quand pince applicable la queue. L'orteil ou d'un tissu de queue sont traitées pour le génotypage utilisant l'extraction d'ADN standard et Polymerase Chain Reaction (PCR) de l'analyse.

2. Conception de l'étude

1. Étudier les affectations de groupe
   1. Peser chaque souris séparément sur une balance et enregistrer le poids en grammes pour chaque souris.
   2. Cette partie de la procédure invOlvés la méthodologie et la conception de l'étude. Pour la première partie de l'étude, céder souris appariés selon l'âge et MUC1.Tg type sauvage pour commencer l'induction du cancer de la vessie avec OH-BBN. Euthanasier les souris 8 semaines après la dernière dose OH-BBN pour confirmer la présence de tumeurs de la vessie par l'histologie.
   3. Pour la deuxième partie de l'étude, aléatoire souris MUC1.Tg hommes dans le nombre approprié de traitement et les groupes témoins. Ces souris seront surveillés pour des cytokines sériques et les réponses immunitaires des lymphocytes T pendant l'induction et le développement des tumeurs, puis à la fin de l'étude de 8 semaines après la dernière dose OH-BBN.
2. l'induction du cancer de la vessie
   1. OH-BBN est un agent cancérigène et très toxique. S'il vous plaît lire et suivre les directives de la fiche de données de sécurité des matériaux lors de la manipulation et le stockage de ce produit chimique.
   2. Calculer la concentration de la solution de dosage nécessaire pour délivrer la dose appropriée (3 mg), dans un volume de 100 pi, à chaque souris sur la base des poids moyens et number de souris dans chaque étude et de groupe.
   3. Diluer le OH-BBN dans l'éthanol à 100%. Amener la concentration finale de 30 mg / ml avec de l'eau stérile. L'éthanol final: concentration d'eau doit être 20:80, v / v
   4. Administrer le OH-BBN par voie orale avec de l'acier inoxydable, 20 g aiguilles gavage jour, 5 jours / semaine pendant 12 semaines, en fonction de l'affectation du groupe de traitement à partir de l'âge de 8 semaines.
3. Traitements de vaccination
   1. Reconstituer chaque flacon de vaccin peptidique lyophilisée dans 600 ul de 0,9% de solution saline stérile et complètement remettre en suspension en aspirant la solution à travers un 0,5 pouces 27 G aiguille 6x. En utilisant une solution saline, ajuster la concentration de sorte que la dose souhaitée est livré dans un volume de 100 pi.
   2. À partir de la semaine 20, après la dernière dose de OH-BBN, administrer le vaccin sur une base hebdomadaire pour un cycle de huit semaines par injection sous-cutanée de 100 pi avec une aiguille de calibre 25 (numéro de la semaine correspond à l'âge des souris).
4. Surveillance et la collecte de l'échantillon
   1. Peser toutes les souris et palper pour détecter la présence de nouvelles tumeurs une fois par semaine. Euthanasier les souris qui ont perdu ≥ 20% du poids du corps ou s'il ya des tumeurs palpables, du sang dans l'urine et / ou de rétention urinaire.
   2. Avant la première dose OH-BBN, puis à intervalles de 4 semaines par la suite, de recueillir le sang entier via saigne sous-maxillaires. Recueillir le sang dans des tubes de coagulation du sérum (BD Microtainer), et permettre à 30 min pour le sang à coaguler.
   3. Centrifuger les échantillons de sang dans une micro à 3500 g pendant 10 min. Soigneusement transférer le sérum à visser cryotubes de chapeau à l'aide d'une pipette.
   4. Gel rapide dans l'azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu'à l'analyse par multiplex.
   5. Huit semaines après la dernière dose de OH-BBN, euthanasier toutes les souris par asphyxie au _CO2.
   6. Placez chaque souris sur une planche de dissection et épingler par les quatre membres.
   7. En utilisant des pinces et ciseaux, MAke Une incision horizontale dans la région supérieure de l'abdomen. Insérer les ciseaux dans l'incision entre la couche épidermique et la paroi abdominale et à séparer la peau en douceur du tissu sous-jacent à l'aide d'une pince.
   8. Faire une incision verticale de l'incision horizontale suivant l'axe central en direction de l'extrémité antérieure de la souris. Séparer la peau de la cage thoracique, et en utilisant une seringue de 1 ml et une aiguille 22 G, percer le cœur et recueillir le sang avec un tirage lisse et régulière.
   9. Reportez-vous à l'étape 2.4.3 et 2.4.4 pour l'isolement et le stockage du sérum.
   10. En utilisant des pinces et ciseaux, couper et peler le reste de la couche épidermique. Couper à travers la paroi abdominale et du péritoine et de supprimer de façon aseptique tumeur de la vessie pour l'immunohistochimie (IHC) et Western blot.
   11. Recueillir rate pour l'analyse de la viabilité cellulaire (Muse) et ELISpot. Pour IHC, lieu vessie échantillon de la tumeur dans la cassette de tissu et le fixer dans la nuit du formol réfrigérées à la température ambiante.
   12. Le lendemain, remplacer le formol à 70% d'éthanol.
   13. Pour l'analyse par Western blot de tumeur, d'homogénéiser la tumeur, ajouter un tampon d'extraction de protéines ainsi que des inhibiteurs de protéase d'arrêter et de transférer à 1,5 microtubes ml.
   14. Vortex pendant 30-60 secondes et maintenez sur la glace pendant 5 min. Un gel rapide dans l'azote liquide et de dégel dans l'eau ambiante. Répétez le processus de vortex, la congélation et la décongélation deux fois.
   15. Centrifuger les échantillons à 10000 g pendant 10 min à 4 ° C et de transférer les extraits cellulaires de nouveaux tubes marqués.
   16. Quantifier la concentration en effectuant un test de protéine acide Bicinchoninic (BCA) pour les mesures de protéines. Conserver les échantillons à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse par Western blot.

3. Biologie Moléculaire / Western

Les procédures suivantes ont été effectuées pour vérifier l'expression de MUC1 dans les souris vessie tissu tumoral en utilisant le protocole standard de Western Blot (données montrent pasn).

1. Séparez les extraits de protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE), puis les transférer sur une membrane PVDF en utilisant un appareil semi-aride.
2. Bloquer la membrane des protéines transférées avec 5% de lait écrémé dans 0,1% Tween-20 dans un tampon phosphate salin (PBS-T) pH 7,4 pendant 1 heure sur un agitateur orbital à température ambiante.
3. Incuber la membrane pendant 1 heure à température ambiante sur un agitateur avec l'anticorps anti-MUC1 ou anti-β-actine dans 0,1% PBS-T.
4. Laver la membrane par décantation de la solution et en ajoutant 0,1% de PBS-T. Swirl la membrane sur l'agitateur pendant 5 min et décanter. Répétez cette étape deux fois.
5. Incuber la membrane pendant 1 heure à température ambiante avec une peroxydase de raifort (HRP) anticorps secondaire conjugué.
6. Laver 3x (voir l'étape 3.4).
7. Suivre le protocole de la chimiluminescence kit amélioré (ECL) pour activer et lire le fluorographie.

4. Multiplex Fluorometric immuno-Microbead

1. Configuration et calculs
   1. En utilisant une carte de plaque de 96 puits, d'attribuer des blancs, des normes, des contrôles et inconnus dans les puits. Calculez le nombre et le volume des analytes, anticorps de capture et streptavidine-phycoérythrine (SA-PE) nécessaire pour le dosage.
   2. Permettre à tous les tampons et les diluants revenir à température ambiante. Préparer les normes et les dilutions des échantillons à l'aide d'une plaque de 96 puits vide.
   3. Reconstituer la matrice de sérum et de standard lyophilisé selon le protocole du fabricant et faire 1:05 dilutions en série de la norme avec le diluant approprié dans la plaque de 96 puits. Pour les puits vierges, utilisez le diluant approprié.
   4. Diluer tous les contrôles et les échantillons inconnus 1:2 dans le diluant approprié dans le reste de la plaque de 96 puits.
   5. Pour le mélange de billes, une pipette le volume requis du diluant approprié dans un tube de 15 ml. Vortex chaque flacon de billes pendant 20 secondes et la pipette de volume requis de chaque analyte dans le tube de 15 ml.
   6. Toujours protéger les perles de la lumière pour éviter photoblanchiment. Ne pas placer la plaque de 96 puits sur du papier absorbant pour éviter la perte de l'échantillon par capillarité.
2. Protocole de test
   1. Pré-imbibé de la plaque de 96 puits à fond filtrant avec 200 pi de tampon de dosage et de permettre au trempage complet du filtre. Égoutter délicatement à l'aide de l'appareil à vide plaque de 96 puits et de sécher le fond de la plaque avec une serviette en papier.
   2. En utilisant une pipette multicanaux, pipette 25 ul de matrice de sérum dans les puits assignés pour les blancs et les normes et pipette 25 ul de tampon de dosage dans les puits attribués aux contrôles et inconnus.
   3. Pipette 25 ul de la vierge, les normes, les contrôles et inconnus dans les puits assignés respectifs. Vortex le mélange de billes pendant 20 secondes et transférer les perles à un réservoir.
   4. Pipette 25 ul du mélange de billes dans chaque puits. Couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium ou un couvercle de plaque opaque à l'abri de la lumière.
   5. agiter la plaque à 500 rpm pendant deux heures à température ambiante sur un agitateur de plaque. Égoutter et laver la plaque avec 200 pi de 0,1% de Tween 20 dans un tampon phosphate salin (PBS-T) deux fois. Les égoutter et les éponger.
   6. Préparer la solution d'anticorps de capture. Pipeter la quantité requise de 0,1% du PBS-T et l'anticorps de capture dans un tube de 15 ml et le vortex pendant 10 s. Transférer le mélange d'anticorps de capture d'un réservoir et d'une pipette 25 ul dans chaque puits.
   7. Agiter la plaque à 500 rpm pendant une heure à température ambiante sur un agitateur de plaque. Égoutter et laver la plaque avec 200 pi de 0,1% PBS-T deux fois. Les égoutter et les éponger.
   8. Préparer la solution SA-PE. Introduire à la pipette le volume requis de 0,1% PBS-T et SA-PE dans un tube de 15 ml et vortex pendant 10 sec. Transférer la solution dans un réservoir et d'une pipette 25 ul dans chaque puits.
   9. Agiter la plaque à 500 rpm pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur de plaque. Égoutter et laver la plaque avec 200 pi de 0,1% PBS-T deux fois. Égoutter et bBeaucoup sec.
   10. Ajouter 100 ul de 0,1% PBS-T et secouer sur un plateau agitateur à 500 tours par minute pendant au moins deux minutes pour remettre en suspension les perles. Lire et analyser la plaque sur la machine Lx200 Luminex.

5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Préparation et analyse

1. Dans une enceinte de sécurité biologique, traiter les rates à 100 um tissu nylon tamis dans 5 ml stérile tamponnée au phosphate salin (PBS) dans des boîtes de Petri stériles. Couche les splénocytes sur 3 ml de milieu de séparation des lymphocytes dans des tubes stériles de 15 ml.
2. Centrifuger les tubes à 600 xg pendant 15 minutes afin de séparer les lymphocytes à partir des globules rouges. Transférer les lymphocytes couches au-dessus du gradient de nouveaux tubes stériles de 15 ml.
3. Réglez le volume à 10 ml avec du PBS stérile. Centrifuger la suspension à 600 g pendant 10 min à pellets les cellules.
4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de PBS pour la viabilité cellulaire et compter avec la Museanalyseur. Suivez la Muse Count & protocole du kit de viabilité.
5. Faire des dilutions en série des lymphocytes dans 1,5 ml vis des tubes à bouchon de centrifugeuses à des facteurs de dilution de 1:10, 1:20 et 1:40 (ou le cas échéant) au chef et réactif de viabilité (minimum volume total 300 pi). Introduire à la pipette chaque dilution de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et analyser la Muse.
6. Préparer un plan de plaque des échantillons et les conditions de la plaque ELISpot. Préparer la plaque ELISpot selon le protocole du fabricant et pipette 100 pi de milieu, un peptide (10 pg / ml), ou d'un peptide (10 pg / ml) dans chaque puits bousculade.
7. Ajouter 100 ul de la suspension cellulaire, délivrant 1,0 x 10 ⁶ cellules dans chaque puits et incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit.
8. Suivre le protocole du fabricant pour le test ELISPOT. Analyser la plaque de ELISpot développé en utilisant un microscope à dissection.
9. Quantifier les résultats en comptant le nombre de taches colorées corresponding de chaque analyte dans chaque puits. Les spots correspondent au nombre de cellules de formation de tache (SFC) dans chaque puits.

6. Immunohistochimie (IHC) et hématoxyline & éosine (H & E) Coloration

1. Prenez la vessie tissu tumoral conservé tel que décrit ci-dessus (2.4.11), intégrer dans la paraffine et la section étape à 4 um pour l'analyse immunohistochimique.
2. Effectuer IHC utilisant un anticorps MUC1 qui reconnaît la région de répétition en tandem de MUC1. Utilisez le kit peroxydase de recherche sur les animaux afin de minimiser la réactivité de l'anticorps secondaire de la souris avec de l'immunoglobuline endogène présente dans le tissu.
3. Effectuer coloration H & E en utilisant des protocoles standard.

7. Méthodes statistiques

Pour le Multiplex Fluorometric immunologique de microbilles, utiliser le test t de Student bilatéral à comparer à la moyenne observée des concentrations de cytokines sériques entre le traitement et les groupes témoins. Pour ELISpot, utiliser un one-way ANOVA pour comparer la tache formant colonies entre le contrôle des médias, brouillés peptide et groupes peptidiques. Utilisez test de comparaison multiple de Dunnett pour réduire la probabilité d'un résultat faussement positif. Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme significativement différente de toutes les analyses.

Résultats

L'évaluation préclinique des effets des nouvelles immunothérapies et de combinaisons dans le cancer de la vessie nécessite le développement d'un modèle animal approprié. Dans notre modèle de souris transgénique, l'induction avec le carcinogène chimique OH-BBN a entraîné un taux élevé d'incidence du cancer de la vessie de prédominance TCC avec certains CSC, qui est semblable au cancer de la vessie chez l'homme. Pour déterminer histologie de la tumeur, MUC1 statut d'expression et la...

Discussion

L'induction réussie invasive cancer de la vessie à cellules transitionnelles et squameuses chez les souris MUC1.Tg humaines propose un modèle préclinique pour le développement de l'immunothérapie. Études d'immunothérapie nécessitent l'utilisation d'un modèle intact spontanée, à l'abri afin d'évaluer la réponse inflammatoire à la progression tumorale au fil du temps ainsi que la réponse immunitaire à l'immunothérapie. Dans un modèle de développement de tumeurs spontané...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)	TCI America	B0938
20 G Gavage Needles	Popper Sons, Inc.	7921	Stainless steel
Peptide Vaccine	N/A	N/A	investigational agent
BD Microtainers	BD	365957
Tissue Cassettes	Simport	M490-12
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Lysis Buffer	Pierce	87787
Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail	Thermo Scientific	78444
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225
Mouse Cytokine 20plex Kit	Invitrogen	LMC006
Magnetic Microsphere Beads	Luminex	MC100xx-01	xx is the bead region
Anti-mouse TNF- Capture Antibody	BD Pharmingen	551225
Anti-mouse TNF- Detection Antibody	BD Pharmingen	554415
Anti-mouse IFN- Capture Antibody	Abcam	ab10742
Anti-mouse IFN- Detection Antibody	Abcam	ab83136
PBS, pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK
Tween-20	Fisher	BP337-500
Assay Buffer	Millipore	L-MAB
Cytokine Standard	Millipore	MXM8070
Multi-screen HTS 96well filter plates	Millipore	MSBVN1210
SA-PE	Invitrogen	SA10044
100 m Nylon Tissue Sieves	BD	352360
Splenocyte Separation Media	Lonza	17-829E
TNF- /IL-4 ELISpot plates	R&D Systems	ELD5217
Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody	Epitomics	2900-1
Goat Anti-actin monoclonal antibody	Sigma	A1978
Anti-rabbit HRP antibody	Promega	W401B
Goat anti-mouse HRP antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-2005
PVDF membrane	BioRad	162-0174
Mini Protean TGX Precast Gels	BioRad	456-1083
Muse Count & Viability Kit	Millipore	MCH100104
MUC1 Antibody	BD Pharmingen	550486	IHC antibody
Animal Research Peroxidase Kit	Dako	K3954	IHC staining
Equipment and Software
Millipore plate vaccum apparatus	Millipore	MSVMHTS00
Luminex Lx200	Millipore / Luminex	40-013	Manufactured by Luminex, distributed by Millipore
Luminex Xponent Software	Millipore / Luminex	N/A	Version 3.1; included with Luminex Lx200
Milliple Analyst Software	Milliplex / VigeneTech	40-086	Version 5.1
Muse Cell Analyzer	Millipore	0500-3115
Muse Software	Millipore	N/A	Version 1.1.0.0; included with Analyzer
Dissecting Microscope	Unitron	Z730
Graphpad Prism Software	Graphpad Software Inc.	N/A	Version 5.1
Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus	BioRad	165-8001
Trans Blot SD Cell and PowerPac	BioRad	170-3849