Induzione di Invasive Transitional cellulare Bladder Carcinoma in immunitario intatto umani MUC1 topi transgenici: un modello di sviluppo Immunoterapia

Riepilogo

Un N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine indotta modello di cancro alla vescica è stato sviluppato in mucina umano 1 (MUC1) topi transgenici per la fine del controllo MUC1-diretto immunoterapia. Dopo la somministrazione di un vaccino peptidico MUC1-mirata, una risposta di linfociti T citotossici per MUC1 è stata confermata misurando i livelli sierici di citochine e l'attività delle cellule T specifiche.

Abstract

Un modello preclinico di carcinoma invasivo della vescica è stata sviluppata in mucina umano 1 (MUC1) transgenici (MUC1.Tg) topi per lo scopo di valutare l'immunoterapia e / o chemioterapia citotossica. Per indurre il cancro della vescica, topi C57BL / 6 (tipo MUC1.Tg e selvatici) sono stati trattati per via orale con il cancerogeno N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine (OH-BBN) di 3,0 mg / giorno, 5 giorni / settimana per 12 settimane. Per valutare gli effetti di OH-BBN sul profilo delle citochine nel siero durante lo sviluppo del tumore, il sangue intero è stato raccolto tramite sanguina sottomandibolari prima del trattamento e ogni quattro settimane. Inoltre, un vaccino peptidico MUC1-targeting e placebo sono stati somministrati a gruppi di topi settimanali per otto settimane. Sono state eseguite Multiplex fluorimetrici immunoanalyses microsfere di citochine sieriche durante lo sviluppo del tumore e dopo la vaccinazione. Alla cessazione, interferone gamma (IFN-γ) / interleuchina-4 (IL-4) ELISpot analisi per MUC1 risposta immunitaria delle cellule T specifiche e valutazioni istopatologiche di tipo tumoralee grado sono stati eseguiti. I risultati hanno mostrato che: (1) l'incidenza di cancro alla vescica nei topi di tipo sia MUC1.Tg e selvaggia è stata del 67%, (2) carcinomi a cellule transizionali (TCC), sviluppati in un rapporto di 2:1 rispetto ai carcinomi a cellule squamose (SCC) , (3) citochine infiammatorie aumentate con il tempo durante lo sviluppo del tumore, e (4) la somministrazione del vaccino peptidico induce un profilo di citochina Th1 siero-polarizzata e una specifica risposta di cellule T MUC1. Tutti i tumori nei topi MUC1.Tg sono stati positivi per MUC1 espressione, e la metà di tutti i tumori nei topi di tipo MUC1.Tg e selvatici erano invasive. In conclusione, utilizzando un approccio di squadra attraverso il coordinamento degli sforzi di farmacologi, immunologi, patologi e biologi molecolari, abbiamo sviluppato un modello di topo transgenico intatto immunitario del cancro della vescica che esprime hMUC1.

Introduzione

Il carcinoma della vescica è la quarta forma più comune di cancro e l'ottava causa di decessi per cancro negli uomini americani. Negli Stati Uniti, circa 72.500 nuovi casi e 15.000 decessi per cancro della vescica sono attesi tra gli uomini e le donne unite nel 2013 ^1. L'incidenza del cancro della vescica è di circa tre volte superiore negli uomini rispetto alle donne. Negli Stati Uniti, carcinomi a cellule transizionali (TCC) rappresentano oltre il 90% dei casi, mentre carcinomi a cellule squamose (SCC) hanno una incidenza di meno del 2% ^2. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni relativo complessivo per papillare TCC è del 91,5% rispetto a solo il 30,9% per SCC ^2. Sebbene non invasive TCC papillari rappresentano circa il 75% dei casi al momento della diagnosi, anche con il trattamento di oltre il 50% dei pazienti va incontro a recidiva entro 5 anni, con un massimo di 30% di questi pazienti in progressione di malattia invasiva muscolare ^3,4 . Regimi di trattamento tipici per inv non muscolomalattia Asive comprendono la resezione transuretrale (TUR) seguita da chemioterapia endovescicale. Nei pazienti con Ta alto grado o tumori T1, un TUR ripetizione può essere effettuato prima della chemioterapia ^3,4. Per quei pazienti con recidive Ta basso grado o Ta alto grado o lesioni T1, TUR seguita da chemioterapia adiuvante o immunoterapia in forma di Bacillus Calmette-Guerin (BCG) può essere utilizzato ^3,4. BCG intravescicale ha dimostrato di essere superiore a endovescicale mitomicina C rispetto al tempo alla recidiva ^5. Per la malattia invasiva muscolare T2, cistectomia radicale con o senza chemioterapia neoadiuvante è il corso del trattamento raccomandata ^3. In pazienti con SCC, cistectomia radicale sembra essere il trattamento più efficace ^6. Dati gli alti tassi di recidiva nonostante i migliori trattamenti disponibili, è evidente la necessità di nuove e più efficaci terapie per il cancro della vescica.

Espansione nuove immunoterapie per bladdcancro ER è un possibile approccio che possono tenere la promessa di estendere la sopravvivenza libera da malattia. Storicamente, BCG è stata l'unica immunoterapia efficace per il cancro della vescica. Il suo meccanismo di azione è pensato per coinvolgere l'induzione non specifico di una T-helper 1 (Th1) tipo di risposta immunitaria tramite l'aumento dei livelli di interleuchina-2 (IL-2) e l'interferone gamma (IFN-γ) ^4. Cellulare, o immunità Th1, è critica in immunoterapia del cancro come umorale o Th2, immunità è mai stato dimostrato di essere efficace contro i tumori solidi, con l'eccezione di anticorpi diretti contro recettori di fattori di crescita ^7. Nel tentativo di migliorare i benefici di BCG in monoterapia, IFN-α 2B/BCG combinazione di immunoterapia è stata valutata in uno studio clinico di fase II con risultati inconcludenti ^8. Un approccio alternativo per immunoterapia per il cancro della vescica può essere di indirizzare antigeni tumore-associati (TAA), la cui identificazione ha reso immunoterapia del cancro più specifico ⁷ .

Uno di questi è TAA mucina 1 (MUC1), che è una glicoproteina di superficie cellulare sovraespresso in molti cancri delle cellule epiteliali quali vescica, della mammella, del polmone, cancro del pancreas e ^9,10. L'espressione e la modifica di MUC1 è anche sostanzialmente modificate durante la carcinogenesi, tali che espone underglycosylation sequenze antigeniche di amminoacidi conosciuti come numero variabile di ripetizioni in tandem (VNTR) sul nucleo peptide. Mentre MUC1 è un self-molecola, queste regioni VNTR immunodominant normalmente non sono esposti a causa della vasta glicosilazione, e così si sono visti dal sistema immunitario come estraneo ^11,12. T-linfociti citotossici (CTL) che riconoscono specificamente MUC1 epitopi sono stati isolati dal tumore-drenanti linfonodi di pazienti con carcinoma mammario ^13, così come il sangue e midollo osseo di pazienti affetti da mieloma ^14,15, rendendo MUC1 un potenziale bersaglio per un risposta immunitaria cellulare. Le VNTRs immunodominanti della underglycosylated forma di MUC1 sono riconosciuti da CTL, causando la distruzione delle cellule tumorali ^16-19. Native risposte immunitarie cellulari e / o umorali verso MUC1 cancerose sono, tuttavia, non abbastanza forte per eliminare i tumori. Per aumentare la risposta immunitaria debole già esistente per MUC1, peptidi immunodominanti sintetici possono essere introdotte attraverso la vaccinazione per generare una risposta CTL abbastanza forte per essere di beneficio clinico ^18,20. Un MUC1 vaccino liposomiale ha già dimostrato di aumentare la sopravvivenza nei pazienti con tumore del polmone ^21,22, generare CTL in grado di uccidere le cellule tumorali MUC1-positivi, e produrre una risposta di citochine Th1-polarizzato ^23,24. Con un alto livello di espressione di MUC1 ^9,11,25, cancro della vescica è un candidato logico per testare MUC1-diretta immunoterapia ^26,27. Inoltre, MUC1 ha potenziale come fattore prognostico nel carcinoma della vescica ^28, MUC1 espressione in TCC è significativamente associato con la fase e grado, e TCC metastaticoha dimostrato di continuare ad esprimere MUC1 ^29.

Per valutare l'utilità potenziale di immunoterapia MUC1-diretto nel cancro della vescica, abbiamo sviluppato un MUC1 umana intatta immunitario (hMUC1)-esprimenti transgenico (MUC1.Tg) modello murino di cancro della vescica congenic sul C57BL / 6 di fondo ^30. MUC1 umano viene espresso come proteina self sotto il controllo del proprio promotore, risultando in un pattern di espressione tissutale coerente con quella osservata nell'uomo ^30,31. I topi sono stati indotti con la vescica cancerogeno noto N-butil-N-(4-idrossibutil) nitrosamine (OH-BBN) ^32, e poi i tumori risultanti sono stati valutati per hMUC1 espressione e tipo di tumore e grado. Per valutare l'effetto della sostanza cancerogena sulla Th1/Th2 livelli di citochine durante lo sviluppo del tumore, i campioni di siero sono stati raccolti periodicamente per l'analisi multiplex. I topi sono stati poi trattati con un vaccino peptidico MUC1-mirata, e la citochina siero e risposte immunitarie sono valuta da multiplex fluorometrica immunologico microbead e ELISpot.

Protocollo

Tutti gli studi e gli esperimenti sugli animali sono stati condotti nell'ambito di un protocollo approvato dalla University of California, Davis Institutional Animal Care e Usa comitato consultivo amministrativo.

1. MUC1.Tg mouse Allevamento e propagazione

1. L'UC Davis mouse programma di biologia (MBP) razze di tipo selvatico C57BL / 6 topi maschi con eterozigote MUC1.Tg C57BL / 6 topi femmina di stabilire la nostra colonia riproduttiva. MUC1.Tg prole vengono consegnati per gli studi, se necessario.
2. Personale MBP tarpare le dita dei piedi della prole in un modello definito (0-99) per l'identificazione del mouse, e quando fermaglio applicabile la coda. La punta o il tessuto di coda sono trattati per la genotipizzazione mediante estrazione del DNA standard Polymerase Chain Reaction (PCR).

2. Disegno dello studio

1. Studiare assegnazioni di gruppo
   1. Pesare ciascun topo separatamente su una bilancia e registrare il peso in grammi per ogni mouse.
   2. Questa parte della procedura di invOlvés la metodologia e la progettazione dello studio. Per la prima parte dello studio, assegnate pari età-topi di tipo MUC1.Tg e selvaggio per iniziare l'induzione del cancro della vescica con OH-BBN. Euthanize topi 8 settimane dopo l'ultima dose OH-BBN per confermare la presenza di tumori della vescica con l'istologia.
   3. Per la seconda parte dello studio, i topi maschi randomizzare MUC1.Tg nel numero appropriato di trattamento e di gruppi di controllo. Questi topi saranno monitorati per citochine sieriche e le risposte immunitarie delle cellule T durante l'induzione e lo sviluppo del tumore, e quindi al termine dello studio 8 settimane dopo l'ultima dose OH-BBN.
2. Cancro alla vescica induzione
   1. OH-BBN è una sostanza cancerogena e altamente tossica. Si prega di leggere e seguire le linee guida della scheda di sicurezza durante la manipolazione e la conservazione questa sostanza chimica.
   2. Calcolare la concentrazione della soluzione di dosaggio necessario per erogare la dose appropriata (3 mg), in un volume di 100 microlitri, ad ogni mouse sulla base dei pesi medi e number di topi in ogni studio e di gruppo.
   3. Diluire il OH-BBN in 100% di etanolo. Portare la concentrazione finale di 30 mg / ml con acqua sterile. L'etanolo finale: concentrazione di acqua dovrebbe essere 20:80, v / v
   4. Amministrare l'OH-BBN oralmente usando l'acciaio inossidabile, 20 g di aghi di gavage giornaliere, 5 giorni / settimana per 12 settimane, in base al gruppo di assegnazione del trattamento a partire dall'età di 8 settimane.
3. Trattamenti di vaccinazione
   1. Ricostituire ogni flacone di vaccino peptidico liofilizzato in 600 ml di soluzione fisiologica 0,9% sterile e completamente risospendere disegnando la soluzione attraverso un 0,5 pollici 27 ago G 6x. Utilizzando soluzione, regolare la concentrazione in modo che la dose desiderata è trasportato in un volume di 100 microlitri.
   2. A partire in settimana 20, dopo l'ultima dose di OH-BBN, somministrare il vaccino su base settimanale per un ciclo di otto settimane per iniezione sottocutanea di 100 microlitri utilizzando un ago da 25 G (settimana numero corrisponde all'età dei topi).
4. Monitoraggio e la raccolta del campione
   1. Pesare tutti i mouse e palpare per la presenza di nuovi tumori una volta ogni settimana. Euthanize eventuali topi che hanno perso ≥ 20% del peso corporeo o se ci sono tumori palpabili, sangue nelle urine, e / o ritenzione urinaria.
   2. Prima della prima dose OH-BBN e poi ad intervalli di 4 settimane dopo, raccogliere il sangue intero tramite sanguina sottomandibolari. Raccogliere il sangue in provette di coagulazione del siero (BD Microtainer), e consentire 30 minuti per la coagulazione del sangue.
   3. Centrifugare i campioni di sangue in una microcentrifuga a 3.500 xg per 10 min. Trasferire con attenzione il siero per avvitare cryotubes cappuccio con una pipetta.
   4. Flash congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino a quando ulteriori analisi da multiplex.
   5. Otto settimane dopo l'ultima dose di OH-BBN, eutanasia tutti i topi da CO ₂ asfissia.
   6. Collocare ogni mouse su una tavola di dissezione e di definire con precisione da tutti e quattro gli arti.
   7. Con pinze e forbici, make una incisione orizzontale nella regione addominale superiore. Inserire le forbici nell'incisione tra lo strato epidermico e la parete addominale e separare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante con l'aiuto di pinze.
   8. Praticare un'incisione verticale dal incisione orizzontale seguendo l'asse centrale verso l'estremità anteriore del mouse. Separare la pelle dalla gabbia toracica, e utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 22 G, forare il cuore e raccogliere il sangue con un pareggio regolare e costante.
   9. Fare riferimento al punto 2.4.3 e 2.4.4 per l'isolamento e la conservazione del siero.
   10. Con pinze e forbici, tagliare e staccare il resto dello strato epidermico. Tagliare attraverso la parete addominale e del peritoneo e rimuovere asetticamente tumore della vescica per Immunoistochimica (IHC) e Western blot.
   11. Raccogliere la milza per l'analisi della vitalità cellulare (Muse) e ELISpot. Per IHC, luogo esemplare tumore della vescica in cassetta tessuto e fissare in formalina refrigerata durante la notte a temperatura ambiente.
   12. Il giorno seguente, sostituire la formalina con il 70% di etanolo.
   13. Per l'analisi Western blot di tumore, omogeneizzare il tumore, aggiungere tampone di estrazione di proteine, più inibitori della proteasi Halt e trasferimento in provette da 1,5 ml microcentrifuga.
   14. Vortex per 30-60 secondi e tenere in ghiaccio per 5 min. Flash congelare in azoto liquido e disgelo in acqua ambiente. Ripetere il processo di vortex, congelamento e scongelamento due volte.
   15. Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire gli estratti cellulari a nuove provette etichettate.
   16. Quantificare la concentrazione effettuando un bicinconinico Acid Protein Assay (BCA) per misure di proteine. Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento dell'analisi Western Blot.

3. Biologia Molecolare / Western

Le seguenti procedure sono state eseguite per verificare l'espressione di MUC1 in topo tessuto del tumore della vescica utilizzando il protocollo standard Western Blot (non dati mostranon).

1. Separare gli estratti proteici mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (SDS-PAGE) e poi trasferire su membrana PVDF utilizzando apparato semisecco.
2. Bloccare la proteina di membrana trasferita con il 5% di latte scremato in 0,1% di Tween-20 in tampone fosfato (PBS-T) pH 7.4 per 1 ora su un agitatore orbitale a temperatura ambiente.
3. Incubare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore con anticorpo anti-MUC1 o anti-β-actina in 0,1% PBS-T.
4. Lavare la membrana per decantazione e la soluzione aggiungendo 0,1% PBS-T. Swirl la membrana sulla agitatore per 5 minuti e decantare. Ripetere questa operazione due volte.
5. Incubare la membrana per 1 ora a temperatura ambiente con un ravanello cavallo perossidasi (HRP), anticorpo secondario coniugato.
6. Lavare 3x (fare riferimento al punto 3.4).
7. Seguire il protocollo per l'(ECL) kit Chemiluminesence avanzato per attivare e leggere il fluorografia.

4. Multiplex fluorimetrica microperla immunoenzimatico

1. Setup e Calcoli
   1. Utilizzando una mappa piastra a 96 pozzetti, assegnare gli spazi, standard, controlli e campioni sconosciuti nei pozzi. Calcolare il numero e il volume di analiti, catturare anticorpi e streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) necessarie per il dosaggio.
   2. Consentire a tutti i tamponi e diluenti per portare a temperatura ambiente. Preparare gli standard e le diluizioni del campione utilizzando un vuoto piastra a 96 pozzetti.
   3. Ricostituire la matrice sierica e standard di liofilizzato secondo il protocollo del produttore e fare diluizioni seriali 1:05 del campione con il diluente appropriato nella piastra a 96 pozzetti. Per i pozzetti del bianco, utilizzare il diluente appropriato.
   4. Diluire tutti i controlli ed i campioni 1:2 diluente appropriato nel resto della piastra a 96 pozzetti.
   5. Per la miscela di sferette, pipettare il volume richiesto di diluente appropriato in un tubo da 15 ml. Vortex ciascuna fiala branello per 20 sec e pipetta il volume di ciascun analita nel tubo 15 ml.
   6. Proteggere sempre le perle dalla luce per evitare photobleaching. Non posizionare la piastra a 96 pozzetti su materiale assorbente per evitare la perdita di campione attraverso la traspirazione.
2. Assay Protocol
   1. Prewet la piastra inferiore 96 pozzetti filtro con 200 microlitri di tampone del saggio e consentire all'ammollo completa del filtro. Drenare delicatamente usando l'apparecchio vuoto piastra a 96 pozzetti e asciugare il fondo del piatto con un tovagliolo di carta.
   2. Usando una pipetta multicanale, pipetta 25 ml di matrice sierica nei pozzetti assegnati per i bianchi e gli standard e pipetta 25 ml di tampone del saggio nei pozzetti assegnati per i controlli e le incognite.
   3. Pipettare 25 ml del bianco, standard, controlli e campioni sconosciuti nei rispettivi pozzetti. La miscela di sferette vortex per 20 sec e trasferire le perline ad un serbatoio.
   4. Pipettare 25 microlitri della miscela di sferette in ciascun pozzetto. Coprire la piastra con un foglio di alluminio o un coperchio piatto opaco per proteggere dalla luce.
   5. agitare la piastra a 500 rpm per due ore a temperatura ambiente su un agitatore di piastre. Scolare e lavare la piastra con 200 microlitri di 0.1% di Tween 20 in tampone fosfato (PBS-T) due volte. Scolare e asciugare.
   6. Preparare la soluzione di anticorpo di cattura. Pipettare la quantità richiesta di 0,1% PBS-T e catturare anticorpo in una provetta da 15 e vortex per 10 sec. Trasferire la miscela anticorpo di cattura di un flacone 25 microlitri in ciascun pozzetto.
   7. Agitare la piastra a 500 rpm per un'ora a temperatura ambiente su un agitatore di piastre. Scolare e lavare la piastra con 200 microlitri di 0.1% PBS-T due volte. Scolare e asciugare.
   8. Preparare la soluzione di SA-PE. Pipettare il volume richiesto di 0,1% PBS-T e SA-PE in una provetta e vortex per 10 sec 15. Trasferire la soluzione in un flacone 25 microlitri in ciascun pozzetto.
   9. Agitare la piastra a 500 rpm per 30 min a temperatura ambiente su un agitatore di piastre. Scolare e lavare la piastra con 200 microlitri di 0.1% PBS-T due volte. Scarico e Blotto asciutto.
   10. Aggiungere 100 microlitri di 0.1% PBS-T e agitare su un agitatore a 500 rpm per almeno due minuti per risospendere le sfere. Leggere e analizzare la piastra sulla macchina Luminex LX200.

5. IFN-γ/IL-4 ELISpot preparazione e l'analisi

1. In una cappa di sicurezza biologica, elaborare la milza attraverso 100 tessuto di nylon micron setacci in 5 ml di fosfato sterile Soluzione salina tamponata (PBS) in piastre sterili. Strato le splenociti su 3 ml di linfociti mezzo di separazione in provette sterili da 15 ml.
2. Centrifugare le provette a 600 xg per 15 min a separare i linfociti dai globuli rossi. Trasferire i linfociti a strati sopra il gradiente di nuove provette sterili da 15 ml.
3. Regolare il volume a 10 ml con PBS sterile. Centrifugare la sospensione a 600 xg per 10 min per agglomerare le cellule.
4. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di PBS per la vitalità cellulare e contare con la Musaanalizzatore. Seguire il conte Muse & protocollo Kit Viabilità.
5. Effettuare diluizioni seriali dei linfociti in 1,5 ml provette con tappo a vite centrifugare a fattori di diluizione di 1:10, 01:20 e 01:40 (o secondo necessità) in Conte & Viabilità Reattivo (totale minimo volume di 300 ml). Pipettare ogni diluizione su e giù diverse volte per miscelare ed analizzare sul Muse.
6. Preparare una mappa della piastra dei campioni e le condizioni per la piastra ELISpot. Preparare la piastra ELISpot secondo il protocollo del produttore e pipettare 100 pl di mezzo, peptide (10 mcg / ml), o peptide (10 pg / ml) in ciascun pozzetto scramble.
7. Pipettare 100 ul di sospensione cellulare, fornire 1.0 x 10 ⁶ cellule in ciascun pozzetto ed incubare la piastra a 37 ° C per una notte.
8. Seguire il protocollo del produttore per il saggio ELISpot. Analizzare la piastra ELISpot sviluppato utilizzando un microscopio dissezione.
9. Quantificare i risultati contando il numero di macchie colorate corring per ciascun analita in ciascun pozzetto. Le macchie corrispondono al numero di cellule formanti-(SFC) in ciascun pozzetto.

6. Immunoistochimica (IHC) e ematossilina e eosina (H & E) Colorazione

1. Prendere vescica tessuto tumorale conservato come descritto in precedenza (sezione 2.4.11), incorporare in paraffina e step-sezione a 4 micron per l'analisi immunoistochimica.
2. Eseguire IHC utilizzando un anticorpo MUC1 che riconosce la regione di ripetizione in tandem di MUC1. Utilizzare l'Animal Research Kit perossidasi per minimizzare la reattività dell'anticorpo secondario mouse con immunoglobulina endogena presente nel tessuto.
3. Eseguire la colorazione H & E utilizzando protocolli standard.

7. Metodi statistici

Per il Multiplex fluorimetrica microperla immunoenzimatico, utilizzare il test t di Student a due code per confrontare la media osservata concentrazioni sieriche di citochine tra i gruppi di trattamento e di controllo. Per ELISpot, utilizzare un one-way ANOVA per confrontare il punto formando colonie tra il controllo dei media, strapazzate peptide e gruppi peptidici. Utilizzare più Comparison Test di Dunnett per diminuire la probabilità di un risultato falso positivo. Un valore di p ≤ 0,05 è considerato significativamente diverso per tutte le analisi.

Risultati

La valutazione preclinica degli effetti di nuove immunoterapie e combinazioni nel cancro della vescica richiede lo sviluppo di un modello animale appropriato. Nel nostro modello di topo transgenico, induzione con il cancerogeno chimico OH-BBN provocato un alto tasso di incidenza di cancro alla vescica prevalentemente TCC con qualche SCC, che è simile al cancro della vescica negli esseri umani. Per determinare istologia tumorale, MUC1 stato di espressione e la risposta immunitaria al trattamento vaccino peptidico, 21 e ...

Discussione

L'induzione di successo di carcinoma invasivo della vescica a cellule transizionali e squamose nei topi MUC1.Tg umani offre un modello preclinico per lo sviluppo di immunoterapia. Studi immunotherapeutic richiedono l'uso di un modello intatto immunitario spontaneo per valutare la risposta infiammatoria alla progressione tumorale nel tempo, così come la risposta immunitaria a immunoterapia. In un modello di sviluppo del tumore spontaneo, il microambiente tumorale rimane intatto e tumori sviluppano ad un tasso di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN)	TCI America	B0938
20 G Gavage Needles	Popper Sons, Inc.	7921	Stainless steel
Peptide Vaccine	N/A	N/A	investigational agent
BD Microtainers	BD	365957
Tissue Cassettes	Simport	M490-12
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4
Lysis Buffer	Pierce	87787
Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail	Thermo Scientific	78444
Pierce BCA Protein Assay Kit	Pierce	23225
Mouse Cytokine 20plex Kit	Invitrogen	LMC006
Magnetic Microsphere Beads	Luminex	MC100xx-01	xx is the bead region
Anti-mouse TNF- Capture Antibody	BD Pharmingen	551225
Anti-mouse TNF- Detection Antibody	BD Pharmingen	554415
Anti-mouse IFN- Capture Antibody	Abcam	ab10742
Anti-mouse IFN- Detection Antibody	Abcam	ab83136
PBS, pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK
Tween-20	Fisher	BP337-500
Assay Buffer	Millipore	L-MAB
Cytokine Standard	Millipore	MXM8070
Multi-screen HTS 96well filter plates	Millipore	MSBVN1210
SA-PE	Invitrogen	SA10044
100 m Nylon Tissue Sieves	BD	352360
Splenocyte Separation Media	Lonza	17-829E
TNF- /IL-4 ELISpot plates	R&D Systems	ELD5217
Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody	Epitomics	2900-1
Goat Anti-actin monoclonal antibody	Sigma	A1978
Anti-rabbit HRP antibody	Promega	W401B
Goat anti-mouse HRP antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-2005
PVDF membrane	BioRad	162-0174
Mini Protean TGX Precast Gels	BioRad	456-1083
Muse Count & Viability Kit	Millipore	MCH100104
MUC1 Antibody	BD Pharmingen	550486	IHC antibody
Animal Research Peroxidase Kit	Dako	K3954	IHC staining
Equipment and Software
Millipore plate vaccum apparatus	Millipore	MSVMHTS00
Luminex Lx200	Millipore / Luminex	40-013	Manufactured by Luminex, distributed by Millipore
Luminex Xponent Software	Millipore / Luminex	N/A	Version 3.1; included with Luminex Lx200
Milliple Analyst Software	Milliplex / VigeneTech	40-086	Version 5.1
Muse Cell Analyzer	Millipore	0500-3115
Muse Software	Millipore	N/A	Version 1.1.0.0; included with Analyzer
Dissecting Microscope	Unitron	Z730
Graphpad Prism Software	Graphpad Software Inc.	N/A	Version 5.1
Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus	BioRad	165-8001
Trans Blot SD Cell and PowerPac	BioRad	170-3849