הפקה וניתוח של קורטיזול מאדם וקוף השיער

Summary

קורטיזול (קורט) מצטבר בשערה הולך וגדל של בני אדם ופרימטים לא אנושיים. אנו מתארים שיטות לחילוץ וניתוח קורט שיער עם דיוק גבוה ורגישות. מדידה של שיער קורט היא טוב במיוחד מתאימה להערכת לחץ כרוני על פני תקופות של שבועות עד חודשים.

Abstract

הורמון לחץ קורטיזול (הקורט) משולב באיטיות לתוך פיר שיער גדל והולך של בני אדם, פרימטים לא אנושיים, ויונקים אחרים. פיתחנו ומאומתים שיטה להפקת קורט וניתוח מקוף רזוס שיער ולאחר מכן הותאם בשיטה זו לשימוש עם שיער קרקפת אנושית. בניגוד ל" דגימות נקודה "קורט מתקבלות מפלזמה או רוק, שיער קורט מספק מדד משולב של פעילות מערכת ההיפותלמוס, יותרת המוח adrenocortical (HPA), ומתח ובכך פיסיולוגי, במהלך תקופת התאגדות הורמון. בגלל שיער קרקפת אנושי גדל בשיעור ממוצע של 1 סנטימטר / חודש, רמות הקורט מתקבלות ממגזרי שיער כמה סנטימטר באורך עלולים לשמש כסמן ביולוגי של לחץ שחווה על פני מספר החודשים.

בשיטה שלנו, כל דגימת שיער נשטפה ראשון פעמיים בisopropanol כדי להסיר כל קורט מהחלק החיצוני של השערה שכבר הופקדה מזיעה או חלב. לאחר ייבוש,מדגם הוא קרקע לאבקה דקה כדי לשבור את מטריצת החלבון של השיער ולהגדיל את שטח הפנים להפקה. קורט מהפנים של השערה מופק לתוך מתנול, מתנול הוא התאדה, ותמציתו מחדש במאגר assay. קורט חילוץ, יחד עם סטנדרטים ובקרת איכות, הוא ניתח אז באמצעות immunoassay אנזים זמין מסחרי רגיש וספציפי ערכה (EIA). קריאת נתוני EIA מומר לקורט pg למשקל שיער אבקת מ"ג. בשיטה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לנתח קורט שיער בבני אדם, כמה מינים של קופים מקוק, חרגולים, כלבים, ודובי קוטב. מחקרים רבים הן מהמעבדה שלנו ומקבוצות מחקר אחרות הוכיחו את תחולתה הרחבה של קורט שיער להערכת חשיפה ללחץ כרוני בטבעי, כמו גם הגדרות מעבדה.

Introduction

מדידה של קורט בפלזמה, רוק, או לעתים בשתן או צואה שמשה כמדד ללחץ פיסיולוגי מאז הגילוי של Selye על תפקידו של ציר HPA במתח ^1. למרות מאמרים רבים שפורסמו נוגעים פעילות HPA למצבים מלחיצים בחריפות, השדה כבר הקשו על ידי חוסר מדד פשוט ואמין של לחץ פיסיולוגי כרוני. בעיה זו נובעת מכך שהערכות פלזמה ורוק גם תשואה "נקודה" של פעילות HPA שחשופים לסטיות היממה ויכול להיות מבולבלת על ידי הפרעות סביבתיות. דגימות שתן וצואה להניב מדידות של קורט ו / או הפרשת המטבוליט כי ההיקף מספר שעות עד יום שלם בחלק ממקרים. איסוף דגימות מרובות באמצעות כל אחת ממטריצות אלו עשוי לספק מדד משולב גס של רמות הקורט לאורך זמן, עם זאת, אף אחת מהגישות הללו מספק מדד באמת לטווח הארוך של פעילות HPA והיענות של סאי זהגזע ללחצים כרוניים.

מדידת קורט בשיער החלה למלא את הצורך החשוב הזה בספרות המתח. מחקרים ראשוניים על ידי מספר מעבדות הפגינו את נוכחותו של קורט בשיער אנושי אך לא לחקור האם רמות קורט שיער השתנו כפונקציה של מתח ^2. כמעבדה שלנו כבר מתעניינת שנים רבות בוויסות של ציר HPA קוף רזוס ידי גורמים חברתיים והתנהגותיות שונים ^3, יצאנו כדי להקים ולאמת את שיטות להפקה וניתוח של קוף רזוס שיער ^4. בהתבסס על ההנחה שהקורט נישא בדם משולב באיטיות וברציפות לשיער גדל, מטרת השיטה החדשה הייתה להשתמש ברמות של קורט שמקורם בשיער כמדד משולב של פעילות HPA על פני תקופות של שבועות עד חודשים.

כמה אתגרים מתודולוגיים נתקלו בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי. ראשית, מחקרים קודמים הראו כי o כמויות קטנותו במחזור הקורט מופרשים בזיעה וחלב ולכן יכול מעיל החיצוני של השיער פיר ^2. כדי לחסל לבלבל את הפוטנציאל הזה, פיתחנו הליך לשטוף קל שמופיע כדי להסיר קורט חיצוני עם השפעה מינימאלית על קורט נוכחת בתוך השערה הולך וגדל. לפיכך, קוף השיער נתון להליך זה (כלומר שתי שטיפות 3 דקות עם isopropanol) איבד כ 7-8% מכלל תוכן קורט שיער, ולשטוף שלישי הוסר פחות מ 1% יותר מסטרואידי המדגם ^4. נראה שיש קורט חיצוני יותר בשיער אנושי, שכן באותו ההליך הוסר ממוצע בסך הכל 27% תוכן קורט מהדגימות (ק רוזנברג וג' מאייר, לא פורסמו). כמו קוף שיער, לעומת זאת, שטיפה נוספת הכילה הרבה פחות קורט (כ -7%) מאשר שתי שטיפות הראשונות. לכן, תוצאות משני קוף ושיער אנושי לתמוך בטענה שרוב (אם לא כל) קורט החיצוני ניתן להסיר תוך שמירת frac גדולtion של קורט בתוך מטריצת השיער הפנימית. שנית, מחקרי הפיילוט שלנו הראו גם כי שחיקה השיער לפני מיצוי התאוששות קורט גדלה באופן משמעותי מהמדגם, ככל הנראה על ידי השבירה פתוחה המטריצה ​​חלבוניים המורכבת של השערה כמו גם להגדיל את השטח זמין לחדירת ממס. שתי שיטות שחיקה שונות פותחו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות. יש שיטה 1, אשר עושה שימוש בטחנת כדור, היתרון של ייצור האבקה הטובה ביותר. עם זאת, טחנת כדור היא פריט ציוד יקר יחסית, ואם משתמש עם צנצנות טחינה סטנדרטיות וכדורים, הוא מסוגל טחינה רק שתי דגימות בכל פעם. דגימות קטנות הן גם קשות לעבד באמצעות טחנת כדור עם צנצנות טחינה רגילות. השיטה 2, אשר משתמשת beadbeater, היא פחות יעילה ביכולת הטחינה שלו. כתוצאה מכך, התאוששות קורט ממוצעת היא כ 10% נמוך יותר בשיטה זו בהשוואה לטחנת הכדור (נתונים שלא פורסמו). מצד השני, beadbeaterהוא הרבה פחות יקר מאשר טחנת כדור, יכולות להיות קרקע 16-24 דגימות בפעם בהתאם לדגם, והשיטה היא גם מתאימה למדגמים קטנים. בשל התאוששות ההפרש שהוזכר לעיל, רצוי להשתמש באותה השיטה שחיקה עבור כל הדגימות במחקר מסוים.

ברגע שדגימות השיער עברו עיבוד, הם חולצו עם מתנול וקורט בתמציות הוא מנותח באמצעות ערכת EIA מסחרית רגישה וספציפית שנועדה במקור למדידת קורט רוק. נהלי החילוץ וassay אומתו בחלקו על ידי הוכחת כי דילולים סדרתי של תמציות מדגימות קוף שיער הניבו קריאות EIA שדומות מאוד לקריאות המתקבלות מסטנדרטים קורט אותנטיים. לאחר מכן, אנו הראו כי קורט שיער (בנוסף לפלזמה וקורט רוק) היה רגיש ללחץ הגדול בחיים של רילוקיישן מנדט מנהלי של הקופים לרבעוני דיור חדשות ^4,5. Presenנייר לא מספק תיאור מפורט של השיטות המשמשות באופן שיגרתי במעבדה שלנו לעבד את דגימות שיער אדם וקוף ולחלץ ולנתח קורט מדוגמאות כאלה.

Protocol

1. אוסף דוגמאות ואחסון

1. שיער אדם
   1. לאבטח את כל אורכו של השיער שנדגמו (עד לעיפרון ברוחב קוטר) עם גומייה או סיכה. שיער גזור קרוב לקרקפת ככל האפשר (נזהר שלא ניק העור) עם מספריים נקיים. הערה: שטח הדגימה הסטנדרטי הוא הקודקוד האחורי של הגולגולת.
   2. חוקרים אחדים דיווחו על ירידה ברמות קורט שיער אדם עם מרחק מהקרקפת ^6, אשר עשוי להיות בשל סחף מחשיפה חוזרת ונשנית למים ושמפו ⁷ (אם כי רואה Manenschijn et al. ⁸ ותומסון et al. ⁹ לתוצאות הפוכות ב שאין ירידה מגזרית נצפתה) כדי למזער את ההשפעה של "אפקט סחף" זה פוטנציאל, אנו ממליצים לאסוף מגזרי שיער הפרוקסימלי לקרקפת עם אורך שאינו עולה על 3 סנטימטר (בהנחת ששיעור צמיחה ממוצעת של 1 סנטימטר / חודש ^10, 3 קטע סנטימטר מכיל Cאורט שהופקד על פני 3 החודשים האחרונים כ). כדי להשיג זאת, יש להשתמש בסרגל כדי למדוד 3 סנטימטר מהחתך הראשון ולחתוך שוב להניב מדגם 3 סנטימטר. הערה: ברגע שהשיער נחתך לאורך, זה כבר לא נחוץ כדי לשמור על הגדילים ביישור אלא אם המחקר כרוך בחיתוך המדגם למקטעים ארוכים 1 סנטימטר נפרדים להקים לוח שנה רטרוספקטיבה של תצהיר קורט על פני תקופת הזמן לפני הדגימה ^6.
   3. מניחים את מדגם השיער בנרתיק עשוי מרדיד אלומיניום, מעטפת נייר נקייה או צינור 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן צנטריפוגות מהסוג המשמש לשטיפת מדגם. כמו הקורט הוא מאוד יציב בשיער ^2, ניתן לאחסן דגימות ללא הגבלה ב -20 מעלות צלזיוס ובמידת צורך, נשלחות לילה בטמפרטורת הסביבה.
   4. הליך איסוף שיער צריך להיות מתורגל על ​​מתנדבים והדגימות בפועל צריכה להישקל לפני היציאה למחקר מלא. שים לב: דגימות שיער כמו SMAll כ5-10 מ"ג ניתן לנתח באמצעות השיטות שתוארו כאן, למרות שזה רצוי לאסוף דגימות> 10 מ"ג כדי למזער את הסיכוי לקבלת קריאות EIA מתחת סטנדרטי הקורט הנמוך ביותר.
2. שיער קוף
   1. לגלח את השיער (100-250 מ"ג) מהעורף באמצעות גוזז בעלי חיים סטנדרטי. לגלח קרוב לעור ככל האפשר, נזהר שלא לפגוע בעור ולגרום לדימום בגלל רמות קורט דם הן גבוהות מאוד בהשוואה לאלה שנמצאו בשיער. הערה: אזור הצוואר נבחר לדגימה שגרתית משום שהוא בדרך כלל מקור טוב לשיער וניתן להבחין בקלות לצמיחה מחודשת שיער לפני הדגימה מחדש.
   2. מניחים את מדגם השיער בנרתיק עשוי מרדיד אלומיניום או צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן. יש לאחסן דגימות שיער קוף ונשלחו באותו אופן כפי שתואר לעיל עבור דגימות שיער אדם.
   3. בגלל קוף שיער, שלא כמו שיער קרקפת אדם, גדל לאורך מסוים ולאחר מכן stגדל ¹¹ אופים, זה בדרך כלל לא אפשרי במקרה זה להשתמש במרחק מהעור, כמו לוח שנה להפקדת קורט. עם זאת, אם בעלי חיים ניתן לדגום יותר מפעם אחת (לדוגמא, במהלך בחינות בריאות שגרתיות תקופתיות), רצוי לבצע גילוח ראשוני כדי לקבוע נקודת זמן תחילת המחקר ולאחר מכן reshave אותו האזור לאחר תקופת הזמן הרצויה שחלף. קורט במדגם השני הופקד במהלך הפסקת הגילוח-reshave, המאפשרת ייחוס מדויק של המדגם של תוכן קורט לפעילות HPA מעל המרווח ^ש5.

2. כביסה מדגם וייבוש

1. כביסה
   1. מניחים כל דגימת שיער לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר בורג יתר פוליפרופילן.
   2. הוסף 5 מיליליטר של כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים isopropanol כיתה (HPLC) על צינור אחד ואחריו היפוך חוזר ונשנה במשך 3 דקות באמצעות כתף.
   3. למזוג isopropanol לתוך מיכל פסולת, לוקח גהם לא לאבד את כל של המדגם.
   4. חזור על השלבים 2.1.2 ו 2.1.3 עוד פעם אחת.
2. יבוש
   1. ייבש את השיער לפחות 2-3 ימים על מנת להבטיח אידוי isopropanol מלא.

3. גריסה לדוגמא וקורט חליצה ​​- שיטת 1 עבור דגימות גדולות

1. טחינה לדוגמא
   1. הנח עד 250 מ"ג של שיער יבש לתוך 10 מיליליטר נירוסטה טחינת צנצנת יחד עם כדור נירוסטה 12 מ"מ בודד שחיקה.
   2. טוחנים את המדגם במשך 6 דקות במהירות של 25 הרץ באמצעות טחנת כדור.
   3. לשקול עד 50 מ"ג של אבקת שיער על איזון אנליטיים ולאחר מכן להעביר אותו לצינור microcentrifuge נקי 2.0 מיליליטר פוליפרופילן לחילוץ קורט לאחר מכן.
2. חילוץ קורט
   1. הוספת 1.0 מיליליטר של מתנול HPLC כיתה לצינור microcentrifuge המכיל את מדגם האבקה.
   2. שווי צינור דגירה המדגם עבור 18-24 שעות בטמפרטורת חדר עם שותףהיפוך nstant באמצעות כתף.
   3. צנטריפוגה הצינורות ב 14,000 סל"ד במשך 1 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה שיער האבקה.
   4. העבר 0.6 מיליליטר של supernatant לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מיליליטר, נזהר שלא להפריע גלולה של שיער אבקה.

4. גריסה לדוגמא וקורט חליצה ​​- שיטה 2 לדגימות קטנות

1. טחינה לדוגמא
   1. הנח עד 60 מ"ג של שיער לתוך צינור microcentrifuge preweighed 2 מיליליטר ברזל למכות חרוז.
   2. Reweigh הבקבוקון כדי להשיג את המשקל לדוגמא.
   3. הוסף שלושה חרוזים פלדת כרום 3.2 מ"מ לכל בקבוקון ולאחר מכן לטחון את המדגם לפחות 2 דקות במקצף חרוז. אם בדיקה חזותית מגלה כי המדגם נכתש מספיק, ולאחר מכן לבצע ליטוש נוסף ל0.5 או 1 דקות. שים לב: אין העברת שיער הקרקע שדרושה במקרה זה משום מיצוי קורט מתבצע באותו הבקבוקון כמו טחינה.
2. חילוץ קורט
   1. הוסף 1.5 מיליליטר של מתנול HPLC כיתה לצינור microcentrifuge המכיל את מדגם האבקה.
   2. שווי צינור דגירה המדגם עבור 18-24 שעות בטמפרטורת חדר עם היפוך מתמיד באמצעות כתף.
   3. צנטריפוגה הצינורות ב 10,000 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי גלולה שיער האבקה. הערה: חרוזים פלדת הכרום יישארו בצינור עם השיער במהלך שלבי המיצוי וצנטריפוגה, המהווה את מהירות צנטריפוגה נמוכה יותר בהשוואה לשיטת 1.
   4. העבר 1.0 מיליליטר של supernatant לצינור microcentrifuge נקי 1.5 מיליליטר, נזהר שלא להפריע גלולה של שיער אבקה.

5. אידוי ממס וכינונה מחדש לדוגמא

1. ייבש את מתנול או באמצעות מאייד ואקום או זרם של גז חנקן אם מאייד ואקום אינו זמין. אם נעשה שימוש במאייד ואקום, אדי מתנול יכולים להיות לכוד על ידי אמצעישל מלכודת קרה או מלכודת כימית מצוידות במחסנית פחם פעילה.
2. בעקבות סילוקו של מתנול, מחדש את תמצית הקורט בנפח מתאים של חיץ EIA assay (diluent assay). אם ערכי קורט גבוהים יחסית צפויים, ולאחר מכן להשתמש במאגר בנפח של 0.4 מיליליטר או יותר. אם ערכים נמוכים יחסית צפויים, ולאחר מכן את עוצמת הקול יכול להיות מופחת ל0.2 מיליליטר או פחות כדי להגביר את הרגישות. הערה: 0.2 מיליליטר הוא נפח מספיק כדי להפעיל aliquots הכפולים של המדגם לפחות פעמיים במקרה בשידור חוזר של המדגם הנדרש.
3. כך או assay המדגם מחדש מייד או להקפיא אותו ב-20 ° C לניתוח מאוחר יותר. הערה: אם המדגם מחדש קפוא, חשוב להימנע מסובלימציה במהלך תקופת ההקפאה מאז שינוי בנפח דגימה יוביל לערך קורט שווא כאשר החישובים הסופיים מבוצעים.

6. הקורט Assay ונתונים המרות

1. Assay תמציות שיער עבורקורט באמצעות immunoassay אנזים רגישות גבוהה ערכה (EIA). הערה: אם משתמש ברוק מסחרי ערכת הקורט EIA, בצע את המלצות היצרן כמפורט בהוספת ערכת פרט לכך שבדיקת הדגימות יהיו aliquots הכפולים של כל תמצית שיער מחדש במקום דגימות רוק.
2. הכן תמצית שיער בקרת איכות (QC) לשימוש בכל assay.
   1. לאסוף מספר דגימות שיער נוספים וגם לעבד אותם בנפרד כמו בשלבים 4.1 ו4.2 או בברכתם לעיבוד מדגם גדול כמו בשלבים 3.1 ו3.2.
   2. להתאדות הממס ולגבש מחדש את תמציות כמו בשלבים 5.1 ו5.2, ולאחר מכן בריכת תמציות מחדש מכמה דגימות בודדות או תקווינה.
   3. Aliquot נפח מתאים של נקווה לחלץ מחדש (למשל 0.10 מיליליטר) לתוך צינורות microcentrifuge בודדים ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר.
   4. הפשירו ולהפעיל aliquot QC אחד בשני עותקים בכל microplate immunoassay לספק refeלורנס ערך קורט לבדיקת האיכות של כל ריצה.
   5. מקדם התוך assay של השונות (CV; מוגדר כסטיית התקן מחולקת בממוצע של קבוצת ערכים לדוגמא) יכול להיות מחושב על ידי ניתוח 10-12 QC בארות באותה הריצה, ואילו ניתן לחשב בין assay קורות חיים באמצעות ערכי QC פני קבוצה של ריצות. אם תוכנת microplate הקורא של אחד מחשב את קורות חיים לבארות כפולות המייצגות את תמצית כל שיער, ולאחר מכן בשיטה חלופית לקביעת קורות חיים התוך assay היא לחשב את הממוצע של ערכי קורות חיים בודדים אלה על פני כל הצלחת.
   6. אם כל תמצית מדגם תשואות קריאה גדולה יותר מאשר תקן הקורט הגבוה ביותר בEIA, אז aliquot נוסף של התמצית מדולל עם כמות מתאימה של חיץ assay וקריאת EIA שלאחר מכן הוא תיקן לגורם לדילול. דוגמאות גם נתחו באופן שיגרתי, אם קורות החיים לבארות הכפולות הוא> 10%.
   7. בגלל ערכות הקורט EIA נועדו למדוד קורט values בדגימות נוזל כגון רוק או פלזמה, את הפלט של תוכנת microplate הקורא חייב להיות מומר לסכום של קורט לכל יחידת משקל של שיער אבקה. הנוסחה הבאה ממירה את פלט assay במיקרוגרם / ד"ל לקורט pg לשיער מ"ג:
      (A / B) * (C / D) * E * 10,000 = F
      בי = מיקרוגרם / ד"ל מתפוקת assay; B = משקל (במ"ג) של השיער חשוף למיצוי; C = כרך. (במ"ל) של מתנול מתווסף לשיער האבקה; D = כרך. (במ"ל) של מתנול התאושש מהתמצית ולאחר מכן התייבש למטה; E = כרך. (במ"ל) של חיץ assay משמש מחדש את התמצית מיובשת; ו= ערך סופי F של ריכוז קורט שיער בpg / מ"ג.

תוצאות

איור 1 מציג את התדפיס מקבוצה מייצגת של דגימות שיער אדם (גבר בוגר ונושאים אנושיים נשיים) מעובד בשיטה 2 שחיקה וחילוץ. תוכנת מחשב הייתה בשימוש כדי ליצור את פלט הנתונים ולהתאים עקומת sigmoidal 4 פרמטר לסטנדרטי הקורט (איור 2). קורות החיים בין היטב מצלחת זה נע 0.01-5...

Discussion

הליך קורט שיער שתואר לעיל הוא פשוט לביצוע, הוא זול יחסית, הופך את השימוש בכימיקלים זמינים, חומרים כימיים, ואספקה, ודורש ציוד זה, למעט במקרה אחד, עשוי להיות נוכח במעבדה האנליטית טיפוסית. יוצא מן הכלל הוא מנגנון שחיקה כגון טחנת כדור או מיני beadbeater. נציין כי חלק מקבוצות המח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2 mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10 ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12 mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Rotator for 15 ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipettor
Analytical balance