추출 및 인간과 원숭이의 머리에서 코르티솔 분석

요약

코르티솔 (CORT)은 인간과 인간이 아닌 영장류의 성장 머리 갱구에 축적. 우리는 높은 정밀도 및 감도로 머리 CORT를 추출하고 분석하는 방법을 설명합니다. 머리 CORT의 측정은 특히 개월 주 기간 동안 만성 스트레스를 평가하기에 적합합니다.

초록

스트레스 호르몬 코르티솔 (CORT)은 서서히 인간, 비인간 영장류, 그리고 다른 포유 동물의 성장 머리 샤프트​​에 통합됩니다. 우리는 개발과 검증 된 붉은 털 원숭이의 머리에서 CORT 추출 및 분석하는 방법을 연속적으로 인간의 두피 모발에 사용하기 위해이 방법을 적용. 플라즈마 또는 침에서 얻은 CORT "포인트 샘플"대조적으로, 머리 CORT 호르몬 결합의 기간 동안, 시상 하부 - 뇌하수체 - 부 신피질 (HPA) 시스템 활동의 통합 측정, 따라서 생리적 인 스트레스를 제공합니다. 사람의 두피에 머리가 1cm / 월의 평균 속도로 성장하고 있기 때문에, 머리 부분에서 얻은 CORT 수준의 길이는 몇 cm 잠재적 개월 수에 대한 경험이 스트레스의 바이오 마커 역할을 할 수 있습니다.

우리의 방법에서, 각 모발 샘플은 제 땀과 피지에서 증착 된 머리 샤프트​​의 외부로부터 어떠한 CORT 제거 이소프로판올에 두 번 세척한다. 건조 후,샘플은 모발 단백질의 행렬을 분해 및 추출을위한 표면적을 증가시키는 미세 분말로 분쇄된다. 모간의 내부로부터 CORT 메탄올로 추출하고, 메탄올을 증류 제거하고, 추출액을 분석 완충액에서 재구성된다. 추출 CORT, 표준 및 품질 관리와 함께, 다음 민감하고 특정 시판 효소 면역 측정법 (EIA) 도구에 의해 분석된다. EIA의 판독은 MG 분말 머리 무게 당 PG의 CORT으로 변환됩니다. 이 방법은 인간의 머리 CORT을 분석하기 위해 실험실에서 사용 된, 짧은 꼬리 원숭이, 명주 원숭이, 개, 그리고 북극곰의 몇몇 종. 우리가 실험실에서와 다른 연구 그룹 모두에서 많은 연구가 자연에 만성 스트레스에 노출을 평가뿐만 아니라 실험실 설정에 대한 머리 CORT의 광범위한 적용 가능성을 증명하고있다.

서문

혈장, 타액, 또는 때때로 소변이나 대변의 CORT 측정 스트레스 ¹ HPA 축의 역할 Selye 디스커버리시기 생리적 스트레스의 지표로서 사용되었다. 수많은 논문이 급성 스트레스 상황에 HPA 활동과 관련된 발행되었지만, 필드는 만성 생리적 스트레스 간단하고 신뢰성 지수의 부족에 의해 방해되었다. 이 문제가 발생주기 차이가있을 수있는 환경 교란에 의해 혼동 될 수 HPA 활동의 플라즈마 침 수율 모두 "포인트"예상하기 때문이다. 오줌과 배설물 샘플 어떤 경우에는 하루 종일까지 시간의 숫자에 걸쳐 CORT 및 / 또는 대사 산물의 배설의 측정 값을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이들 접근법 중 어느 것도 HPA 활성의 진정한 장기 인덱스 및이 싸이의 응답 성을 제공하지 않는다; 이러한 행렬들의 임의 시간 경과 CORT 레벨의 거친 지수를 제공 할 수있다하여 여러 샘플의 컬렉션만성 스트레스에 줄기.

머리에 CORT를 측정하는 것은 스트레스 문학이 중요한 필요를 채우기 위해 시작했다. 여러 실험실에 의한 초기 연구는 인간의 머리에 CORT의 존재를 증명하지만, 머리 CORT 수준이 스트레스 ^2의 함수로 변경 여부를 조사하지 않았다. 우리 연구실은 다양한 사회 및 행동 요인 ^(3)에 의해 붉은 털 원숭이 HPA 축 조절에 몇 년 동안 관심이있다, 우리는 붉은 털 원숭이 머리 ^4의 추출 및 분석을위한 방법을 설정하고 확인하기 위해 밖으로 설정합니다. 혈액 유래 CORT 천천히 연속적으로 성장하는 모발에 혼입되는 것을 전제로,이 새로운 방법의 목적은 개월 주내 걸쳐서 HPA 활성의 통합 지표로서 헤어 유래 CORT 수준을 사용하는 것이었다.

몇 가지 방법 론적 문제는 본 프로토콜 개발에 발견되었습니다. 첫째, 이전의 연구는 적은 양의 O를 표시했다F 땀과 피지에 배설 CORT을 순환하기 때문에 코트 머리 축 ^(2)의 외부를 할 수 있습니다. 이러한 잠재적 혼동을 제거하기 위해, 우리는 성장 모간 내에 존재 CORT에 최소한의 효과를 가지면서 외부 CORT 제거 나타나는 온화한 세척 과정을 개발 하였다. 따라서,이 절차 (이소프로판올, 즉 두 개의 3 분 세척) 실시 원숭이 머리 전체 머리 CORT 내용의 약 ~ 8 %를 손실 및 제 3 세척 샘플 ^4에서 1 % 미만의 더 많은 스테로이드를 제거했습니다. 같은 절차 (게시되지 않은 K. 로젠버그와 J. 마이어) 샘플에서 27 % 총 CORT 콘텐츠의 평균을 제거하기 때문에, 사람의 모발에 더 많은 외부 CORT이있을 나타납니다. 원숭이 머리를 좋아하지만, 추가 세척은 처음 두 세척보다 훨씬 적은 CORT (약 7 %)가 포함되어 있습니다. 따라서, 원숭이 및 사람의 모발 양의 결과가 주요 골절을 유지하면서, 대부분 (전부는 아니더라도) 외부 CORT가 제거 될 수 있다는 논쟁을 지원내부 헤어 매트릭스 내에서 CORT의 기. 둘째, 우리의 파일럿 연구는 또한 보여 주었다 아마도 모간의 복합 단백질 성 매트릭스를 오픈 침입뿐만 아니라 용매의 침투 가능한 표면 면적을 증가시킴으로써, 샘플에서 유의하게 증가 COR​​T 회수를 추출하여 모발 전에 연삭. 두 개의 서로 다른 연삭 방법은 장점과 단점을 각각 개발되었다. 볼 밀을 사용하여 방법 1, 각종 분말을 제조하는 장점을 갖는다. 그러나, 볼 밀은 비교적 고가의 장비 아이템이며 표준 연삭 항아리와 볼을 사용하는 경우, 한 번에 두 개의 시료를 분쇄 할 수있다. 작은 샘플도 표준 연삭 항아리와 볼 밀을 사용하여 처리하기가 어렵습니다. beadbeater을 사용하는 방법 2, 그것의 분쇄 능력에 덜 효과​​적이다. 결과적으로, 보통 CORT 복구는 볼밀 (미공개 데이터)와 비교하여이 방법을 사용하여 약 10 % 낮다. 한편, beadbeater상당히 저렴 볼밀보다, 16-24 번 샘플은 모델에 따라에서 접지 될 수 있고, 상기 방법은 작은 샘플에 매우 적합하다. 때문에 상기 차동 회복, 그것은 특정 연구 내 모든 샘플에 대해 동일한 연삭 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

모발 샘플을 처리 한 후, 그들은 원래 타액 CORT을 측정하기위한 민감하고 특정 상용 EIA 키트에 의해 분석된다 추출한 메탄올 CORT로 추출된다. 추출 및 분석 절차는 원숭이의 머리 샘플에서 추출의 시리얼 희석 밀접 본격적인 CORT 표준에서 얻은 측정 값을 병렬 EIA 수치를 산출 시연에 의해 부분적으로 확인되었다. 우리는 그 (플라즈마 및 타액 CORT) 외에도 헤어 CORT 새로운 주택 분기 ^4,5 원숭이의 관리 상 의무 재배치의 주요 생활 스트레스에 민감한 것으로 나타났다. 프리젠T 종이는 인간과 원숭이의 머리 샘플을 처리하고 이러한 샘플에서 CORT를 추출하고 분석하기 위해 실험실에서 일상적으로 사용되는 방법에 대한 자세한 계정을 제공합니다.

프로토콜

1. 시료 채취 및 보관

1. 사람의 모발
   1. 고무 밴드 나 클립 (직경 연필 폭까지) 샘플링 할 수있는 머리의 전체 길이를 고정합니다. 최대한 두피에 가깝게 잘라 머리 깨끗한 가위 (닉은 피부를 돌보는). 주 : 표준 샘플링 에리어가 두개골의 후방 정점이다.
   2. 일부 연구자들은 비록 볼 Manenschijn 등. ⁸ (물과 샴푸 ⁷ 반복 노출에서 유실로 인해 수 있습니다 두피 ^6에서 거리를 가진 사람의 모발의 CORT 수준의 감소를보고 반하는 결과를 톰슨 등. ^9있다 더 분절 하락이 잠재적 인 "유실 효과"의 영향을 최소화하기 위해) 관찰 된, 우리는 1cm / 월 ^(10)의 평균 성장률을 가정 3cm (,보다 더 큰 길이 두피에 인접 머리 세그먼트를 수집하는 것이 좋습니다 3cm 세그먼트는 C를 포함약 지난 3 개월 동안 퇴적 된 ORT). 이 작업을 수행하려면 첫 번째 컷에서 3cm를 측정하고 3cm 샘플을 얻을 다시 잘라 통치자를 사용합니다. 참고 : 머리 길이로 절단되면,이 연구는 이전의 샘플링 기간 동안 CORT 증착의 회고 일정을 설정하는 별도의 1cm 긴 세그먼트로 샘플을 절단 포함하지 않는 정렬 가닥을 유지하기 위해 더 이상 필요 ^6.
   3. 알루미늄 호일, 깨끗한 종이 봉투, 또는 샘플 세척에 사용되는 유형의 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브로 만든 주머니에 머리카락 샘플을 놓습니다. CORT ^모발이 매우 안정되어 필요한 경우, 시료는 주위 온도에서 밤새 발송, -20 ° C에서 무기한으로 저장 될 수있다.
   4. 머리 수집 절차는 자원 봉사자에 연습을해야하고 연습 샘플은 전체 연구에 착수하기 전에 고려되어야한다. 참고 : SMA로 머리 샘플을그것은 낮은 CORT 표준 이하 EIA 판독을 얻는 가능성을 최소화하기 위해 샘플을> 10 ㎎을 수집하는 것이 바람직하지만 LL 5-10 MG로서, 여기에 기술 된 방법을 사용하여 분석 할 수있다.
2. 원숭이 머리
   1. 표준 동물 클리퍼를 사용하여 목의 목덜미에서 머리 (100 ~ 250 mg)을 면도. 가능한 한 피부에 가까운 면도 피부가 닉에주의하면서 혈액 CORT 수준이 머리에있는 사람에 비해 매우 높기 때문에 출혈의 원인이됩니다. 참고 : 일반적으로 머리의 좋은 소스와 쉽게 이전 리샘플링에 머리 재성장을 관찰 할 수 있기 때문에 목 부분이 일상적인 샘플링을 위해 선택되었다.
   2. 알루미늄 호일 또는 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브로 만든 주머니에 머리카락 샘플을 놓습니다. 원숭이 머리 샘플을 저장하고 사람의 모발 샘플에 대해 전술 한 바와 같이 동일한 방식으로 발송한다.
   3. 원숭이 머리, 사람의 두피 모발과는 달리, 세인트 다음 특정 길이로 성장하고 있기 때문에^(11)을 성장 본부, 그것은 CORT 증착 달력으로 피부로부터의 거리를 사용하는 것,이 경우 일반적으로 가능하지 않다. 동물 추가 (주기적 루틴 건강 시험 동안, 예를 들어) 번 이상을 샘플링 할 수있는 경우에는 그 기준 시점을 설정하고, 원하는 시간 기간이 경과 한 후에 동일한 면적 reshave하는 초기 면도를 수행하는 것이 바람직하다. 두 번째 샘플에 CORT는 그 간격을 ⁵ 이상 HPA 활동에 샘플의 CORT 내용의 정확한 원인 규명을 허용하는 면도-reshave 간격 동안에 퇴적되었다.

2. 샘플 세탁 및 건조

1. 세탁
   1. 15 ML 스크류 캡 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브에 각 머리 샘플을 놓습니다.
   2. 회 전자를 사용하여 3 분 동안 반복 반전이어서 각 튜브에 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)상의 이소프로판올 5 ㎖를 추가.
   3. C를 복용, 폐기물 용기에 이소프로판올을 가만히 따르다샘플 중 하나를 잃을 수 없습니다.
   4. 반복 2.1.2과 2.1.3 번 더 반복합니다.
2. 건조
   1. 전체 이소프로판올 증발을 보장하기 위해 최소 2 ~ 3 일 머리를 건조.

3. 샘플 연마 및 CORT 추출 - 큰 샘플을위한 방법 1

1. 샘플 연삭
   1. 스테인레스 스틸은 하나의 12mm 스테인레스 스틸 연마 공 함께 항아리 연삭 10 ㎖에 말린 머리카락의 250 밀리그램까지 넣습니다.
   2. 볼 밀을 사용하여 25 ㎐의 속도로 6 분 동안 샘플을 분쇄.
   3. 분석 저울 가루 머리의 50 밀리그램까지 달아 후속 CORT 추출을 위해 깨끗하고 2.0 ㎖의 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 관에 전송합니다.
2. CORT 추출
   1. 분말 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관에 HPLC 급 메탄올 1.0 ML를 추가합니다.
   2. 관 모자와 공동 실온에서 18 ~ 24 시간 동안 샘플을 품어회 전자를 사용하여 nstant 반전.
   3. 가루 모발 펠렛을 실온에서 1 분 동안 14,000 rpm에서 원심 분리 튜브.
   4. 분말 머리의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 1.5 ML microcentrifuge 관에 뜨는의 0.6 ML을 전송합니다.

4. 샘플 연마 및 CORT 추출 - 작은 샘플에 대한 방법 2

1. 샘플 연삭
   1. 구슬 구타를위한 강화 된 preweighed 2 ㎖ microcentrifuge 관에 머리의 60 밀리그램까지 넣습니다.
   2. 샘플 중량을 구하는 바이알을 닫고 다시 무게를 측정한다.
   3. 각각의 병에 세 3.2 mm 크롬 강철 구슬을 추가 한 다음 비드 비터 적어도 2 분 동안 샘플을 갈기. 육안 검사는 시료가 충분히 분쇄 것을 알 경우, 0.5 또는 1 분 동안 추가로 연삭을 수행합니다. 참고 : CORT 추출은 연삭과 같은 바이알에서 수행되기 때문에 접지 머리 관련 전달이 경우에는 필요하지 않다.
2. CORT 추출
   1. 분말 샘플을 포함하는 microcentrifuge 관에 HPLC 급 메탄올 1.5 ML를 추가합니다.
   2. 튜브를 모자와 회 전자를 사용하여 일정한 반전과 실온에서 18 ~ 24 시간 동안 샘플을 품어.
   3. 가루 모발 펠렛을 실온에서 5 분 동안 10,000 rpm에서 원심 분리 튜브. 참고 : 크롬 강철 구슬 방법 1에 비해 낮은 원심 분리 속도를 차지하고있는, 추출 및 원심 분리 단계에서 머리와 튜브에 남아 있습니다.
   4. 분말 머리의 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 깨끗한 1.5 ML microcentrifuge 관에 뜨는의 1.0 ML을 전송합니다.

5. 용매 증발 및 샘플의 재구성

1. 진공 증착을 사용할 수없는 경우에는 진공 증착이나 질소 가스 스트림을 사용하여 메탄올을 말린다. 진공 증착 장치를 사용하는 경우, 메탄올은 수증기에 의해 포획 될 수있다콜드 트랩이나 활성탄 카트리지 탑재 화학 트랩.
2. 메탄올의 제거 후, ​​EIA 분석 버퍼 (분석 희석제)의 적절한 볼륨 CORT 추출물을 재구성. 비교적 높은 CORT 값이 예상되는 경우, 0.4 밀리리터 이상의 버퍼 볼륨을 사용한다. 비교적 낮은 값이 예상되는 경우, 볼륨 감도를 높이기 위해 0.2 밀리리터 이하로 감소 될 수있다. 참고 : 0.2 ㎖에 시료의 재방송이 필요한 경우에 최소한 두 번 샘플의 중복 분주을 실행하기에 충분한 양이다.
3. 즉시 재구성 샘플을 분석 실험 이후 분석을 위해 -20 ° C에서 그것을 동결​​ 하나. 주 : 재구성 된 샘플을 냉동 경우, 샘플 볼륨 변경 이후 동결 기간 동안 승화을 방지하기 위해 중요한 것은 최종 계산이 수행되는 거짓 CORT 값으로 이어질 것입니다.

6. CORT 분석 및 데이터 변환

1. 를 머리 추출물을 분석CORT은 고감도 효소 면역 측정법 (EIA) 키트를 사용. 참고 : 시료 중복 각 재구성 헤어 추출물의 분주 대신 타액됩니다 것을 제외 키트 삽입에 지정된 CORT EIA 키트 상업 타액을 사용하는 경우, 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
2. 모든 분석에서 사용하기위한 품질 관리 (QC)의 머리에 키스를 준비합니다.
   1. 여분의 모발 샘플 개수를 수집하고 어느 단계 4.1 및 4.2 단계 3.1 및 3.2에있는 큰 샘플 처리를 풀 같이 개별적으로 처리합니다.
   2. 용매를 증발시키고, 단계 5.1 및 5.2에서와 같이 추출물을 재구성하고 여러 개의 개별 또는 합동 샘플에서 재구성 된 추출물을 풀.
   3. 개별 마이크로 원심 튜브에 모아 재구성 추출물 (예를 들어, 0.10 ㎖)의 적절한 볼륨을 나누어지는하고 나중에 사용하기 위해 냉동.
   4. 해동 및 REFE를 제공하기 위해 각 면역 마이크로에 중복 한 QC 나누어지는 실행각 런의 품질 검사를 위해 CORT 값 rence.
   5. 변동 (CV; 샘플 값의 집합의 평균으로 나눈 표준 편차로 정의)의 인트라 분석 계수는 분석 간 CV가 계산 될 수있는 반면, 동일한 런 10-12 QC 웰을 분석하여 산출 할 수있다 런 그룹 걸쳐 QC 값을 사용. 하나의 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어가 각 머리 추출물을 나타내는 중복 웰 대해 CV를 계산하면, 다음 인트라 분석 CV를 결정하기위한 다른 방법은, 전체 판에 걸쳐 그 각각의 CV 값의 평균값을 계산하는 것이다.
   6. 모든 시료 추출물 EIA에서 가장 높은 CORT 표준보다 읽고 더를 산출하면, 추출물의 또 다른 분취 액을 분석 완충액의 적당량으로 희석하고 후속 EIA 판독은 희석 계수에 대해 보정된다. 중복 우물 CV가> 10 % 인 경우 샘플은 또한 정기적으로 다시 분석된다.
   7. CORT EIA 키트는 CORT VA를 측정하도록 설계되어 있기 때문에매독 타액이나 플라즈마 등의 액체 샘플에서, 마이크로 플레이트 리더 소프트웨어의 출력은 분말 머리의 단위 중량 당 CORT의 양으로 변환해야합니다. 다음 수식은 MG 머리 당 PG의 CORT에 ㎍ / DL에서 분석 출력을 변환합니다 :
      (A / B) * (C / D) * E * 10000 = F
      여기서 분석 출력에서​​ A = ㎍ / DL, 추출하고, 머리의 B = 체중 (밀리그램), C = 권. 메탄올 (ml의)는 분말 머리에 추가, D = 권. 추출물에서 발견 한 이후에 아래로 건조 메탄올 (ml 중), E = 권. 건조 된 추출물을 재구성하는 데 사용되는 분석 버퍼 (ML에) 및 PG / MG 헤어 CORT 농도의 F는 = 최종 값.

결과

그림 1은 방법 2 분쇄 및 추출을 사용하여 처리 사람의 모발 샘플 (성인 남성과 여성의 인체)의 대표 세트의 출력을 보여줍니다. 컴퓨터 소프트웨어는 데이터 출력을 생성하고 CORT 표준에 4 - 파라미터 S 자형 곡선 (도 2)을 맞추기 위해 사용되었다. 이 판의 사이에 잘​​ CVS는 0.01-5.73 %에서 1.34 %의 평균 내부 분석 CV와 함께였다. 분석 간 CV는 4.41 % 아홉 최근 인간의 머리카락...

토론

전술 한 헤어 CORT 절차 수행하도록 심플 상대적으로 저렴하고, 쉽게 이용할 화학 시약 및 소모품의 사용을하게하고, 한 가지 예외 전형적인 분석 실험실에 존재할 가능성이 있다고, 장비를 필요로한다. 예외는 볼밀 미니 beadbeater 같은 연마 장치이다. 우리는 몇 가지 연구 그룹은 작은 조각 길이 ¹² 대략 1mm에 머리 샘플을 말하다 있습니다,하지만 우리는 연삭 수행하는 대신 가능하면 닦지 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2 mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10 ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12 mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Rotator for 15 ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipettor
Analytical balance