Extração e Análise de Cortisol de cabelo humano e do macaco

Resumo

O cortisol (CORT) acumula-se no eixo do crescimento de cabelo de humanos e primatas não-humanos. Nós descrevemos métodos para extrair e analisar CORT cabelo com alta precisão e sensibilidade. Medição de cabelo CORT é particularmente bem adequado para a avaliação de stress crónico durante períodos de semanas a meses.

Resumo

O hormônio do estresse cortisol (CORT) está lentamente incorporado no eixo do cabelo crescente de seres humanos, primatas não-humanos e outros mamíferos. Temos desenvolvido e validado um método para extração e análise de CORT cabelo macaco rhesus e, posteriormente adaptado este método para uso com cabelo do couro cabeludo humano. Em contraste com CORT "amostras pontuais" obtidos a partir de plasma ou saliva, cabelo CORT fornece uma medida integrada da atividade do sistema hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA), e, assim, o estresse fisiológico, durante o período de hormônio de incorporação. Porque o cabelo do couro cabeludo humano cresce a uma taxa média de 1 cm / mês, os níveis de CORT obtidos a partir de segmentos de cabelo várias cm de comprimento pode potencialmente servir como um biomarcador de estresse experimentado ao longo de vários meses.

No nosso método, cada amostra de cabelo é lavado primeiro duas vezes em isopropanol, para remover qualquer CORT a partir do exterior da haste do cabelo que foi depositada a partir de suor ou de sebo. Após a secagem, oamostra é moída a um pó fino, para quebrar a proteína da matriz do cabelo e aumentar a área de superfície para a extracção. CORT a partir do interior da haste do cabelo é extraído em metanol, o metanol é evaporado, e o extracto é reconstituída em tampão de ensaio. Extraído CORT, juntamente com padrões de qualidade e, em seguida, é analisada por meio de um imunoensaio de enzima disponível comercialmente sensível e específico kit (EIA). Leitura do EIA é convertido em CORT pg por mg de peso cabelo em pó. Este método tem sido utilizado em nosso laboratório para analisar CORT cabelo em humanos, várias espécies de macacos, sagüis, cães e ursos polares. Muitos estudos, tanto do nosso laboratório e de outros grupos de pesquisa demonstraram a ampla aplicabilidade da CORT cabelo para avaliar a exposição ao estresse crônico no natural, bem como as configurações de laboratório.

Introdução

Medição de CORT no plasma, saliva, ou, ocasionalmente, na urina ou fezes tem sido utilizada como um índice de stress fisiológico desde a descoberta do papel do eixo HPA em tensão ¹ de Selye. Embora inúmeros artigos têm sido publicados relativos atividade HPA a situações estressantes de forma aguda, o campo tem sido dificultada pela falta de um índice simples e confiável de estresse fisiológico crônica. Este problema surge porque plasma e saliva tanto rendimento "Ponto" estimativas da actividade HPA que estão sujeitas a variação circadiana e podem ser confundidos por distúrbios ambientais. Amostras urinária e fecal produzir medidas de CORT e / ou eliminação de metabolito que abrangem um número de horas até um dia inteiro em alguns casos. Recolha de amostras múltiplas, utilizando qualquer uma destas matrizes podem fornecer um índice composto bruto de níveis CORT ao longo do tempo, no entanto, nenhuma destas abordagens fornece um índice verdadeiramente de longa duração de actividade HPA e a capacidade de resposta deste sydeter a estressores crônicos.

Medindo CORT no cabelo começou a preencher esta necessidade importante na literatura stress. Estudos iniciais por vários laboratórios demonstrou a presença de CORT em cabelo humano, mas não se investigar se os níveis de CORT cabelo alterado como uma função da tensão ^2. Como o nosso laboratório tem se interessado por muitos anos na regulação do eixo HPA macaco rhesus por vários fatores sociais e comportamentais ^3, nos propusemos a estabelecer e validar métodos para extração e análise de cabelo macaco rhesus ^4. Com base na premissa de que CORT proveniente do sangue é lenta e continuamente incorporadas no crescimento do cabelo, o objectivo deste novo método é a utilização dos níveis de CORT derivado de cabelo como um índice de actividade HPA integrada ao longo de períodos de semanas a meses.

Vários desafios metodológicos foram encontrados no desenvolvimento do presente protocolo. Em primeiro lugar, os estudos anteriores tinham mostrado que as pequenas quantidades of circulando CORT são excretados no suor e sebo e, portanto, poderia revestir a parte externa do fio de cabelo ^2. A fim de eliminar este confundir potencial, desenvolvemos um procedimento de lavagem suave que aparece para remover CORT externo, tendo um efeito mínimo sobre CORT presentes na crescente eixo do cabelo. Assim, o cabelo macaco submetidos a este procedimento (ou seja, duas lavagens de 3 min, com o isopropanol) perdeu cerca de 7-8% do teor total de CORT cabelo, e uma terceira lavagem removido menos de 1% a mais de esteróides a partir da amostra ^4. Parece haver CORT mais externo em cabelo humano, uma vez que o mesmo procedimento removeu uma média do conteúdo total CORT 27% das amostras (K. Rosenberg e J. Meyer, ainda não publicados). Como o cabelo macaco, no entanto, uma lavagem adicional contido muito menos CORT (cerca de 7%) do que as duas primeiras lavagens. Portanto, os resultados de ambos macaco e cabelo humano apoiar a afirmação de que a maioria (se não todos) CORT externo pode ser removido, mantendo uma grande fracção de CORT dentro da matriz do cabelo interna. Em segundo lugar, os nossos estudos piloto também mostraram que a moagem do cabelo antes da extracção aumentou significativamente a recuperação CORT a partir da amostra, presumivelmente ao romper a matriz proteica complexa do eixo do cabelo, bem como aumentando a área de superfície disponível para a penetração do solvente. Foram desenvolvidos dois métodos de moagem diferentes, cada um deles com vantagens e desvantagens. Método 1, que utiliza um moinho de bolas, tem a vantagem de produzir o pó fino. Contudo, num moinho de esferas é um item de equipamento relativamente dispendioso e, se utilizado com frascos de moagem convencionais e as esferas, que é capaz de moer somente duas amostras de cada vez. As amostras pequenas são também difíceis de processar utilizando um moinho de bolas com frascos de moagem convencionais. Método 2, que utiliza uma beadbeater, é menos eficaz na sua capacidade de moagem. Como resultado, a recuperação média CORT é aproximadamente 10% menor usando este método em comparação com o moinho de bolas (dados não publicados). Por outro lado, um beadbeateré consideravelmente menos dispendiosa do que um moinho de bolas, 16-24 amostras podem ser moídos em uma vez, dependendo do modelo, e o método é adequado para pequenas amostras. Devido à recuperação diferencial acima mencionado, é aconselhável utilizar o mesmo método de moagem para todas as amostras de um determinado estudo.

Uma vez que as amostras de cabelo foram processados, eles são extraídos com metanol e CORT nos extractos são analisados ​​por meio de um kit comercial de EIA sensível e específico originalmente concebido para medir CORT salivar. Os procedimentos de extração e ensaio foram validados em parte, demonstrando que diluições em série de extratos de amostras de cabelo macaco rendeu leituras de AIA que se assemelhavam de perto as leituras obtidas a partir de padrões de CORT autênticos. Em seguida, mostrou que CORT cabelo (além de plasma e saliva CORT) foi sensível à grande estressor vida de uma deslocalização administrativamente mandato dos macacos para novos bairros habitacionais ^4,5. O present documento fornece uma descrição detalhada dos métodos utilizados rotineiramente em nosso laboratório para processar amostras de cabelo humano e de macaco e extrair e analisar CORT de tais amostras.

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Protocolo

1. Coleta de Amostras e Armazenamento

1. Cabelo humano
   1. Fixar a todo o comprimento do cabelo a ser amostrado (até um lápis de largura em diâmetro) com uma faixa de borracha ou clipe. Cortar o cabelo o mais próximo possível do couro cabeludo possível (tomando cuidado para não cortar a pele) com um pano limpo tesoura. Nota: A área de amostragem padrão é o vértice posterior do crânio.
   2. Alguns investigadores relataram um declínio nos níveis de CORT cabelos humanos com a distância do couro cabeludo ^6, que pode ser devido à lavagem da exposição repetida à água e shampoo ⁷ (apesar de ver Manenschijn et al. ⁸ e Thomson et al. ⁹ para resultados contrários em que não houve declínio segmentar) Para minimizar o impacto desse potencial "efeito washout", recomendamos a coleta de segmentos proximal cabelo no couro cabeludo com um comprimento não superior a 3 cm (assumindo uma taxa de crescimento média de 1 cm / mês ^10, um 3 centímetros segmento contém CTRO que foi depositado ao longo de aproximadamente os últimos 3 meses). Para isso, use uma régua para medir 3 cm do primeiro corte e cortar novamente para produzir a amostra de 3 cm. Observação: Uma vez que o cabelo foi cortado em comprimento, que não é mais necessária para manter os fios no alinhamento, a menos que o estudo envolve o corte da amostra em diferentes segmentos de 1 cm de comprimento para estabelecer um calendário retrospectiva de deposição CORT durante o período de tempo antes da amostragem ^6.
   3. Colocar a amostra de cabelo de uma bolsa feita de folha de alumínio, um envelope de papel limpa, ou a cerca de 15 ml com tampa de rosca de polipropileno tubo de centrífuga do tipo usado para a lavagem da amostra. Como CORT é extremamente estável no cabelo ^2, as amostras podem ser armazenadas indefinidamente a -20 ° C e, se necessário, enviado durante a noite à temperatura ambiente.
   4. O procedimento de coleta de cabelo deve ser praticado de voluntários e as amostras de prática devem ser pesados ​​antes de embarcar em um estudo completo. Nota: As amostras de cabelo como small como 5-10 mg podem ser analisadas utilizando os métodos descritos aqui, embora seja desejável para recolher amostras de> 10 mg para minimizar a probabilidade de obtenção de leituras EIA abaixo do mais baixo nível CORT.
2. Cabelo macaco
   1. Raspar o cabelo (100-250 mg) a partir da nuca usando um cortador de animais padrão. Raspar o mais próximo da pele quanto possível, tomando cuidado para não nick a pele e causar sangramento, porque os níveis de CORT sangue são extremamente elevados em relação aos encontrados no cabelo. Nota: A área do pescoço foi escolhido para a amostragem de rotina, porque geralmente é uma boa fonte de cabelo e pode ser facilmente observada para o crescimento do cabelo antes de reamostragem.
   2. Coloque a amostra de cabelo em uma bolsa feita de folha de alumínio ou a 15 ml com tampa de rosca de polipropileno tubo de centrífuga. As amostras de cabelo do macaco devem ser armazenados e transportados da mesma maneira como acima descrito para as amostras de cabelo humano.
   3. Porque o cabelo macaco, ao contrário de cabelo do couro cabeludo humano, cresce a um determinado período e depois ruaops crescimento ^11, que não é geralmente possível, neste caso, ao usar a distância a partir da pele como um calendário para a deposição CORT. No entanto, se um animal pode ser amostrado mais do que uma vez (por exemplo, durante os exames periódicos de saúde de rotina), é desejável efectuar uma barbear inicial para definir um ponto de tempo de linha de base e, em seguida, reshave a mesma área, após o período de tempo desejado tenha decorrido. CORT na segunda amostra foi depositada durante o intervalo de barbear-reshave, o que permite uma atribuição precisa de conteúdo CORT da amostra a atividade do eixo HPA durante esse intervalo de ^5.

2. Lavar Sample e Secagem

1. Lavagem
   1. Coloque cada amostra de cabelo para a 15 ml com tampa de rosca de polipropileno tubo de centrífuga.
   2. Adicionar 5 ml de cromatografia líquida de alta eficiência de isopropanol (HPLC) de grau para cada tubo seguido por inversão repetida durante 3 minutos usando um rotor.
   3. Decantar o isopropanol em um recipiente de resíduos, tendo csão para não perder qualquer da amostra.
   4. Repita os passos 2.1.2 e 2.1.3, mais uma vez.
2. Secagem
   1. Seca-se o cabelo, durante pelo menos 2-3 dias para assegurar a evaporação completa isopropanol.

3. Moagem de amostras e CORT Extração - Método 1 para amostras grandes

1. Amostra de moagem
   1. Colocar-se a 250 mg de cabelo seco em 10 ml de aço inoxidável de moagem frasco, juntamente com uma única bola de moagem de aço inoxidável de 12 mm.
   2. Moer a amostra durante 6 min a uma velocidade de 25 Hz, utilizando um moinho de bolas.
   3. Pesar até 50 mg de cabelo em pó em uma balança analítica e, em seguida, transferi-lo para um 2,0 ml de polipropileno tubo de microcentrífuga limpo para extração CORT subseqüente.
2. Extração CORT
   1. Adicionar 1,0 ml de metanol de grau HPLC para o tubo de microcentrífuga contendo a amostra em pó.
   2. Tapar o tubo e incubar a amostra durante 18-24 horas à temperatura ambiente com o coinversão nstant usando um rotor.
   3. Centrifugar os tubos a 14.000 rpm durante 1 min à temperatura ambiente para sedimentar o cabelo em pó.
   4. Transferir 0,6 ml do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo, tomando cuidado para não perturbar o pellet de cabelo em pó.

4. Moagem de amostras e CORT Extração - Método 2 para pequenas amostras

1. Amostra de moagem
   1. Coloque até 60 mg de cabelo em um pré-pesado 2 ml tubo de microcentrífuga talão reforçado para bater.
   2. Pesar novamente o frasco para obter o peso da amostra.
   3. Adicionar três esferas de aço cromo 3,2 milímetros a cada frasco e depois moer a amostra durante pelo menos 2 minutos num batedor de esferas. Se a inspeção visual revela que a amostra não é suficientemente pulverizado, em seguida, executar moagem adicional para 0,5 ou 1 min. Nota: A transferência do cabelo chão é necessário neste caso, pois a extracção CORT é realizada no mesmo frasco, como moagem.
2. Extração CORT
   1. Adicionar 1,5 ml de metanol de grau HPLC para o tubo de microcentrífuga contendo a amostra em pó.
   2. Tapar o tubo e incubar a amostra durante 18-24 horas à temperatura ambiente, com inversão constante usando um rotor.
   3. Centrifugar os tubos a 10.000 rpm durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar o cabelo em pó. Nota: As esferas de aço cromo permanecer no tubo com o cabelo durante os passos de extracção e centrifugação, que representa a velocidade de centrifugação mais baixa em comparação com o método 1.
   4. Transferir 1,0 ml do sobrenadante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpo, tomando cuidado para não perturbar o pellet de cabelo em pó.

5. A evaporação do solvente e da Amostra Reconstituição

1. Seca-se o metanol utilizando um evaporador de vácuo ou de uma corrente de azoto gasoso, se um evaporador de vácuo não está disponível. Se um evaporador de vácuo é utilizada, o vapor de metanol pode ser presa por meiosde uma câmara de frio ou uma armadilha químico equipado com um cartucho de carvão ativado.
2. Após a remoção do metanol, reconstituir o extracto CORT num volume apropriado de tampão de ensaio EIA (ensaio de diluente). Se os valores relativamente altos de CORT são antecipados, então, usar um volume de tampão de 0,4 ml ou mais. Se os valores relativamente baixos estão previstos, em seguida, o volume pode ser reduzido para 0,2 ml ou menos para aumentar a sensibilidade. Nota: 0,2 ml de volume é suficiente para executar aliquotas duplicadas da amostra, pelo menos, duas vezes, no caso de uma repetição da amostra é requerida.
3. Ou ensaiar a amostra reconstituída imediatamente ou congelar a -20 ° C para análise posterior. Nota: Se a amostra reconstituída é congelada, é importante para evitar a sublimação durante o período de congelamento desde uma alteração no volume da amostra irá levar a um valor CORT falso quando os cálculos finais são realizadas.

6. CORT Ensaio e conversão de dados

1. Analise os extratos de cabelo paraCORT usando uma enzima imunoensaio de alta sensibilidade kit (EIA). Nota: Se estiver usando um kit comercial salivar CORT EIA, siga as recomendações do fabricante, conforme especificado no folheto do kit, exceto que as amostras de teste será alíquotas duplicadas de cada extrato reconstituído cabelo em vez de amostras de saliva.
2. Prepare um controle de qualidade (QC) extrato de cabelo para uso em cada ensaio.
   1. Coletar uma série de amostras de cabelo extras e quer processá-los individualmente como nas etapas 4.1 e 4.2 ou da piscina-los para grande amostra de transformação como nos passos 3.1 e 3.2.
   2. Evapora-se o solvente e reconstituir os extractos como nos passos 5.1 e 5.2, em seguida, reunir os extractos reconstituídos a partir de várias amostras individuais ou reunidos.
   3. Alíquota um volume adequado do extracto reconstituído reunidas (por exemplo, 0,10 ml) em tubos de microcentrífuga individuais e congelar para uso posterior.
   4. Descongele e executar uma alíquota QC em duplicado em cada microplaca imunoensaio para fornecer uma referência valor CORT para verificar a qualidade de cada execução.
   5. Um coeficiente de intra-ensaio de variação (CV; definida como o desvio padrão dividido pela média de um conjunto de valores de amostra) pode ser calculada por meio da análise de 10-12 QC poços no mesmo ensaio, ao passo que um inter-ensaio pode ser calculada usando os valores de QC através de um grupo de pistas. Se um software de leitor de microplacas calcula um CV, nos alvéolos repetidos, representando cada extrato de cabelo, em seguida, um método alternativo para a determinação intra-ensaio é calcular a média desses valores de CV individuais em toda a placa.
   6. Se qualquer extracto da amostra produz uma leitura maior do que o padrão mais elevado CORT no EIA, em seguida, uma outra parte alíquota do extracto é diluído com um volume adequado de tampão de ensaio e a leitura EIA subsequente é corrigido para o factor de diluição. As amostras também são rotineiramente reanalisados ​​se o CV, nos alvéolos repetidos é> 10%.
   7. Porque kits CORT EIA são projetados para medir CORT values em amostras de líquidos, tais como a saliva ou o plasma, a saída do suporte lógico do leitor de microplacas deve ser convertido em valor de CORT por unidade de peso de cabelo em pó. A fórmula a seguir converte saída ensaio em mg / dl para CORT pg por cabelo mg:
      (A / B) * (C / D) * E * 10.000 = F
      onde A = ug / dl a partir da saída de ensaio, B = peso (em mg) de cabelo sujeita a extracção, C = vol. (Em ml) de metanol para o cabelo em pó; D = vol. (Em ml) de metanol recuperado a partir do extracto e, subsequentemente, secou-se para baixo, E = vol. (Em ml) de tampão de ensaio utilizado para reconstituir o extracto seco, e F = valor final da concentração de CORT cabelo em pg / mg.

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Resultados

A Figura 1 mostra a impressão a partir de um conjunto representativo de amostras de cabelo humano (adulto masculino e feminino) sujeitos humanos processados ​​usando o método 2 de moagem e extração. O software de computador foi utilizada para gerar a saída de dados e para se ajustar uma curva sigmoidal de quatro parâmetros para os padrões CORT (Figura 2). Os entre-bem currículos deste prato variou 0,01-5,73%, com um intra-ensaio média de 1,34%. O CV inter-ensaio determinada...

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Discussão

O procedimento CORT cabelo acima descrito é simples de realizar, é relativamente barato, faz uso de produtos químicos facilmente disponíveis, reagentes e material, e requer equipamento que, com uma excepção, é provável que esteja presente em um laboratório analítico típico. A excepção é um aparelho de moagem tal como um moinho de bolas ou um mini-beadbeater. Notamos que alguns grupos de pesquisa mediu amostras de cabelo em pequenos fragmentos de aproximadamente 1 mm de comprimento ^12, mas com ba...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC-grade isopropanol	Fisher	A451
HPLC-grade methanol	Fisher	A452
Salivary cortisol assay kits	Salimetrics	1-3002	See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity
15 ml Polypropylene screw-cap centrifuge tubes	Max Scientific	10-9151
1.5 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-25
2.0 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Fisher	05-402-7
2.0 ml XXTuff reinforced microvials	BioSpec	330TX	Use with mini-beadbeater
3.2 mm chrome-steel beads	BioSpec	11079132c	Use with mini-beadbeater
10 ml stainless steel grinding jars	Retsch	02.462.0061	Use with mixer mill
12 mm stainless steel grinding balls	Retsch	05.368.0037	Use with mixer mill
Savant activated carbon cartridge	Fisher	DTK120R	Use with Savant chemical trap
Rotator for 15 ml centrifuge tubes	Fisher	S02135
Rotator for microcentrifuge tubes	Fisher	NC9854190
Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes	Fisher	13-100-675
MM 200 mixer mill	Retsch	20.746.0001
Mini-Beadbeater 16	BioSpec	607
Savant DNA Speedvac	Fisher	DNA120-115
Savant refrigerated vapor trap	Fisher	RVT400-115
Savant chemical trap	Fisher	SCT120	Alternative to refrigerated vapor trap
Microplate reader
Microplate washer
Microplate mixer
Multichannel pipettor
Analytical balance