Cecal קשירת ונקר-Induced אלח דם כמודל ללמוד Autophagy בעכברים

Summary

אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP). פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם הנגרם CLP מוצגים כאן: פרוטוקול למדידת autophagy באמצעות עכברים (GFP)-LC3, ופרוטוקול למדידת היווצרות autophagosome על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים.

Abstract

אלח דם ניסיוני יכול להיגרם בעכברים באמצעות קשירת cecal ולנקב שיטה (CLP), הגורם לאלח דם polymicrobial. כאן, פרוטוקול מסופק לגרום אלח דם של חומרה שונה בעכברים תוך שימוש בטכניקת CLP. Autophagy הוא תגובת רקמה בסיסית ללחץ ופלישת הפתוגן. שני פרוטוקולים הנוכחיים להעריך autophagy in vivo בהקשר של אלח דם ניסיוני מוצגים גם כאן. (אני) עכברים הטרנסגניים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק חלבון היתוך (GFP)-LC3 חשופים לCLP. שיפור מקומי של אות ה-GFP (puncta), כassayed או על ידי מבחני immunohistochemical או confocal, יכול לשמש כדי לזהות היווצרות autophagosome משופרת, ולכן הפעלה שונתה, של מסלול autophagy. (II) היווצרות vacuole autophagic המשופרת (autophagosome) לאזור רקמת יחידה (כסמן של גירוי autophagy) ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. המחקר של תגובות autophagic לאלח הדם הוא חינמון קריטיonent להבין את המנגנונים שבאמצעותם רקמות מגיבות לזיהום. ממצאי מחקר בתחום זה עשויים בסופו לתרום להבנת הפתוגנזה של אלח דם, המייצגת את אחת בעיות עיקריות ברפואה בטיפול נמרצת.

Introduction

אלח דם, תגובה דלקתית מערכתית לזיהום, מייצג גורם מוביל למוות בחולים ביקורתי חולים ^1. זיהומי התוך בטני, לעתים קרובות מובילים לאלח דם polymicrobial, חשבון 20% מהמקרים אלח דם, שבו יש תמותה משמעותית של עד 60% ^2. התמותה הקשורים אלח דם נובעת בעיקר מבעיות של מרובי איברים עם כשל איברים לאחר ^3,4. יש צורך בחקירה נוסף לתוך המנגנון הפתוגני של מחלה זו בדחיפות כדי לקדם את הפיתוח של טיפולים חדשניים ויעילים יותר.

שיטת קשירה ולנקב cecal (CLP) היא הליך נפוץ לאלח דם דוגמנות in vivo. כcecum מלא בחיידקים, תוצאות לנקבו בדלקת הצפק polymicrobial, טרנסלוקציה של חיידקים לדם (בקטרמיה), הלם ספטי, תפקוד לקוי של איברים רב, וסופו של דבר, למוות ^5. הדעה מקובלת היא שCLP משקף קלינימציאות בצורה מדויקת יותר מאשר טכניקות קודמות, כגון הזרקה של רעלן פנימי או חיידקים אפילו מטוהרים למכרסמים, וכך, CLP נחשבת את תקן זהב (אם כי לא בלי מגבלות) ⁶ לאינדוקציה ניסיוני, ולכן, החקירה של הפתוגנזה של אלח דם. במונוגרפיה זו, אנו מתארים פרוטוקולים נועדו להעריך אם מנגנונים פתוגניים של אלח דם כוללים autophagy.

Autophagy, תהליך סלולארי אבולוציונית שימור, מאפשר התחלופה של חלבונים ואברונים כגון המיטוכונדריה פגומים וממלא תפקיד חשוב בסילוק פתוגנים תאיים כוללים חיידקים ^7,8. במהלך autophagy, חלבונים או אברונים cytosolic הם מוחרמים לתוך שלפוחית ​​כפולה קרום הנכנס נקראת autophagosomes, אשר מועברות לאחר מכן לlysosomes לפירוק ^9. מספר החלבונים זוהה כhomologues היונקים של גנים הקשורים לautophagy (ATG),זוהה במקור בשמרים, המסדירים את התהליך של autophagy. ההמרה של שרשרת אור microtubule הקשורים החלבון -1 3B (LC3B) (homologue של Atg8) מLC3B-I (בצורה חופשית) לLC3B-II (טופס phosphatidylethanolamine מצומדות) מהווה צעד חשוב בהיווצרות autophagosome ^9. תפקוד לקוי autophagic הוא הקשורות להזדקנות ומחלות אנושיות, כולל סרטן ומחלות ניווניות ^10. יתר על כן, autophagy משפיע על חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות כגון מצגת אנטיגן, פיתוח הלימפוציטים והפרשת ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון ^8. לפיכך, נראה סביר שautophagy עשוי גם לשחק תפקיד בתגובה הדלקתית המערכתית לזיהום (כלומר באלח דם).

נכון להיום מספר שיטות שתוארו על מנת להעריך את התפקיד של autophagy בפגיעה ברקמות בגוף חי. אלה כוללים את השימוש בעכברים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-LC3 וכימות של רכבphagosomes ברקמה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים (אלה שתי שיטות מתוארות במונוגרפיה זו). שיטות נוספות כוללות כימות של ביטוי חלבון autophagic בhomogenates רקמות, וניתוח של שטף autophagic (כפי שמתואר במקום אחר) ^11-13. מטרת סקירה זו היא לספק פרוטוקולים הנוכחיים להערכת autophagy in vivo בהקשר של אלח דם ניסיוני.

Protocol

הערה: הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש בריגהם ובשטח בית הספר לרפואה בבית החולים / הרווארד נשים אישרה את הנהלים הבאים.

1. Cecal קשירת ונקר

השתמש בעכברים מאותו הרקע (C57Bl / 6), זכר, 8-10 שבועות. נקבות עכברים עמידים יותר מאשר גברים נגד הקטלניות-Induced אלח דם. עכברים מבוגרים מ -8 שבועות להפיק תוצאות משתנים פחות מעכברים צעירים במונחים של הישרדות לאחר CLP. כ N = יש להשתמש 10 עכברים לכל קבוצה בהשוואה לניתוח לשרוד. N = 3-5 עכברים הוא נאותים למבחני autophagy.

1. השתמש בכלים סטריליים קטנים כירורגית (כלומר אזמל, מספריים ומלקחיים אנטומיים בוטים), שאמורה להיות מתאים לניתוח מכרסם.
2. הכן תערובת הרדמה: כדי 7.95 מיליליטר של PBS להוסיף 150 μl של Xylazine (הזרקת AnaSed 100 מ"ג / מיליליטר) ו700 μl של קטמין (Ketaset   CIII, 100 מ"ג / מיב).
3. כדי להבטיח תנאים אספטיים במהלך ההליך, ללבוש כפפות, מסיכת פנים וחלוק ניתוחים.
4. שוקל בעלי חיים. הרדימי אותם על ידי הזרקת intraperitonally (IP) את התערובת שהוזכר בשלב 3 במינון של μl (10x משקל גוף בז). לדוגמא, עבור עכבר במשקל 22 גרם, לנהל 10x22 = 220 μl של תערובת ההרדמה. לפיכך, המינונים הסופיים של Xylazine וקטמין הם 17 ו80 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, בהתאמה. ודא כי ההרדמה היא נאותה; אין כיפוף של גפיים צריך להיות מיוצר אחרי קמצוץ הבוהן הערה:. השתמש במשחת עיניים בעיניים על מנת למנוע יובש ואילו בהרדמה.
5. הנח חיות על גבי משטח עבודה נקי על גבם. זנבות ורגליו אחוריות מכוונים כלפי החוקר. לחטא את עור הבטן באמצעות אלכוהול (70% פתרון EtOH) הערה:. אזור ניתוח צריך להיות מגולח לגמרי, כדי למנוע זיהום של הפצע באמצעות מגע עםפרווה. כמו כן, בצורה אופטימלית, יש להשתמש בכרית מים חמה במחזור כדי לשמור על טמפרטורה נורמלית של עכברים מורדמים במהלך הניתוח.
6. באמצעות אזמל, לבצע במקביל חתך בעור קטן ואורך כ 1 סנטימטר מהשמאל לקו אמצע. אינו חודר עדיין לתוך חלל הצפק. השתמש במספריים קטנים כדי להרחיב את החתך הראשוני.
7. זהה את שרירי בטן ולנתח אותם כדי לקבל גישה לתוך חלל הצפק.
8. באמצעות מלקחיים אנטומיים בוטים, לזהות את cecum ולעזוב את חלל הצפק זה. היזהר שלא לפגוע בכלי דם mesenterial (זה יכול להוביל לדימום קטלני).
9. ולקשור 60% מcecum להשיג אלח דם באמצע כיתה. Ligating שווה או יותר מ 75% מcecum בדרך כלל תוצאות באלח דם בדרגה גבוהה, ואילו ligating שווה או פחות מ 25% מתוצאות cecum באלח דם בדרגה נמוכה. היזהר שלא לקשור את שסתום ileocecal (זה יכול לחסום את ההמשכיות במעיים).
10. באמצעות21 מחט G, לנקב cecum ידי לנקב אחד עד-and-דרך (שני חורים) בסמוך לקשירה. את הכיוון של הניקוב צריך להיות מmesenteric לצד אנטי mesenteric של cecum. היזהר שלא לנקב כלי דם mesenterial.
11. הסר את המחט. לוחץ בעדינות את cecum ligated כדי לאשר patency דרך שני החורים; רק כמות קטנה של צואה יש נמתחים דרכם.
12. הזז את cecum ligated ונקב לתוך חלל הצפק.
    הערה: לעכברי דמה, דלג על שלבי 1.10-1.12.
13. השתמש תפרים כירורגית משי 6-0 עם חיתוך מחט לסגור שרירי בטן. השתמש תפרים כירורגית משי 6-0 עם חיתוך מחט לסגור עור בטן.
14. הזרק 1 מיליליטר prewarmed ip מלח הרגיל (37 מעלות צלזיוס) כדי להחליף את החום והלחות שאבדה במהלך ההליך. מניחים את העכברים תחת מנורת חום עד החייאתם הערה:. באופן אופטימלי, מכשיר התחממות בטוח יותר (such ככרית מים חמה במחזור) יכול לשמש במקום מנורת חום.
15. לאחר הניתוח מזריק buprenorphin (0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף sc.) כדי להשיג שיכוך כאבים הערה:. בעלי חיים לא צריכים להשאיר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על עינת חזה. בעלי חיים שעבר טיפול כירורגים לא צריכים להיות מוחזרים לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאוששו באופן מלא.
16. הנח בעלי חיים בחזרה בכלובים שלהם עם גישה בלתי מוגבלת למזון ומים. עכברים יהיו מורדמים כאשר הם הופכים לגוססים (מסומנים על ידי סימנים קליניים כגון אי ספיקת לעבור כאשר נגעו או כיחלון). בדוק עכברים בכל שעה 4 כדי להימנע מהצורך להם למות לפני המתת חסד.

2. רקמת קציר וקיבוע

1. הכן פתרון paraformaldehyde 4% (PFA): כדי 889 מיליליטר PBS להוסיף 111 מיליליטר של 37% PFA.
2. להקריב את העכברים או באמצעות הרדמה או קטמין / Xylazine של מושרה ₂ COolution במינון גבוה.
3. לשתק את העכברים על משטח עבודה נקי. לרסס את עור הבטן וחזה עם 70% פתרון EtOH לחטא אותו.
4. השתמש באזמל ומספריים קטנים כדי להסיר את הבטן ועור בית החזה, כמו גם את העור המכסה את האזור לקנה הנשימה.
5. לחשוף את קנה הנשימה על ידי הסרת רקמות שמסביב (שרירים ורקמות חיבור).
6. הנח תפר (ללא חיתוך מחט) סביב קנה הנשימה. אל תהדק את זה עדיין.
7. השתמש בצנתר קטן היקפי ורידים (20 G) לקנה הנשימה 'צנרר'. היזהר בעת החדרת הצנתר לקנה הנשימה כדי למנוע קרע. שים לב שהקוטר הגדול ביותר של קנה הנשימה הוא ממש מתחת לסחוס cricoid.
8. הדק את התפר סביב קנה הנשימה / קטטר. הסר את המחט ומשאירה רק צינורית הפלסטיק של קטטר לתוך קנה הנשימה. מחט שימשה רק כמדריך תיל להחדרת צינורית הפלסטיק.
9. לאחר שהבטיח את צינורית הפלסטיק לתוך קנה הנשימה, לחתוך הדואר שרירי בטן, לפתוח את הבטן ולחשוף את הסרעפת.
10. באמצעות מחט, לנקב את הסרעפת לייצר חזה אוויר (כלומר כניסה של אוויר לתוך חלל פלאורלי). ריאות אמורות להיות התמוטטו.
11. בעזרת מספריים קטנים, להסיר את הסרעפת, לחתוך לאורך עצם החזה (sternotomy), להסיר את כלוב הצלעות ולחשוף את הלב והריאות.
12. דרך צינורית הפלסטיק מוכנסת לתוך קנה הנשימה, לתקן את הריאות עם תמיסת פורמלדהיד תחת 30 ס"מ H לחץ O _2.
13. הסר את הריאות ומכניס אותם לתוך PFA 4% ל24 שעות ולאחר מכן ב70% פתרון EtOH עד עיבוד.
14. לזהות ולהסיר את לב, כבד וכליה. באותו אופן, להכניס אותם לתוך PFA 4% ל24 שעות ולאחר מכן ב70% פתרון EtOH עד עיבוד.

3. עכברים ה-GFP וצפייה בשקופיות ה-GFP

1. בצע CLP וניתוח דמה על עכברי ה-GFP-LC3 כמתואר בשלב 1, והליך שלאחר ניתוחים כפי שמתואר בשלב 2 של הפרוטוקול.
2. להטביע את הרקמות (כלומר ריאות, לב, כבד וכליות) בפרפין ולחתוך אותם ב5 מיקרומטר סעיפי סדרתי.
3. כאשר מוכן לצביעת ה-GFP, לדגור על 60 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות עד שנמס ורקמות פרפין מופיעים שקופים.
4. Deparaffinize עם סדרה מדורגת סטנדרטית תחליפי קסילן או קסילן, 5 קסילן 1 דקות, קסילן 2 וקסילן 3 ואז 3 דקות incubations בסדרה מדורגת של EtOH: 100%, 95%, 75%, ואז לשטוף במים מזוקקים.
   הערה: לאחר deparaffinization למנוע התייבשות רקמות, דבר המגדיל רקע לדוגמה.
5. לבצע אחזור אנטיגן באמצעות מאגר חומצת לימון (חומצת 10 מ"מ ציטרט הנתרן, 0.05% Tween 20, pH 6.0), על ידי במיקרוגל ל10-20 דקות. היזהר להחליף חיץ מעת לעת, כדי למנוע התייבשות של רקמות.
6. אפשר פתרון מגניב עבור 20 דקות בספסל כדי להשלים אחזור אנטיגן.
7. לשטוף 2-3x עם PBS. הסרת חיץ וטרה עודפיםnsfer מחליק ממדף למצב אופקי בתיבת שקופית או תא humidified אחר כדי למנוע התייבשות.
8. לחסום 45-60 דקות בטמפרטורת חדר עם 10% סרום חמור נורמלי (גם 5% שור סרום אלבומין, או עדיף סרום מהחיה שבו הנוגדנים משני שנוצרו) ב-PBS.
9. דגירה דגימות בנוגדן ה-GFP העיקרי ב1:100 דילול ב-PBS הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. בעדינות להחיל חתיכות קטנות של רקמת Parafilm מעל עם נוגדן כדי לקדם את הקשר הומוגנית עם הרקמה ולמנוע אידוי.
   הערה: צעדים שנותר מבוצעים בטמפרטורת חדר.
10. שטוף 5x עם PBS להסיר נוגדן ראשוני עודף. דגירה עם נוגדנים משני 1:500-1:1,000 PBS במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר.
11. שטוף 5x עם PBS להסיר נוגדנים משני עודפים. אם תרצה, counterstain השקופיות בשלב זה.
12. אם אתם משתמשים בשני נוגדנים ניאון, דגירה 0.1% שחורים סודאן ב70% f EtOHאו 15-20 דקות כדי להפחית autofluorescence. נגב את עודף סודאן השחורה מכל רחבי רקמה ולשטוף 5x עם PBS מעל 20 דקות.
13. הר מדגם עם coverslip ולאחסן באופן אופקי, עד שפתרון הרכבה קבע.

4. פרוטוקול אלטרנטיבי: ישיר זיהוי של ה-GFP-LC3

1. ריאות cannulate ומתנפח ב~ 500 מיליליטר של 50/50 v / V אוק PBS.
2. להטביע ב אוקטובר על ידי לשים כמות קטנה של אוקטובר בתחתית cryomold.
3. בזהירות במקום מורכב ריאות גזורים בעובש.
4. לאט להקפיא מעל מתילבוטאן מקורר באמצעות קרח יבש.
5. הוסף עוד אוקטובר עד הרקמה מכוסה לחלוטין וקפאה לגמרי. שמור על קרח יבש ולאחסן ב -80 ° C.
6. שימוש cryomicrotome, לחתוך 5-10 חלקים עבים מיקרומטר הגנה על החלקים מהאור. חלקי חנות ורקמות שנותרו ב-80 ° C.
7. כדי להכין את השקופיות עבור הדמיה, להסיר סעיף ממקפיא ולהחיל באופן מיידי לירידה של PBS כדי למנוע התייבשות.
8. תקן עבור 30 דקות עם PFA 4%. לשטוף עם PBS.
9. החל DAPI / Hoescht 10 דקות. לשטוף 3x עם PBS.
10. הר מדגם עם coverslip ולאחסן באופן אופקי, עד שפתרון הרכבה קבע.
11. תמונה באמצעות epifluorescence או מיקרוסקופ confocal. דגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש.

5. הכנת רקמות למיקרוסקופיות אלקטרונים

1. חותכים לרקמות לכ 1 מ"מ, קוביות לתיקון.
2. לתקן הרקמות בפורמלדהיד 2%, glutaraldehyde 2.5% במאגר M 0.1 cacodylate נתרן, pH 7.4.
3. לשטוף עם חיץ cacodylate נתרן 0.1 M עבור 1-2 שעות.
   הערה: רקמה קבועה ניתן לאחסן ב0.1 M cacodylate נתרן ב 4 ° C.
4. פרסם תיקון ב1% tetroxide אוסמיום ב0.2 חיץ cacodylate M נתרן במשך שעה 1.
5. יש לשטוף ב0.2 חיץ cacodylate M נתרן לדקות 3x 10.
6. ליבש בEtOH 70%, 20 דקות 2x. ליבש ב90% EtOH, 10 דקות 2x. ליבש ב100% EtOH,20 2x דקות.
7. דגירה עם פרופילן אוקסיד (פרופאן אפוקסי) עבור 10 דקות 2x.
8. דגירה עם תערובת פרופילן אוקסיד / אפוקסי שרף (50:50) במשך שעה 1. תערובת שרף אפוקסי היא: 24 גרם אגר שרף 100, אנהידריד dodecenylsuccinic 13 גרם, אנהידריד methylnadic 13 גרם ו1 מיליליטר N-benzyldimethylamine. מערבבים היטב בכוס חד פעמית בעזרת מרית עץ.
9. דגירה עם לילה שרף אפוקסי בבקבוקונים הסירו את המכסה (זה מאפשר לכל פרופילן אוקסיד שנותר להתאדות).
10. להטביע בכמוסות שכותרתו עם שרף מוכן טרי. פלמר ב60 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
11. סעיפי רקמות תצלום באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים ב80 או 60 ק ו על גבי סרט מיקרוסקופ אלקטרונים. הדפסת התמונות על גבי נייר צילום או לאחסן את המדיה דיגיטלית.
12. נתח את היווצרות autophagosome בתאים שלמים המכילים גרעין. שדות בעצמה נמוכה (ה. גרם. 2,000-4,000 X) יכולים לשמש לזיהוי תאי בעלי גרעין. בדרך כלל 6,800-10,000 תמונות X משמשות לההוא כימות autophagosome. רוזן autophagosomes ליחידת שטח 15-30 שדות לייצוג סטטיסטי מתאים. יש לי Autophagosomes מבנה קרום כפול, שבו autophogosomes שלב מאוחר דמה וקואולות מלאה.

תוצאות

בקטרמיה קיימת בעכברים מוקדם ככל 6 שעות לאחר אלח דם CLP-Induced ^14. סימנים קליניים של אלח דם (כוללים צמרמורות, tachypnoea ופעילות מוטורית לקויה) מופיעים כ 12 שעה לאחר ההליך. עכברים נתון CLP מתחילים למות בסביבות 18 שעות לאחר האינדוקציה של דלקת הצפק. חמור יותר הוא אלח הדם מוגבר יות?...

Discussion

היתרון העיקרי של CLP הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור אלח דם של חומרות שונות (כלומר מנמוך לכיתה גבוהה באמצע ו). חומרה של אלח דם הנגרם מושפעת אורך cecum ligated (שהקובע החשוב ביותר), בגודל של מחט המשמשת לניקור ומספר החורים ביצעו ^15. בנוסף, זן העכבר והמין יכולים להשפיע על ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice	Riken (Japan)	RBRC00806	GFP-LC3#53
Xylazine	Henry-Schein	568-0606	Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine	Henry-Schein	995-2949	Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH	Fisher	A405-20	Histology Grade
EtOH	Fisher	A407-1	For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0	Owens & Minor	2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl	Henry-Schein	614-5157	Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution	JT Baker	S898-09
xylenes	Fisher	X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody	Life Technologies	G10362
Hoescht	Sigma	944403
DAPI	Invitrogen	D1306
OCT	VWR scientific	25608-930
Sudan Black	Santa Cruz	sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate	Electron microscopy Sciences	15960
propylene oxide	Sigma	240397
Agar 100 resin	Agar scientific	R1045
dodecenylsuccinic anhydride	Sigma	46346
methylnadic anhydride	Sigma	45359
N-benzyldimethylamine	Sigma	185582