Cecal ligature et ponction induite Sepsis comme un modèle pour étudier autophagie chez les souris

Résumé

La septicémie expérimentale peut être induite chez des souris en utilisant la méthode (CLP) ligature caecale et ponction. Les protocoles actuels pour évaluer autophagy in vivo dans le cadre de la sepsie induite par CLP sont présentés ici: Un protocole pour la mesure en utilisant des souris autophagy (GFP)-LC3, et d'un protocole de mesure de la formation de autophagosome par microscopie électronique.

Résumé

La septicémie expérimentale peut être induite chez des souris en utilisant la méthode (CLP), qui provoque une septicémie à germes multiples ligature caecale et ponction. Ici, il est prévu un protocole d'induire sepsis de gravité variable chez les souris en utilisant la technique de la CLP. Autophagy est une réponse du tissu fondamental au stress et à l'invasion de pathogènes. Deux protocoles actuels pour évaluer autophagy in vivo dans le cadre de la septicémie expérimentale sont également présentés ici. (I) Les souris transgéniques exprimant la protéine de fluorescence verte de la protéine (GFP)-LC3 fusion sont soumis au règlement CLP. Amélioration localisée du signal de la GFP (puncta), telle que déterminée soit par des dosages immunohistochimiques ou confocale, peut être utilisé pour détecter la formation de autophagosome améliorée et, par conséquent, l'activation de la voie modifiée autophagy. (II) Enhanced vacuole autophagique (autophagosome) formation par aire unitaire de tissu (en tant que marqueur de stimulation autophagy) peut être quantifiée en utilisant la microscopie électronique. L'étude des réponses autophagiques à la septicémie est un échantillon critiqueonent de comprendre les mécanismes par lesquels les tissus répondent à l'infection. Les résultats des recherches dans ce domaine peuvent finalement contribuer à la compréhension de la pathogenèse de la septicémie, ce qui représente un problème majeur en médecine de soins intensifs.

Introduction

Septicémie, une réponse inflammatoire systémique à l'infection, représente une des principales causes de décès chez les patients gravement malades ^1. Infections intra-abdominales, conduisant souvent à une septicémie polymicrobienne, compte pour 20% des cas de septicémie, qui ont une mortalité importante de jusqu'à 60% ^2. la mortalité associée au sepsis résulte principalement de dysfonction d'organes multiples avec défaillance organique ultérieure ^3,4. Complément d'enquête dans le mécanisme pathogène de cette maladie est urgent de promouvoir le développement de thérapies nouvelles et plus efficaces.

La méthode ligature du caecum et à la perforation (CLP) est une procédure couramment utilisée pour la modélisation sepsis in vivo. Comme le caecum est pleine de bactéries, les résultats de ponction dans péritonite polymicrobiens, la translocation de bactéries dans le sang (bactériémie), le choc septique, la dysfonction d'organes multiples et, finalement, la mort ^5. Il est généralement admis que CLP reflète cliniquela réalité avec plus de précision que les techniques antérieures, telles que l'injection d'endotoxine ou de bactéries, même purifiés à des rongeurs, ainsi CLP est considéré comme l'étalon-or (mais pas sans limites) ⁶ pour l'induction expérimentale, et donc, l'enquête de la pathogenèse de la septicémie. Dans cette monographie, nous décrivons les protocoles visant à évaluer si les mécanismes pathogènes de la septicémie comprennent l'autophagie.

L'autophagie, un processus cellulaire évolutif conservé, facilite le renouvellement des protéines et des organites tels que les mitochondries endommagées et joue un rôle important dans la clairance des pathogènes intracellulaires, y compris les bactéries ^7,8. Au cours de l'autophagie, des protéines ou des organites cytoplasmiques sont séquestrés dans des vésicules à double membranaires appelées autophagosomes, qui sont ensuite livrées aux lysosomes pour la dégradation ^9. Plusieurs protéines ont été identifiées comme des homologues mammifères de gènes liés autophagy-(ATG),initialement identifiées dans la levure, qui réglemente le processus de l'autophagie. La conversion de la chaîne légère associée aux microtubules protéines 1 3B (LC3B) (homologue de Atg8) de LC3B-I (forme libre) à LC3B-II (forme de phosphatidyléthanolamine-conjugué) représente une étape importante dans la formation autophagosome ^9. Dysfonction autophagie est associée au vieillissement et les maladies humaines telles que le cancer et les maladies neurodégénératives ^10. En outre, autophagy affecte l'immunité innée et adaptative tel que la présentation d'antigène, le développement des lymphocytes et la sécrétion de cytokines par les cellules immunitaires ^8. Ainsi, il semble raisonnable que l'autophagie pourrait également jouer un rôle dans la réponse inflammatoire systémique à l'infection (c'est à dire dans le sepsis).

A ce jour plusieurs méthodes ont été décrites pour évaluer le rôle de l'autophagie des blessures des tissus in vivo. Ceux-ci comprennent l'utilisation de souris exprimant la protéine de fluorescence verte (GFP)-LC3 et la quantification de l'automobilephagosomes dans les tissus par microscopie électronique (ces deux méthodes sont décrites dans cette monographie). D'autres méthodes incluent la quantification de l'expression de la protéine autophagique dans les homogénats de tissus, et l'analyse des flux autophagique (comme décrit ailleurs) ^11-13. L'objectif de cette étude est de fournir les protocoles actuels pour évaluer l'autophagie in vivo dans le cadre de la septicémie expérimentale.

Protocole

Note: Le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux à l'Hôpital Brigham and / Harvard Medical School Zone de femmes a approuvé les procédures suivantes.

Une. Cecal ligature et ponction

Utilisez la souris de la même origine (C57BL / 6), de sexe masculin, âgé de 8-10 semaines. Des souris femelles sont plus résistantes que les hommes contre la létalité induite par le sepsis. Souris âgées de 8 semaines donnent des résultats moins variables que les souris plus jeunes en termes de survie après CLP. Environ n = 10 souris par groupe par rapport devraient être utilisés pour l'analyse de la survie. N = 3-5 souris est suffisant pour les essais de l'autophagie.

1. Utilisez de petits instruments chirurgicaux stériles (à savoir de scalpel, ciseaux et des pinces anatomiques franches), qui devrait être approprié pour la chirurgie des rongeurs.
2. Préparer le mélange anesthésie: A 7,95 ml de PBS ajouter 150 ul de xylazine (injection AnaSed 100 mg / ml) et 700 ul de kétamine (Ketaset   CIII, 100 mg / ml).
3. Pour assurer des conditions d'asepsie au cours de la procédure, porter des gants, masque et blouse chirurgicale.
4. Peser les animaux. Anesthésier les injecter par voie intrapéritonéale (ip), le mélange mentionné dans l'étape 3 dans un dosage de pl (10x de poids corporel en g). Par exemple, pour une souris de 22 g, gérer 10x22 = 220 ul du mélange anesthésique. Ainsi, les doses finales de xylazine et de kétamine est de 17 et 80 mg / kg de poids corporel, respectivement. Assurez-vous que l'anesthésie est suffisante, pas de flexion du membre doit être produite après pincement de l'orteil. Remarque: Utilisez pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie.
5. Placer les animaux sur une surface de travail propre sur leur dos. Tails et les pattes postérieures sont orientés vers l'enquêteur. Désinfectez la peau de l'abdomen de l'alcool (solution EtOH 70%) Note:. Zone chirurgicale doit être complètement rasé, pour éviter la contamination de la plaie par le contact avecfourrure. En outre, de façon optimale, un tampon de circulation d'eau chaude doit être utilisée pour maintenir la normothermie de souris anesthésiées au cours de la chirurgie.
6. En utilisant un scalpel, faire une petite incision cutanée longitudinale parallèle et environ 1 cm à gauche de la ligne médiane. Ne pas pénétrer encore dans la cavité péritonéale. Utilisez de petits ciseaux pour prolonger l'incision initiale.
7. Identifier les muscles abdominaux et les disséquer pour accéder dans la cavité péritonéale.
8. En utilisant des pinces anatomiques émoussés, identifier le caecum et le déplacer en dehors de la cavité péritonéale. Veillez à ne pas endommager les vaisseaux sanguins mésentériques (ce qui pourrait entraîner une hémorragie mortelle).
9. Ligaturer à 60% du caecum pour atteindre une septicémie à mi-pente. Ligaturer égale ou supérieure à 75% du caecum se traduit généralement par une septicémie à haute teneur, tandis que la ligature égale ou inférieure à 25% des résultats de caecum dans un sepsis de bas grade. Veillez à ne pas ligaturer la valvule iléo-colique (ce qui pourrait bloquer la continuité intestinale).
10. En utilisant un21 G aiguille, perforer le caecum par une ponction par-et-par (deux trous) à proximité de la ligature. La direction de la perforation doit être de la mésentérique à la face anti-mésentérique du caecum. Veillez à ne pas percer les vaisseaux sanguins mésentériques.
11. Retirez l'aiguille. Appuyez doucement sur le caecum ligaturé pour confirmer la perméabilité à travers les deux trous, mais seulement une petite quantité de matières fécales doit être extrudé à travers eux.
12. Déplacez le caecum ligaturé et percé dans la cavité péritonéale.
    Note: Pour les souris de faux, sauter les étapes 01.10 au 01.12.
13. Utilisez soie sutures chirurgicales 6-0 à la fine aiguille pour fermer la musculature abdominale. Utilisez soie sutures chirurgicales 6-0 à la fine aiguille pour fermer la peau abdominale.
14. Injecter 1 ml préchauffé (37 ° C) ip de solution saline normale pour remplacer la chaleur et l'hydratation perdue au cours de la procédure. Placez la souris sous une lampe chauffante jusqu'à leur réanimation. Remarque: Dans l'idéal, un dispositif de réchauffement plus sûr (such comme un tampon d'eau chaude circulant) peut être utilisé à la place d'une lampe de chaleur.
15. Après l'opération injecter buprénorphine (0,05 mg / kg de poids corporel sc.) Pour obtenir une analgésie. Remarque: Un animal ne doit pas être laissé sans surveillance jusqu'à ce qu'elle ait repris conscience suffisante pour maintenir décubitus sternal. Un animal qui a subi un traitement chirurgical ne doit pas être retourné à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que complètement rétabli.
16. Placez animaux retour dans leurs cages avec un accès illimité à la nourriture et de l'eau. Souris seront euthanasiés quand ils deviennent moribonds (indiqué par des signes cliniques tels que le défaut de se déplacer quand on les touche ou cyanose). Vérifiez souris toutes les 4 heures pour éviter d'avoir mourir avant l'euthanasie.

2. Tissu de récolte et de fixation

1. Préparer un paraformaldéhyde 4% (PFA) solution: Pour 889 ml de PBS ajouter 111 ml de 37% de PFA.
2. Sacrifier des souris en utilisant soit CO ₂ narcose induite ou kétamine / xylazine slution dans un dosage élevé.
3. Immobiliser la souris sur une surface de travail propre. Pulvériser la peau abdominale et thoracique avec une solution de EtOH à 70% pour la désinfecter.
4. Utilisation d'un scalpel et de petits ciseaux pour enlever la peau abdominale et thoracique, ainsi que la peau recouvrant la région de la trachée.
5. Révéler la trachée en enlevant ses tissus environnants (muscles et du tissu conjonctif).
6. Placez un fil de suture (sans aiguille coupe) autour de la trachée. Ne serrez pas encore.
7. Utilisez un petit cathéter veineux périphérique (20 G) de la trachée "de intubate. Soyez prudent lors de l'insertion du cathéter pour éviter la déchirure de la trachée. A noter que le plus grand diamètre de la trachée est juste au-dessous du cartilage cricoïde.
8. Serrer la suture autour de la trachée / cathéter. Retirer l'aiguille ne laissant que la canule en matière plastique du cathéter dans la trachée. Aiguille servi comme un guide-fil pour l'insertion de la canule en plastique.
9. Après s'être assuré de la canule en plastique dans la trachée, couper ee musculature abdominale, ouvrir l'abdomen et de révéler la membrane.
10. En utilisant une aiguille, la perforation de la membrane pour produire un pneumothorax (c.-à-insertion de l'air dans la cavité pleurale). Poumons doivent ensuite être réunis.
11. L'utilisation de petits ciseaux, enlever le diaphragme, couper le long du sternum (sternotomie), enlever la cage thoracique et de révéler le cœur et les poumons.
12. Grâce à la canule en matière plastique inséré dans la trachée, les poumons fixer avec la solution de formaldéhyde de moins de 30 cm H ₂ à la pression d'entrée-sortie.
13. Retirez les poumons et les placer dans la PFA 4% pendant 24 heures et ensuite en solution à 70% EtOH jusqu'à la transformation.
14. Identifier et éliminer cœur, le foie et les reins. De la même manière, placez-les dans le PFA 4% pendant 24 heures et ensuite en solution à 70% EtOH jusqu'à la transformation.

3. Souris GFP et visualisation de GFP Diapositives

1. Effectuer CLP et une intervention chirurgicale fictive sur des souris GFP-LC3 comme décrit à l'étape 1, et la procédure post-opératoires comme décrit à l'étape 2 du protocole.
2. Incluez les tissus (notamment les poumons, le cœur, le foie et les reins) dans de la paraffine et les couper en série 5 sections um.
3. Lorsqu'il est prêt pour la GFP coloration, laisser incuber à 60 ° C pendant 30-60 min jusqu'à ce que des masses fondues de paraffine et de tissu translucide apparaît.
4. Déparaffiner avec la série standardisé et calibré de xylène ou substituts de xylène, 5 min xylène 1, 2, xylène et le xylène 3 puis 3 min incubations en série graduée de EtOH: 100%, 95%, 75%, puis rincer à l'eau distillée.
   Remarque: Après déparaffinage éviter la dessiccation du tissu, ce qui augmente l'échantillon fond.
5. Effectuer la récupération de l'antigène en utilisant un tampon d'acide citrique (10 mM d'acide de citrate de sodium, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), par micro-ondes pendant 10 à 20 min. Soyez prudent de remplacer périodiquement tampon pour éviter la dessiccation du tissu.
6. Laisser refroidir la solution pendant 20 min sur le banc pour compléter la recherche d'antigène.
7. Lavez 2-3x avec PBS. Enlever l'excès de tampon et transfer glisse de grille à une position horizontale dans une boîte de glissement ou autre chambre humide pour éviter la dessiccation.
8. Bloquer 45 à 60 min à température ambiante avec 10% de sérum d'âne normal (également 5% d'albumine de sérum bovin, ou de préférence du sérum de l'animal dans lequel l'anticorps secondaire a été généré) dans du PBS.
9. Incuber les échantillons à l'anticorps primaire de la GFP à une dilution de 1:100 dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C en chambre humide. Appliquez doucement de petits morceaux de Parafilm sur le tissu avec un anticorps pour favoriser le contact homogène avec le tissu et éviter l'évaporation.
   Note: Les étapes restantes sont effectuées à température ambiante.
10. Laver 5x avec du PBS pour éliminer l'anticorps primaire excès. Incuber avec l'anticorps secondaire 1:500-1:1,000 dans du PBS pendant 1 à 2 h à température ambiante.
11. Laver 5x avec du PBS pour éliminer l'anticorps secondaire excès. Si on le désire, contre-colorer les lames à cette étape.
12. Si en utilisant un anticorps secondaire fluorescent, incuber 0,1% de noir du Soudan dans EtOH à 70% fou de 15 à 20 min afin de réduire l'autofluorescence. Essuyez l'excès de noir du Soudan du monde tissu et laver 5x avec PBS pendant 20 min.
13. Montez échantillon avec lamelle et stocker horizontalement, jusqu'à ce que la solution de montage a mis.

4. Alternative Protocole: Détection directe de la GFP-LC3

1. Cathétériser et gonfler les poumons avec un ~ 500 ml de 50/50 v / v octobre PBS.
2. Incluez dans l'OCT en mettant une petite quantité de l'OCT dans le fond d'un cryomoule.
3. Placez délicatement le complexe du poumon disséqué dans le moule.
4. Geler lentement sur methylbutane refroidis avec de la glace sèche.
5. Ajouter plusieurs PTOM jusqu'à ce que le tissu est complètement couvert et gelé. Garder sur la glace sèche et conserver à -80 ° C.
6. L'utilisation d'un cryomicrotome, couper 5-10 um sections épaisses qui protègent les sections de la lumière. sections de magasins et le reste de tissus à -80 ° C.
7. Pour préparer des diapositives pour l'imagerie, retirez la section du congélateur et appliquer immédiatement une baisse de PBS pour éviter la dessiccation.
8. Fixer pendant 30 min à 4% PFA. Laver avec du PBS.
9. Appliquer DAPI / Hoechst pendant 10 min. Laver 3 fois avec PBS.
10. Montez échantillon avec lamelle et stocker horizontalement, jusqu'à ce que la solution de montage a mis.
11. Image à l'aide épifluorescence ou microscope confocal. Conserver les échantillons à 4 ° C pour jusqu'à un mois.

5. Préparation des tissus pour la microscopie électronique

1. Couper les tissus en environ 1 mm cubes pour la fixation.
2. Fixer le tissu dans 2% de formaldehyde, 2,5% de glutaraldéhyde dans un tampon 0,1 M de cacodylate de sodium, pH 7,4.
3. Laver avec un tampon de cacodylate de sodium à 0,1 M pendant 1-2 heures.
   Remarque: le tissu fixe peut être stockée dans 0,1 M de cacodylate de sodium à 4 ° C.
4. Poster correctif dans 1% de tétroxyde d'osmium dans de sodium 0,2 M tampon cacodylate pendant 1 heure.
5. Rincer dans du tampon cacodylate de sodium 0,2 M pendant 10 mn 3x.
6. Déshydrater dans EtOH à 70%, 20 min 2x. Déshydrater dans 90% EtOH, 10 min 2x. Déshydrater dans EtOH à 100%,2x 20 min.
7. Incuber avec l'oxyde de propylène (époxy propane) pendant 10 min 2x.
8. Incuber avec le mélange de résine d'oxyde de propylène / époxy (50:50) pendant 1 heure. Le mélange de résine époxy est: Agar 24 g de résine de 100, 13 g de l'anhydride dodécénylsuccinique, 13 g d'anhydride méthylnadique et 1 ml de N-benzyldiméthylamine. Bien mélanger dans un récipient jetable à l'aide d'une spatule en bois.
9. Incuber avec Epoxy nuit de résine dans des flacons non plafonnés (ce qui permet tout oxyde de propylène restant s'évaporer).
10. Incluez dans des capsules marquées avec de la résine fraîchement préparé. Polymériser à 60 ° C pendant 48 heures.
11. des coupes de tissus de photographie à l'aide d'un microscope électronique à transmission à 80 ou 60 kV sur un film en microscope électronique. Imprimer les images sur du papier photographique ou stocker médias numériques.
12. Analyser formation autophagosome dans des cellules intactes contenant noyau. Les champs de faible puissance (e. G. 2,000-4,000 X) peuvent être utilisés pour identifier les cellules nucléées. Typiquement 6,800-10,000 X images sont utilisées pour eest la quantification autophagosome. Comptez autophagosomes par unité de surface de 15 à 30 champs de représentation statistique appropriée. Autophagosomes ont une structure à double membrane, où autophogosomes à un stade avancé ressemblaient vacuoles remplies.

Résultats

Bactériémie est présent chez la souris dès 6 heures après la septicémie CLP-induite ^14. Les signes cliniques de septicémie (y compris des frissons, tachypnée et l'activité motrice facultés affaiblies) apparaissent environ 12 heures après la procédure. Souris soumis au règlement CLP commencent à mourir autour de 18 heures après l'induction de la péritonite. Le plus grave est la septicémie le plus augmenté est la létalité ^15. Dans le détail, la septicémie haute qualité ...

Discussion

Le principal avantage de CLP est qu'il permet aux chercheurs d'étudier la septicémie de différents niveaux de gravité (c'est à dire de faible à moyenne et haute qualité). La gravité de la septicémie induite est affecté par la longueur du caecum ligaturé (dont le déterminant le plus important), la taille de l'aiguille utilisée pour percer et le nombre de trous ¹⁵ réalisés. En outre, la souche de souris et le sexe peut avoir une incidence sur la gravité de la septicémie...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice	Riken (Japan)	RBRC00806	GFP-LC3#53
Xylazine	Henry-Schein	568-0606	Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine	Henry-Schein	995-2949	Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH	Fisher	A405-20	Histology Grade
EtOH	Fisher	A407-1	For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0	Owens & Minor	2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl	Henry-Schein	614-5157	Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution	JT Baker	S898-09
xylenes	Fisher	X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody	Life Technologies	G10362
Hoescht	Sigma	944403
DAPI	Invitrogen	D1306
OCT	VWR scientific	25608-930
Sudan Black	Santa Cruz	sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate	Electron microscopy Sciences	15960
propylene oxide	Sigma	240397
Agar 100 resin	Agar scientific	R1045
dodecenylsuccinic anhydride	Sigma	46346
methylnadic anhydride	Sigma	45359
N-benzyldimethylamine	Sigma	185582