Слепой кишки Лигирование и прокол, вызванной Сепсис как модель для изучения аутофагии у мышей

Резюме

Экспериментальная сепсис могут быть вызваны у мышей с помощью слепой кишки перевязки и пункции метод (CLP). Современные протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте CLP-индуцированного сепсиса представлены здесь: протокол для измерения аутофагию используя (GFP)-lc3 мышей и протокол для измерения образование аутофагосом с помощью электронной микроскопии.

Аннотация

Экспериментальная сепсис могут быть вызваны у мышей с помощью слепой кишки перевязки и пункции метод (CLP), что приводит к полимикробная сепсис. Здесь, протокол предоставляется вызвать сепсис различной степени тяжести у мышей с использованием метода CLP. Аутофагия является ответом фундаментальная ткани к стрессу и возбудителя инвазии. Два настоящие протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте экспериментального сепсиса также представлены здесь. (I) Трансгенные мыши, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP)-LC3 слитого белка подвергают CLP. Локализованный усиление сигнала (GFP Puncta), а анализировали либо иммуногистохимических анализов или конфокальных, могут быть использованы для обнаружения формирование расширенной аутофагосом и, таким образом, изменения активация аутофагии пути. (II) усиление аутофагической вакуоль (аутофагосом) формирование на единицу площади ткани (в качестве маркера аутофагии стимуляции) может быть определена количественно с помощью электронной микроскопии. Изучение аутофагии ответов на сепсиса является одним из важнейших получения оценочногоonent понимания механизмов, посредством которых ткани реагируют на инфекции. Результаты исследований в этой области в конечном итоге может способствовать понимания патогенеза сепсиса, который представляет собой серьезную проблему в реаниматологии.

Введение

Сепсис, системный воспалительный ответ на инфекцию, представляет собой основной причиной смерти в критически больных пациентов ^1. Интраабдоминальной инфекции, часто ведущие к полимикробной сепсиса, составляют 20% от сепсиса случаях, которые имеют существенное смертность до 60% ^2. Сепсис-связанная с ними смертность в первую очередь является результатом дисфункции многих органов с последующим органной недостаточности ^3,4. Дополнительная расследование патогенного механизма этого заболевания необходимо в срочном порядке содействовать развитию новых и более эффективных методов лечения.

Метод слепой кишки перевязки и пункции (CLP) является широко используемым процедура моделирования сепсиса в естественных условиях. Как слепая кишка полна бактерий, ее результаты пункции в полимикробная перитонита, транслокация бактерий в кровь (бактериемия), септический шок, дисфункция полиорганной и, в конечном счете, смерть ^5. Принято считать, что CLP отражает клиническийреальность более точно, чем предыдущие методы, такие как инъекции эндотоксина или даже очищенных бактерий в грызунов, таким образом, CLP считается золотым стандартом (хотя и не без ограничений) ⁶ для экспериментальной индукции и, следовательно, исследование патогенеза сепсиса. В этой монографии мы описываем протоколы, предназначенные для оценки патогенетические механизмы сепсиса включают ли аутофагию.

Аутофагия, эволюционно консервативными клеточный процесс, облегчает оборот поврежденных белков и органелл типа митохондрий и играет важную роль в оформлении внутриклеточных патогенов, включая бактерии ^7,8. Во время аутофагии, цитозольные белки или органеллы поглощенных в двойные мембраной пузырьков, называемых Аутофагосомы, которые впоследствии доставлены в лизосомах деградации ^9. Ряд белков были идентифицированы как гомологов млекопитающих генов аутофагии, связанных с (ГПТ),первоначально идентифицирован в дрожжах, регулирующих процесс аутофагии. Превращение микротрубочек связанных белков-1 легкой цепи 3В (LC3B) (гомолог Atg8) от LC3B-I (свободной форме), чтобы LC3B-II (фосфатидилэтаноламина-сопряженных форма) представляет собой важный шаг в аутофагосом образования ^9. Аутофагической дисфункция связана со старением и человека заболеваний, включая рак и нейродегенеративные расстройства ^10. Кроме того, аутофагии влияет врожденного и адаптивного иммунитета, таких как презентации антигена, развитие лимфоцитов и секрецию цитокинов иммунных клеток ^8. Таким образом, кажется разумным, что аутофагии может также играть роль в системной воспалительной реакции на инфекцию (т.е. при сепсисе).

На сегодняшний день несколько методов были описаны для оценки роли аутофагии в повреждение тканей в естественных условиях. Они включают в себя использование зеленого флуоресцентный белок (GFP)-LC3, выражающих мышей и количественную оценку автофагосомы в ткани с помощью электронной микроскопии (эти два метода описаны в монографии). Дополнительные способы включают количественное аутофагической экспрессии белка в гомогенатах тканей, а также анализ аутофагической потока (как описано в другом месте) ^11-13. Цель этого обзора является предоставление настоящие протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте экспериментального сепсиса.

протокол

Примечание: Комитет Уходу за животными и использование в Бригама и Женской больницы / Гарвардской медицинской школы Площадь утверждены следующие процедуры.

1. Слепой кишки Лигирование и Прокол

Используйте мышей того же фоне (C57BL / 6), мужчина, в возрасте 8-10 недель. Женские мыши более устойчивы, чем мужчины против индуцированной сепсисом летальности. Мыши старше 8 недель производят меньше переменных результаты, чем более молодых мышей с точки зрения выживания после CLP. Примерно N = 10 мышей в группе по сравнению должен быть использован для анализа выживаемости. N = 3-5 мышей достаточно для аутофагии анализов.

1. Используйте стерильные небольшие хирургические инструменты (именно скальпеля, ножницы и тупые анатомические щипцы), которые должны быть уместно для хирургии грызунов.
2. Подготовка анестезии смесь: Чтобы 7,95 мл PBS добавить 150 мкл Ксилазин (AnaSed впрыска 100 мг / мл) и 700 мкл Кетамин (Ketaset   C-III, 100 мг / мл).
3. Для обеспечения асептических условий во время процедуры, носить перчатки, маску и хирургическое платье.
4. Взвешивание животных. Обезболить их путем инъекции intraperitonally (IP) смесь упоминалось в шаге 3 в дозе мкл (10x массы тела в граммах). Например, для мыши весом 22 г, администрирование 10x22 = 220 мкл анестетика смеси. Таким образом, окончательные дозы ксилазина и кетамин являются 17 и 80 мг / кг массы тела соответственно. Убедитесь, что анестезия является адекватной; не сгибание конечности не должны быть извлечены после схождения щепоткой Примечание:. Используйте глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
5. Поместите животных на чистую рабочую поверхность на их спинах. Хвосты и задние лапы ориентированы на следователя. Лечить кожи живота употребления алкоголя (70%-ный раствор этанола). Примечание: Хирургическое область должна быть полностью бритая, чтобы не допустить загрязнения раны в результате контакта смех. Кроме того, оптимально, циркулирующий теплый подушка вода должна быть использована для поддержания нормотермию анестезированных мышей во время операции.
6. С помощью скальпеля, сделать небольшой продольный разрез кожи параллельно и примерно на 1 см слева средней линии. Пока не проникают в брюшную полость. Используйте маленькие ножницы, чтобы продлить первоначальный разрез.
7. Определить мышцы живота и анализировать их, получить доступ в брюшную полость.
8. С помощью тупых анатомические щипцы, определить слепой кишки и переместить его из брюшной полости. Будьте осторожны, чтобы не повредить мезентериальных сосудов (это может привести к летальному кровоизлияния).
9. Лигируют 60% от слепой кишки для достижения среднего класса сепсис. Лигирование равна или больше, чем 75% от слепой кишки обычно приводит к высокой степени сепсиса, тогда как лигирование, равной или менее 25% результатов слепой кишки в низкосортного сепсиса. Будьте осторожны, чтобы не перевязывать илеоцекального клапана (это может блокировать кишечной непрерывности).
10. С помощью21 G игла, перфорации слепой кишки на один сквозной и-через прокол (два отверстия) недалеко от перевязки. Направление перфорации должно быть от брыжеечных к анти-брыжеечной стороне слепой кишки. Будьте осторожны, чтобы не проколоть мезентериальных сосудов.
11. Удалите иглу. Осторожно выжать лигировали слепой кишки, чтобы подтвердить проходимость через два отверстия, и только небольшое количество фекалий должны быть экструдирован через них.
12. Перемещение лигируют и проколотый слепой кишки в брюшную полость.
    Примечание: Для фиктивных мышей, пропустите шаги 1,10-1,12.
13. Использовать шелк хирургических швов 6-0 с режущими иглу, чтобы закрыть брюшной мускулатуры. Использовать шелк хирургических швов 6-0 с режущими иглу, чтобы закрыть кожи живота.
14. Введите 1 мл нагретого (37 ° С) физиологический раствор ИС для замены тепло и увлажнение потерял во время процедуры. Поместите мышей под инфракрасной лампой, пока их реанимации. Примечание: Оптимально, безопаснее потепление устройство (суCH в качестве циркулирующей теплой воды) площадки могут быть использованы вместо инфракрасной лампой.
15. В послеоперационном периоде вводить buprenorphin (0,05 мг / кг массы тела подкожно). Для достижения обезболивания. Примечание: животное не следует оставлять без присмотра, пока он не пришел в достаточной сознание поддерживать грудины лежачее положение. Животное, которое претерпела хирургическое лечение не должны быть возвращены компании других животных, пока полностью выздоровел.
16. Поместите животных обратно в их клетках с неограниченным доступом к пище и воде. Мыши будут умерщвлены, когда они становятся умирающий (обозначается клинических признаков, таких как неспособность двигаться при прикосновении или цианоз). Проверьте мышам каждые 4 ч, чтобы избежать необходимости им умереть до эвтаназии.

2. Ткань Урожай и фиксация

1. Подготовьте 4% параформальдегида (PFA) решение: Для 889 мл PBS добавить 111 мл 37% PFA.
2. Жертвоприношение мышей с использованием либо СО _{2-индуцированный} наркоз или Кетамин / Ксилазин сПовышенное в высокой дозировке.
3. Остановите мышей на чистую рабочую поверхность. Спрей брюшной и грудной кожу 70%-ным раствором этанола его лечить.
4. Используйте скальпель и маленькие ножницы для удаления брюшной и грудной кожу, а также кожу, охватывающую зону трахеи.
5. Выявить трахею, удалив окружающие его ткани (мышцы и соединительной ткани).
6. Поставьте шов (без резки иглы) вокруг трахеи. Не затягивайте его еще.
7. С помощью небольшой периферической венозный катетер (20 г) в 'интубировать' трахеи. Будьте осторожны при введении катетера, чтобы избежать трахеи слезу. Обратите внимание, что самый большой диаметр трахеи чуть ниже перстневидного хряща.
8. Затянуть шов вокруг трахеи / катетера. Удалите иглу оставив только пластиковой канюли катетера в трахею. Игла служил в качестве руководства проволоки для вставки пластиковую канюлю.
9. После заручившись пластиковую канюлю в трахею, вырезать тыс.э брюшной мускулатуры, открыть живот и раскрыть диафрагму.
10. С помощью иглы, проколоть мембрану для производства пневмоторакс (т.е. вставки воздуха в плевральную полость). Легкие должны быть рухнул.
11. Использование маленькие ножницы, удалить диафрагму, разрезать вдоль грудины (стернотомии), удалить грудную клетку и раскрыть сердце и легкие.
12. Через пластиковой канюли, введенной в трахею, легкие исправить с формальдегидом раствора при 30 см H ₂ O давления.
13. Удалить легкие и не размещать их в 4% PFA в течение 24 часов и затем в 70% растворе этанола до обработки.
14. Выявление и устранение сердца, печени и почек. Таким же образом, не поместить их в 4% PFA в течение 24 ч, а затем в 70%-ном растворе EtOH до обработки.

3. GFP Мыши и просмотра GFP Слайды

1. Выполните CLP и фиктивные операции на GFP-LC3 мышей, как описано в шаге 1, и в послеоперационном процедурыс, как описано в шаге 2 протокола.
2. Вставить ткани (а именно легкие, сердце, печень и почки) в парафин и сократить их в серийных 5 мкм разделах.
3. Когда готов для окрашивания GFP, инкубировать при 60 ° С в течение 30-60 мин, пока парафин плавится и ткань не появится полупрозрачный.
4. Deparaffinize со стандартным серии градуированных ксилола или ксилола заменителей, 5 мин ксилол 1, ксилол 2, а ксилола 3 затем 3 мин инкубации в серии градуированных этанола: 100%, 95%, 75%, а затем промыть в дистиллированной воде.
   Примечание: После Депарафинирование избежать тканей высыхание, что увеличивает образец фон.
5. Выполните извлечение антигена с помощью лимонной кислоты буфера (10 мМ цитрат натрия кислоты, 0,05% Tween 20, рН 6,0), в микроволновую печь в течение 10-20 мин. Будьте осторожны, чтобы периодически заменять буфер, чтобы избежать тканей высыхание.
6. Разрешить решение для охлаждения в течение 20 мин на скамейке, чтобы завершить извлечение антигена.
7. Вымойте 2-3x с PBS. Удалите излишки буфера и траnsfer скользит от стойки в горизонтальное положение в коробке слайд или другой влажной камере, чтобы предотвратить высыхание.
8. Блок 45-60 мин при комнатной температуре с 10% нормальный осла сыворотки (также 5% бычий сывороточный альбумин, или предпочтительно сыворотки от животного, в котором было подготовлено вторичное антитело) в PBS.
9. Инкубируйте образцы в начальном GFP антител в разведении 1:100 в PBS в течение ночи при 4 ° С в увлажненной камере. Осторожно применять небольшие кусочки ткани над Parafilm с антителом для содействия гомогенной контакт с тканью и предотвращать испарение.
   Примечание: Остальные этапы выполняются при комнатной температуре.
10. Вымойте 5x с PBS, чтобы удалить лишнюю первичного антитела. Инкубируйте с вторичными антителами 1:500-1:1,000 в PBS в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
11. Вымойте 5x с PBS, чтобы удалить лишнюю вторичного антитела. Если желательно, контрастирующая слайды на этом шаге.
12. При использовании флуоресцентного вторичные антитела, инкубировать 0,1% судан черный в 70% этанола еили 15-20 минут, чтобы уменьшить аутофлюоресценция. Сотрите избыток Судан черный со всего ткани и мыть 5x с PBS в течение 20 мин.
13. Установите образца с покровным и хранить горизонтально, пока монтажный раствор не схватится.

4. Альтернативная протокол: Прямая Обнаружение GFP-LC3

1. Иглу и раздувать легкие с ~ 500 мл 50/50 об / об октября PBS.
2. Вставить в октябре, поместив небольшое количество октября в нижней части cryomold.
3. Осторожно поместите расчлененный комплекс легких в форме.
4. Медленно замерзают метилбутан охлажденным с помощью сухого льда.
5. Добавьте больше октябрь пока ткань не будет полностью покрыта и замерзла. Держите на сухом льду и хранить при температуре -80 ° С.
6. Использование cryomicrotome, вырезать 5-10 мкм разделы, защищающие разделы от света. Храните разделы и оставшиеся ткани при температуре -80 ° С.
7. Для подготовки слайдов для работы с изображениями, удалить раздел с морозильной камерой и сразу же нанесите каплю PBS, чтобы предотвратить высыхание.
8. Fix течение 30 мин с 4% PFA. Промыть PBS.
9. Применить DAPI / Hoescht в течение 10 мин. Вымойте 3x с PBS.
10. Установите образца с покровным и хранить горизонтально, пока монтажный раствор не схватится.
11. Изображение с помощью эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии. Храните образцы при температуре 4 ° С на срок до одного месяца.

5. Подготовка ткани для электронной микроскопии

1. Вырезать ткани в приблизительно 1 мм кубики для крепления.
2. Закрепить ткани в 2% формальдегида, 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М какодилатном натриевого буфера, рН 7,4.
3. Промыть 0,1 М какодилатном натрия буфера в течение 1-2 часов.
   Примечание: Фиксированный ткани могут быть сохранены в 0,1 М какодилате натрия при 4 ° С.
4. Начать исправления в 1% осмия в 0,2 буфере М натрий-какодилатном в течение 1 часа.
5. Промыть в 0,2 буфера какодилатном М натрия в течение 10 мин 3 раза.
6. Дегидрировать в 70% этанола, 20 мин 2 раза. Дегидрировать в 90% этанола, 10 мин 2 раза. Дегидрировать в 100% этанола,20 мин 2x.
7. Инкубировать с пропиленоксидом (эпоксидная пропан) в течение 10 мин 2 раза.
8. Инкубировать с пропиленоксид / эпоксидной смолы смеси (50:50) в течение 1 часа. Смесь смолы эпоксидной является: 24 г Агар 100 смолы, додеценилянтарной ангидрид 13 г, methylnadic ангидрид 13 г и 1 мл N-бензилдиметиламина. Тщательно перемешать в одноразовом стакане деревянным шпателем.
9. Выдержите с эпоксидной смолой в течение ночи в незакрытых флаконах (это позволяет любой оставшийся оксид пропилена испаряться).
10. Вставить в маркированных капсул со свежеприготовленным смолы. Заполимеризуйте при 60 ° С в течение 48 часов.
11. Срезы ткани для съемки с использованием просвечивающего электронного микроскопа при 80 или 60 кВ на электронном микроскопе пленки. Печать изображения на фотобумаге или сохранить в качестве цифровых медиа.
12. Анализ аутофагосом образование в неповрежденных клеток, содержащих ядро. Поля малой мощности (э. Гр. 2000-4000 X) может быть использован для идентификации ядерных клеток. Обычно 6,800-10,000 X изображения используются для гоявляется аутофагосом количественное. Всего Аутофагосомы на единицу площади от 15-30 полей для соответствующей статистической представительства. Аутофагосомы имеют двойную структуру мембраны, где поздней стадии autophogosomes напоминал заполнено вакуоли.

Результаты

Бактериемия присутствует у мышей уже в 6 часов после CLP-индуцированной сепсисом ^14. Клинические признаки сепсиса (включая озноб, тахипноэ и нарушенной двигательной активности) появляются приблизительно 12 ч после процедуры. Мыши подвергались CLP начинают умирать около 18 часов после ...

Обсуждение

Основным преимуществом CLP является то, что позволяет исследователям изучить сепсис различных степеней тяжести (то есть от низкой до середины и высокого класса). Тяжесть индуцированного сепсиса зависит от длины слепой кишки лигированного (которых наиболее важным фактором, определ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-LC3 Transgenic Mice	Riken (Japan)	RBRC00806	GFP-LC3#53
Xylazine	Henry-Schein	568-0606	Xylazine HCl Injection Vet
Ketamine	Henry-Schein	995-2949	Ketaset Inj 100 mg/ml
EtOH	Fisher	A405-20	Histology Grade
EtOH	Fisher	A407-1	For Sterilizatiion
silk surgical sutures 6-0	Owens & Minor	2300-0078OG, 017624
buprenorphine-HCl	Henry-Schein	614-5157	Buprenex Ampules
paraformaldehyde (37%) solution	JT Baker	S898-09
xylenes	Fisher	X3P-1GAL
anti-GFP monoclonal antibody	Life Technologies	G10362
Hoescht	Sigma	944403
DAPI	Invitrogen	D1306
OCT	VWR scientific	25608-930
Sudan Black	Santa Cruz	sc-203760
EM grade Glutaraldehyde 2.5% in sodium cacodylate	Electron microscopy Sciences	15960
propylene oxide	Sigma	240397
Agar 100 resin	Agar scientific	R1045
dodecenylsuccinic anhydride	Sigma	46346
methylnadic anhydride	Sigma	45359
N-benzyldimethylamine	Sigma	185582