ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Summary

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

Abstract

זמן לשגות הדמיה היא טכניקה המאפשרת תצפית הישירה של תהליך המורפוגנזה, או הדור של צורה. בשל הבהירות האופטית שלהם ורמת מוכנות למניפולציה גנטית, עובר דג הזברה הפך אורגניזם מודל פופולרי שבה לביצוע ניתוח הזמן לשגות של המורפוגנזה בעוברי חיים. ההדמיה confocal של עובר דג הזברה לחיות דורשת כי רקמה של עניין היא שכותרתו בהתמדה עם סמן פלואורסצנטי, כגון transgene או צבע שהוחדר. התהליך דורש כי העובר הוא הרדים ושנערך במקום בצורה כזאת, שהתפתחות בריאה ממשיכה כרגיל. פרמטרים להדמיה חייבים להיות מוגדרים חשבון לצמיחה תלת ממדים וכדי לאזן את הדרישות של פתרון תאים בודדים תוך קבלת תמונות מהירות של פיתוח. התוצאות שלנו מראות את היכולת לבצע לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo של עוברי דג הזברה שכותרתו הקרינה ולזהות התנהגויות רקמה מגוונות בהרכס עצבי הגולגולת שגורמים למומי craniofacial. עיכובים התפתחותיים הנגרמים על ידי הרדמה והרכבה הם מינימאליים, והם עוברים ללא פגע על ידי התהליך. ניתן להחזיר עובר זמן לשגות הדמיה למדיום נוזלי ולאחר מכן צילם או קבוע בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. עם שפע הולך וגדל של קווים מהונדסים דג הזברה ומיפוי גורל מאופיין היטב וטכניקות השתלה, הדמיה כל רקמה רצויה אפשרית. ככזה, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo משלב עוצמה עם שיטות גנטיות דג הזברה, כוללים ניתוחים של עוברים שעברו מוטציה וmicroinjected.

Introduction

המורפוגנזה Craniofacial היא תהליך רב שלבים מורכב הדורש אינטראקציות מתואמות בין סוגי תאים מרובים. רוב שלד craniofacial נגזר מתאי רכס עצביים, שרבים מהם חייבים לעבור מ הצינור העצבי הגבי למבנים ארעיים שנקראים קשתות בלוע ^1. כמו ברקמות רבות, המורפוגנזה של שלד craniofacial היא יותר מסובכת ממה יכול להיות מובן על ידי תמונות סטטיות של עוברים בנקודות זמן ההתפתחותי ספציפיות. למרות שזה הוא לבצע זמן רב, in vivo מיקרוסקופיה זמן לשגות מספקת מבט מתמשך בתאים של עובר המתפתח ורקמות. כל תמונה בסדרת הזמן לשגות מעניקה הקשר לאחרים, ומסייעת למהלך חוקר לכיוון של הסקה מדוע תופעה מתרחשת ולא הסיק את מה שמתרחש באותו זמן.

בתחום ההדמיה vivo הוא אפוא כלי תיאורים רב עוצמה לגישות ניסיוניות ללפרק את המסלולים המנחים המורפוגנזה. Rerio Danio דג הזברה הוא מודל גנטי פופולרי של התפתחות עוברית של בעלי החוליות, והוא מתאים במיוחד גם בתחום ההדמיה vivo של המורפוגנזה. מודרני, שיטות נוחים לtransgenesis ושינוי גנומי הן מתקדמות במהירות מספר הכלים העומדים לרשות חוקרי דג הזברה. כלים אלה לשפר את השיטות חזקות כבר למניפולציה ומיקרוסקופיה גנטיות. בvivo הדמיה של כמעט כל רקמה בכמעט כל קשר גנטי רצוי היא קרובה יותר למציאות מאשר לדמיון.

תנועות morphogenetic של קשתות בלוע הם מודרכים על ידי איתות אינטראקציות בין הרכס העצבי והאפיטל הסמוך, שניהם האאקטודרם והאנדודרם. ישנן מולקולות רבות איתות שהביעו האפיטל כי יש צורך לנהוג המורפוגנזה של אלמנטי שלד craniofacial. בין מולקולות האיתות הללו, סוניק קיפוד (ששש) הוא f החשובה באופן קריטיאו פיתוח craniofacial ^2-8. ששש מתבטאים בשני האאקטודרם הפה ובלוע האנדודרם ^2,6,9,10. הביטוי של ששש בהאנדודרם מסדיר תנועות morphogenetic של הקשתות ^10, דפוסים של רכס עצבי בתוך הקשתות ^10, וצמיחה של שלד craniofacial ^11.

איתות bmp היא גם חשובה באופן קריטי לפיתוח craniofacial ¹² ועשויה לשנות המורפוגנזה של קשתות בלוע. איתות bmp מסדירה גב / הגחון דפוסים של רכס בתוך קשתות בלוע ^13,14. שיבוש של smad5 בדג הזברה גורם למומי חיך קשים וכישלון של סחוסים של המקלה הפתיל כראוי על קו האמצע ^15. בנוסף, מוטציות גם להציג ירידות ואיחוי באלמנטי סחוס הגחון, עם ^nd 2, 3 ^rd, ולפעמים אלמנטי קשת בלוע 4 ^ה התמזגו בקו האמצע ¹⁵. שילובים אלו ממליצים כי איתות Bmp מכוונת המורפוגנזה של אלמנטי בלוע אלה.

איתות PDGF היא הכרחית להתפתחות craniofacial, אבל יש לו תפקידים ידועים בהמורפוגנזה קשת בלוע. עכבר ומוטציות PDGFRA דג הזברה לשניהם יש clefting midfacial העמוק ^16-18. לפחות בדג הזברה clefting midfacial זאת בשל כישלונה של נדידת תאי רכס עצביים תקינה ^16. תאי רכס עצביים ממשיכים להביע PDGFRA אחרי שהם נכנסו לקשתות בלוע. בנוסף, ligands PDGF באים לידי ביטוי על ידי epithelia פנים ובתוך קשתות בלוע ^16,19,20, ובכך איתות PDGF יכולה גם לשחק תפקיד בהמורפוגנזה של קשתות בלוע בעקבות הגירה. עם זאת, ניתוח של המורפוגנזה של קשתות בלוע במוטנטים PDGFRA לא בוצעו.

הנה, אנחנו מדגימים במיקרוסקופיה confocal vivo של pharyngulבשלב דג הזברה מהונדס ולתאר את המורפוגנזה של קשתות בלוע בתוך תקופה זו. בנוסף, אנו מראים התנהגויות רקמה שמושפעות על ידי מוטציות המשבשות את BMP, PDGF, ומסלולי איתות ששש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. גידול בעלי חיים וMutant אללים

1. לגדל ולהרבות דג הזברה כמתואר ^21.
2. אללים מוטציה דג הזברה השתמשו במחקר זה היו PDGFRA ^{b1059 16, B1100} smad5 ^{22, וb577} SMO ^23. מקורות לזני דג הזברה אלה כוללים Zirc.

2. הכנה של פתרונות ומיישמת

הערה: כל הפתרונות וכלים יכולים להתבצע מראש ולאחסן לשימוש עתידי.

1. הפוך תקשורת עובר (EM) כפי שתואר ²¹ בעבר.
2. הפוך 4 גר '/ ליטר MS-222 (Tricaine). לפזר 4 פוספט גרם disodium (Na ₂ HPO ₄₎ ב450 מיליליטר מים סטריליים. הוסף 2 גרם של MS-222 לפתרון. התאם ל-pH בתוך 7.0-7.2. מוסיף מים סטריליים להיקף כולל של 500 מיליליטר.
3. אופציונאלי: הפוך שמן ציפורן 4 גר '/ ליטר. שוקל שמן ציפורן טהורה 0.2 גרם בצינור חרוטי 50 מיליליטר. הוספת EM להיקף כולל של 50 מיליליטר. חנות ב 4 ° C.
4. הפוך methylcellulo 3%se. להביא 50 מיליליטר של EM + M 0.1 HEPES לרתיחה. מסירים מאש. מערבבים ב1.5 methylcellulose גרם עד שהתמיסה אחידה. חנות ב 4 ° C.
5. הפוך agarose 0.2%. הוסף 0.1 agarose גרם ל50 EM מיליליטר. אביא אותם לרתיחה במיקרוגל או על פלטה חמה ולוודא כי agarose נמס. Aliquot לתוך 500 כרכי μl בmicrocentrifuge צינורות ולאחסן ב 4 ° C. הערה: ניתן להתאים כרכים בהתאם לצורך.
6. הפוך דוקרנים נימים. מניחים ירידה של דבק סופר בתוך צינור נימים מזהה 0.9 מ"מ. הכנס אורך 4-5 סנטימטר של קו 6 £ מבחן monofilament דיג בתוך צינור הנימים כך שכ 3-4 מ"מ של קו משתרע מעבר לקצה הצינורית.
7. בצע שני coverslips גישר לדגימה. Super-דבק 22 x 22-1 מכסה זכוכית על כל קצה של מכסה זכוכית 24 x 60-1 עוזבת באמצע בחינם. הפוך רווקים (1 מכסה זכוכית קטנה לסוף) לעוברים פחות מיום ישן, זוגות (2 כוסות כיסוי קטנות על גב אחד את השני לסוף) לעוברים 03:59 דays הישן, או משולשים (3 כוסות כיסוי קטנות על גב אחד את השני לסוף) לעוברים חמישה ימים ומעלה.
8. ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום גבוה. הערה: גריז אבק משמש כחומר איטום על מנת למנוע התייבשות של דגימות על פני תקופות זמן ארוכות, ויש לו פוטנציאל נמוך לרעילות בהשוואה לחומרי איטום תנודתי יותר.

3. עוברי דג הזברה הרכבה למיקרוסקופיה confocal (ראה איור 1)

1. להכין מדיום הרדמה. ממסים aliquot של agarose 0.2% על ידי במיקרוגל ב20 מרווחי שניות עד שנוזלים לחלוטין. מערבבים 8 μl של MS-222 ל192 μl של agarose 0.2% או 5 μl של שמן ציפורן 4 גר '/ ליטר ל195 μl של agarose 0.2%. לשמור בבלוק חימום 42 מעלות צלזיוס. הערה: חשיפה ארוכה ל-MS-222 גורמת לעיכובים התפתחותיים חזקים יותר משמן ציפורן עושה בדג זברה עוברי ^24.
2. במידת צורך: ידני dechorionate עוברים מהונדסים ביצה שלא נולדו כדי להיות מנותחים רק לפני הניתוח. בעזרת מלקחיים, te לאטar סיסית פתוח עד העובר הוא שוחרר.
3. להרדים את עוברי דג הזברה. הוסף 1 מיליליטר של מניית 4 גר '/ ליטר של MS-222-24 מיליליטר של תקשורת עובר. לחלופין, להוסיף 390 μl של שמן ציפורן 4 גר '/ ליטר ל24 מיליליטר מים דגים ^24. הערה: מעשי שמן ציפורן לאט כל כך לבצע שלב זה לפחות 15-20 דקות לפני מיקרוסקופיה הזמן לשגות.
4. הנח טיפת שומן ואקום סביב מרחב מרכז coverslip גישר הפונה כלפי מעלה. לאט לאט לדחוף את גריז הוואקום מהמזרק, מה שהופך את חרוז חלק, רציף שנמצא בסמוך ולפנימי של הגשרים וקצה coverslip.
5. מורחים מעגל methylcellulose 4% באמצע coverslip לגישור באמצעות המוליך עץ.
6. העבר את העובר להיות צילם. כאשר העובר הוא מורדם לצייר אותו לתוך כוס טפטפת. החזק את פיפטה בצורה אנכית על מנת לאפשר לעובר לשקוע לתחתית של הנוזל בפיפטה. הזז את פיפטה לתוך פתרון agarose ולאפשר לעובר לרדתלagarose. אל תגרש את הנוזל.
7. מניחים את הדגימה. צייר כמה פתרון agarose ואת העובר לתוך פיפטה. לגרש את העובר בירידה של פתרון agarose על גבי methylcellulose. השתמש בפוקר נימים לדחוף את העובר כלפי מטה על methylcellulose ולכוון את העובר כרצוי להדמיה.
8. לאטום את הדגימה.
   1. מניחים coverslip גישר אחד על גבי רכוב אחד, פונה כלפי מטה. לחול גם לחץ על שני הצדדים של את coverslips דחוק עד הגשרים ליצור קשר ישיר וחותמות ירידת agarose לשני coverslips. ודא שהעובר הוא בכיוון נכון.
   2. לשפשף המוליך עץ לאורך הזכוכית כדי להחליק את סדקים ופערים בחרוז גריז ואקום. למחות שומן עודף מהקצוות.

4. זמן לשגות Confocal הדמיה של עוברי דג הזברה מהונדסים

(פרוטוקול זה כבר מותאם למיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 710ing תוכנת הדמיה ZEN, והוא יכול להיות שונה לשימוש עם מערכות אחרות.)

1. הפעל ציוד. הפעל מיקרוסקופ confocal וכל מכשירי לייזר חיצוניים. הפעל את המחשב מחובר למיקרוסקופ confocal. תוכנת הדמיה confocal הפתוח ובחר "מערכת התחל" כדי להפעיל את פקדי רכישת תמונה.
2. הכן את הבמה מחוממת. מנמיכים את פלטפורמת האחסון הזמני של מיקרוסקופ confocal ולהעביר את העדשות אובייקטיביות מחוץ לעמדה. החלף את שלב ברירת המחדל עם במה מחוממת אלקטרונית. הפעל את הבקר לבמה המחוממת ולהגדיר את הטמפרטורה ל29.5 ° C.
3. מקם את הדגימה בשדה הראייה. הנח את הדגימה רכוב על הבמה. להעביר העדשה האובייקטיבית 20X למצב ולגדל פלטפורמת הבימוי. הפעל את פולט האור הנראה ולהסתכל דרך העיני. מרכז את ראשו של העובר בשדה הראייה.
4. להגדיר הגדרות ניסוי.
   1. הפעל ערוצי הקרינה על ידי בחירהאורך גל הניאון כדי להיות מזוהה ולבחור שולחנות בדיקת צבע (LUT) עבור כל ערוץ. במידת צורך, השתמש בפקדים ידניים בתוכנה כדי להפעיל את הלייזרים הנדרשים (למשל 561 ננומטר עבור RFP). עבור כל ערוץ הקרינה, הגדר את עוצמת הלייזר ל10.0 והמתח מכפיל (HV או רווח) בין 600-700. הגדר את המיצוע עד 4 ומעט עומק ל16 קצת.
   2. הפעל את המודולים סדרת Z-מחסנית וזמן. הגדר את חריר לרזולוציה-Z 5 מיקרומטר או קטן יותר, ולהגדיר את Z-המרווח למרחק האופטימלי שהציע.
      הערה: באופן כללי, 5 ברזולוציה Z מיקרומטר מאפשרת לכל תמונת Z-מחסנית להיות שנאספו במהירות מספקת ל" צילום "של העובר בנקודת זמן מסוימת גם בעת פתרון תאים בודדים. הורדת המיצוע גם מפחיתה את כמות הזמן לכל תמונה.
   3. הגדר את מרווח הזמן הרצוי בין תמונות (בדרך כלל 10-20 דק ') ואת האורך הכולל של הניסוי.
5. הגדר positionalמידע.
   1. הפעל את המצלמה למצב חי. התאם את המיקוד ולהגביר את עוצמת לייזר במידת צורך כדי לראות הקרינה. הגדר את הזום הדיגיטלי ל0.6 לראייה רחבה יותר, אם תרצה בכך.
   2. מקם את הבמה באופן שכל המבנים של עניין גלויים ויש מקום בשדה הראייה לdorsally תולדה וanteriorly. תתמקד בעובר לגבולות העליונים ותחתונים של הקרינה. הגדר את העמדות הפרוסה Z-המחסנית הראשונה ואחרונים לפחות 100 מיקרומטר או יותר מעבר לגבולות אלה.
6. לייעל את עוצמת הקרינה.
   1. הגדר את LUT התצוגה לטווח מחוון. מבני ניאון אמורים להופיע כעת לבנים, ושאר שדה הראיה צריך להיות כחול (אין זיהוי) או שחורים.
   2. הגדל HV / רווח לרמה ממש מתחת איפה רווי פיקסלים (אדום) יופיעו. במידת צורך, להתאים קיזוז כך רוב הרקע לא מזוהה (כחול). הערה: קטן יותר בקוטר חריר ועוצמת לייזר גדלה גם לשפר def תמונהinition, אבל עוצמת לייזר חייבת להישמר נמוכה כדי לשמור על רקמות חיות. HV / רווח גדל וקוטר חריר (<מיקרומטר 5) הם בדרך כלל עדיפים על עוצמת לייזר מוגברת.
   3. שמור את קוטר חריר רחב מספיק כדי לאסוף תמונות מבעוד מועד, עם ממוצע של ערכות ל4. Z-המרווח תמיד צריך להיות מוגדר למרחק האופטימלי הציע לקוטר חריר. לבצע סריקות קצרות (מיצוע = 1) עם הגדרות שונות, ולהשתמש בעוצמת הלייזר המינימלית שמשיגה רזולוציה רצויה.
7. הפעל את הניסוי לכל האורך הרצוי של זמן. לאחר מכן, להסיר את העובר מן הבמה המחוממת ולהפריד לאט coverslips. להטביע את coverslip ועובר בEM בצלחת פטרי 30 מ"מ. בעזרת פיפטה זכוכית לשטוף בעדינות את העובר משל coverslip ולהסיר את coverslip מצלחת פטרי. מניחים את העובר לאינקובטור C ° 28.5 להמשיך ולפתח.
8. שקלו את הצמיחה. בסוף הניסוי, תיקח ZS ​​הבודדתמונות נקודת סימון של עוברי אח רכוב agarose שהועלו באופן דומה לדגימה בתחילת הניסוי, אבל הועלו בEM בחממה 28.5 מעלות צלזיוס.
9. למדוד קשתות בלוע, במידת הצורך. ניתן לבצע מדידות בכמה חבילות תוכנת confocal. מדידות מצאו כאן בוצעו באמצעות Fiji25 ידי יבוא ו-Z-מקרין קבצים. LSM של מסגרות פרטיות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בעוברי wild-type, בעקבות אוכלוסיית רכס עצבית, קשתות בלוע להאריך לאורך צירי הגחון קדמי / אחורי וגב / תוך כדי התנועה בכיוון מקורי (סרט 1). ב30 שעות לאחר הפריה (hpf), האורך קדמי / האחורי של קשת בלוע הראשונה הוא בין 1.8-1.9 פעמים הגבי / גובה גחונה. גב / התארכות הגחון ממשיכה בהתמדה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות היא כלי רב עוצמה לניתוח של התפתחות. הנה, אנחנו מדגימים את התועלת של השיטה בלימוד המורפוגנזה קשת בלוע בדג זברה שהן מוטציה למסלולי איתות חשובות באמצעות מהונדס כי תוויות בתאי רכס עצביים. בנוסף לרמת רקמת ניתוחים, ניתוחי זמן לשגות תקפים גם לניתו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.