Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Riepilogo

Time-lapse imaging confocale è una tecnica potente utile per caratterizzare sviluppo embrionale. Qui, descriviamo la metodologia e caratterizzare morfogenesi craniofacciale wild-type, così come PDGFRA, smad5, e SMO embrioni mutanti.

Abstract

Time-lapse imaging è una tecnica che permette l'osservazione diretta del processo di morfogenesi, o la generazione di forma. Grazie alla loro chiarezza e la riconducibilità alla manipolazione genetica ottica, l'embrione zebrafish è diventato un organismo modello popolare con cui eseguire l'analisi time-lapse della morfogenesi in embrioni viventi. Confocale di un embrione zebrafish vivo richiede che un tessuto di interesse è persistentemente marcata con un marcatore fluorescente, quale un transgene o colorante iniettato. Il processo richiede che l'embrione è anestetizzato e tenuto in posizione in modo tale che lo sviluppo sano procede normalmente. Parametri per l'imaging devono essere impostati per spiegare la crescita tridimensionale e di bilanciare le esigenze di risolvere singole cellule mentre ottenere rapidi snapshot di sviluppo. I nostri risultati dimostrano la capacità di eseguire a lungo termine imaging in vivo di embrioni di zebrafish fluorescenza etichettati e per rilevare vari comportamenti dei tessuti incresta neurale cranica che causano anomalie cranio-facciali. Ritardi nello sviluppo causati da anestesia e montaggio sono minime, e gli embrioni sono illesi dal processo. Embrioni Time-lapse impressi possono essere restituiti a mezzo liquido e successivamente ripreso o fissati ai punti successivi dello sviluppo. Con l'abbondanza crescente di linee di zebrafish transgenici e mappatura destino ben caratterizzato e tecniche di trapianto, l'imaging qualsiasi tessuto desiderato è possibile. Come tale, time-lapse imaging in vivo coniuga potentemente con metodi genetici zebrafish, comprese le analisi di embrioni mutanti e microiniettati.

Introduzione

Morfogenesi craniofacciale è un complesso processo multi-step che richiede interazioni coordinate tra più tipi di cellule. La maggior parte dello scheletro craniofacciale è derivato da cellule della cresta neurale, molti dei quali devono migrare dal tubo neurale dorsale in strutture transitori chiamati archi faringei ^1. Come in molti tessuti, morfogenesi dello scheletro craniofacciale è più complicato che può essere compreso da immagini statiche di embrioni in punti temporali specifici dello sviluppo. Sebbene per funzionare richiede tempo, in vivo microscopia time-lapse fornisce un aspetto continuo a cellule e tessuti di un embrione di sviluppo. Ogni immagine in una serie di time-lapse presta contesto agli altri, e aiuta una mossa investigatore verso dedurre perché si verifica un fenomeno anziché dedurlo ciò che sta avvenendo in quel momento.

Imaging in vivo è quindi un potente strumento descrittivo per approcci sperimentalidecostruire i percorsi che guidano la morfogenesi. Il Danio rerio zebrafish è un modello genetico popolare di sviluppo embrionale dei vertebrati, ed è particolarmente adatto per l'imaging in vivo della morfogenesi. Moderno, comodi metodi di transgenesi e la modifica genomica stanno rapidamente avanzando il numero di strumenti a disposizione dei ricercatori di zebrafish. Questi strumenti permettono di migliorare metodi già robuste per la manipolazione genetica e la microscopia. Immagini in vivo di quasi tutti i tessuti in quasi ogni contesto genetico desiderato è più vicino alla realtà di quanto la fantasia.

Movimenti morfogenetici degli archi faringei sono guidati da segnalare interazioni tra la cresta neurale e gli epiteli adiacente, sia ectoderma e endoderma. Numerose sono le molecole di segnalazione espresse dal epiteli che sono necessarie per guidare la morfogenesi di elementi scheletrici craniofacciali. Tra queste molecole di segnalazione, Sonic Hedgehog (Shh), è di fondamentale importanza fo sviluppo craniofacciale ^2-8. Shh è espresso sia dalla ectoderma cavo orale e faringe endoderma ^2,6,9,10. L'espressione di Shh nel endoderma regola i movimenti morfogenetici degli archi ^10, patterning di cresta neurale all'interno degli archi ^10, e la crescita dello scheletro craniofacciale ^11.

Segnalazione Bmp è anche di fondamentale importanza per lo sviluppo craniofacciale ¹² e può alterare la morfogenesi degli archi faringei. Segnalazione Bmp regola dorsale / ventrale patterning di cresta all'interno degli archi faringei ^13,14. Turbativa di smad5 in zebrafish causa gravi difetti palatali e un fallimento della cartilagini del Meckel di fondere in modo appropriato sulla linea mediana ^15. Inoltre, i mutanti mostrano anche riduzioni e fusione negli elementi cartilagine ventrale, con il 2 ^°, 3 ^°, e talvolta elementi arco 4 ^° faringea fusi sulla linea mediana ¹⁵. Queste fusioni suggeriscono fortemente che la segnalazione Bmp dirige la morfogenesi di questi elementi faringee.

Segnalazione PDGF è necessario per lo sviluppo cranio-facciale, ma ha ruoli sconosciuti in faringeo arch morfogenesi. Sia il mouse e zebrafish mutanti PDGFRA hanno profonda clefting mediofacciale ^16-18. Almeno in zebrafish questo clefting mediofacciale è dovuta ad un imperfetto della migrazione delle cellule della cresta neurale ^16. Cellule della cresta neurale continuano ad esprimere PDGFRA dopo essere entrati gli archi faringei. Inoltre, leganti PDGF sono espresse da epiteli facciale e all'interno degli archi faringei ^16,19,20, così segnalazione PDGF potrebbero anche svolgere un ruolo nella morfogenesi degli archi faringei seguenti migrazione. Tuttavia, le analisi della morfogenesi degli archi faringei in mutanti PDGFRA non sono stati eseguiti.

Qui, dimostriamo in vivo microscopia confocale di pharynguluna fase zebrafish transgenico e descrivere la morfogenesi degli archi faringei entro questo periodo. Dimostriamo inoltre i comportamenti dei tessuti che sono affetti da mutazioni che interrompono la Bmp, PDGF, e vie di segnalazione Shh.

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Protocollo

1. Zootecnia e mutante alleli

1. Sollevare e razza zebrafish come descritto ^21.
2. Zebrafish alleli mutanti utilizzati in questo studio sono stati PDGFRA ^{b1059 16, B1100} smad5 ^22, e SMO ^{B577 23.} Fonti per questi ceppi di zebrafish sono Zirc.

2. Preparazione di soluzioni e attrezzi

Nota: Tutte le soluzioni e gli strumenti possono essere fatte in anticipo e conservati per uso futuro.

1. Rendere i media embrione (EM), come descritto in precedenza ^21.
2. Fai 4 g / L MS-222 (Tricaine). Sciogliere 4 g di fosfato di sodio (Na ₂ HPO ₄₎ in 450 ml di acqua sterile. Aggiungere 2 g MS-222 alla soluzione. Regolare il pH entro 7,0-7,2. Aggiungere acqua sterile fino ad un volume totale di 500 ml.
3. Optional: Marca 4 g / L di olio di chiodi di garofano. Pesare 0,2 g di olio di chiodi di garofano puro in una provetta da 50 ml. Aggiungere EM ad un volume totale di 50 ml. Conservare a 4 ° C.
4. Fai 3% methylcelluloSE. Portare a 50 ml di EM + 0,1 M HEPES a ebollizione. Togliere dal fuoco. Mescolare in 1,5 g di metilcellulosa ottenere una soluzione omogenea. Conservare a 4 ° C.
5. Fai 0,2% agarosio. Aggiungere 0,1 g di agarosio a 50 ml EM. Portare EM ad ebollizione nel forno a microonde o su una piastra e verificare che l'agarosio si è dissolto. Aliquota in 500 volumi microlitri in tubi microcentrifuga e conservare a 4 ° C. Nota: I volumi possono essere regolati in base alle esigenze.
6. Fai mazze capillari. Mettere una goccia di colla super all'interno di un tubo capillare 0,9 millimetri ID. Inserire una lunghezza 4-5 cm del 6 Prova Lb monofilamento lenza all'interno del tubo capillare tale che circa 3-4 mm di linea si estende oltre l'estremità del tubo.
7. Fare due lamelle a ponte per campione. Super-colla 22 x 22-1 vetro di copertura su ogni estremità di una copertura in vetro 24 x 60-1 lasciando il centro libero. Fai single (1 piccolo vetro di copertura per fine) per gli embrioni di meno di un giorno di vita, raddoppia (2 piccoli bicchieri di copertura sulla parte superiore di ogni altro per estremità) per gli embrioni 03:59 days vecchi, o triple (3 bicchierini di copertura sulla parte superiore di ogni altro per estremità) per gli embrioni cinque giorni o più.
8. Riempire una siringa da 10 ml con grasso alto vuoto. Nota: grasso per vuoto serve come sigillante per prevenire la disidratazione dei campioni per lunghi periodi di tempo ed ha un basso potenziale di tossicità rispetto ai sigillanti più volatili.

3. Montaggio embrioni di zebrafish per Microscopia confocale (vedi figura 1)

1. Preparare mezzo anestetico. Sciogliere un'aliquota dello 0,2% agarosio da forno a microonde in intervalli di 20 secondi fino a completo liquido. Mescolare 8 ml di MS-222 in 192 ml di 0,2% agarosio o 5 ml di 4 g / L di olio di chiodi di garofano in 195 ml di 0,2% agarosio. Mantenere in un blocco di riscaldamento 42 ° C. Nota: Lunga esposizione a MS-222 provoca ritardi nello sviluppo forte di olio di chiodi di garofano fa in zebrafish embrionale ^24.
2. Se necessario: dechorionate manualmente gli embrioni transgenici non schiuse da analizzare solo prima dell'analisi. Utilizzando pinze, lentamente tear il corion aperta fino l'embrione viene liberato.
3. Anestetizzare gli embrioni di zebrafish. Aggiungere 1 ml di 4 g / L stock di MS-222-24 ml di mezzi di embrioni. In alternativa, aggiungere 390 ml di 4 g / L di olio di chiodi di garofano per 24 ml di acqua di pesce ^24. Nota: gli atti di chiodi di garofano lentamente in modo da eseguire questo passaggio, almeno 15-20 minuti prima di microscopia time-lapse.
4. Mettere una goccia di grasso per vuoto attorno allo spazio centrale di un vetrino ponte rivolta verso l'alto. Lentamente spingere il grasso per vuoto dalla siringa, rendendo un liscio, cordone continuo che è adiacente e all'interno dei ponti e il bordo del vetrino.
5. Diffondere un cerchio di 4% di metilcellulosa al centro del vetrino a ponte con un applicatore di legno.
6. Trasferire l'embrione deve essere ripreso. Quando l'embrione è anestetizzato tirarla fino in una pipetta di vetro. Tenere la pipetta verticalmente per permettere l'embrione a depositarsi sul fondo del liquido nella pipetta. Spostare la pipetta nella soluzione di agarosio e consentire l'embrione a gocciain agarosio. Non espellere il liquido.
7. Posizionare il provino. Disegnare qualche soluzione di agarosio e l'embrione nella pipetta. Espellere l'embrione in una goccia di soluzione di agarosio in cima alla metilcellulosa. Utilizzare un poker capillare per spingere l'embrione verso il basso sul metilcellulosa e orientare l'embrione come desiderato per l'imaging.
8. Sigillare il campione.
   1. Posizionare un vetrino ponte sopra l'montati uno, rivolto verso il basso. Applicare una pressione uniforme su entrambi i lati i coprioggetti sandwich fino a quando i ponti in contatto diretto e le guarnizioni goccia di agarosio ad entrambe le lamelle. Verificare che l'embrione sia orientata correttamente.
   2. Strofinare un applicatore di legno lungo il vetro per appianare le crepe e lacune nella tallone grasso per vuoto. Eliminare il grasso in eccesso dai bordi.

4. Time-lapse confocale Imaging di transgenici embrioni di zebrafish

(Questo protocollo è stato ottimizzato per un microscopio confocale Zeiss LSM 710 cizione software di imaging ZEN, e possono essere modificati per essere utilizzati con altri sistemi.)

1. Attiva attrezzature. Accendere il microscopio confocale e tutti i dispositivi laser esterni. Accendere il computer collegato al microscopio confocale. Software di imaging Aprire confocale e selezionare "Start System" per attivare i comandi di acquisizione di immagini.
2. Preparare palco riscaldato. Abbassare la piattaforma messa in scena del microscopio confocale e spostare le lenti dell'obiettivo fuori posizione. Sostituire il palco di default con uno stadio elettronico riscaldata. Accendere il controller per la fase riscaldato e impostare la temperatura di 29,5 ° C.
3. Posizionare il campione nel campo visivo. Porre il campione montati sul palco. Spostare la lente obiettivo 20X in posizione e sollevare la piattaforma messa in scena. Attivare l'emettitore di luce visibile e guardare attraverso gli oculari. Centro della testa dell'embrione nel campo visivo.
4. Definire le impostazioni dell'esperimento.
   1. Attivare canali di fluorescenza selezionandola lunghezza d'onda fluorescente per essere rilevato e scegli tabelle di colore lookup (LUT) per ogni canale. Se necessario, utilizzare i controlli manuali del software per accendere i laser necessarie (ad esempio 561 nm per RFP). Per ogni canale di fluorescenza, impostare l'intensità del laser a 10.0 e la tensione fotomoltiplicatore (HV o guadagno) tra 600-700. Impostare la media a 4 e la profondità di bit a 16 bit.
   2. Attivare i moduli della serie Z-stack e di tempo. Impostare la pinhole di Z-risoluzione 5 micron o più piccolo, e impostare l'intervallo Z alla distanza ottimale suggerito.
      Nota: Generalmente, 5 micron Z-risoluzione consente ogni immagine Z-stack da raccogliere abbastanza rapidamente per un '"istantanea" dell'embrione in un punto particolare tempo, mentre anche la risoluzione singole celle. Abbassando la media riduce anche la quantità di tempo per immagine.
   3. Definire l'intervallo desiderato di tempo tra le immagini (di solito 10-20 min) e la lunghezza totale dell'esperimento.
5. Impostare posizionaleinformazioni.
   1. Accendere la fotocamera in modalità live. Regolare la messa a fuoco e aumentare l'intensità del laser, se necessario vedere fluorescenza. Impostare lo zoom digitale a 0.6 per una visione più ampia, se lo si desidera.
   2. Posizionare la fase così che tutte le strutture di interesse siano visibili e c'è spazio nel campo di vista per dorsalmente escrescenza ed anteriormente. Concentrarsi attraverso l'embrione ai limiti superiore e inferiore della fluorescenza. Impostare la prima e l'ultima fetta Z-stack almeno 100 micron o più al di là di questi limiti.
6. Ottimizzare intensità di fluorescenza.
   1. Impostare la LUT visualizzazione di spaziare indicatore. Strutture fluorescenti dovrebbero ora appaiono bianche, e il resto del campo visivo dovrebbe essere blu (nessun rilevamento) o nero.
   2. Aumenta HV / guadagno a un livello appena al di sotto dove saturo (rosso) pixel visualizzati. Se necessario, regolare compensare così la maggior parte dello sfondo non viene rilevato (blu). Nota: Più piccolo diametro pinhole e una maggiore intensità del laser sia per migliorare l'immagine definizione, ma l'intensità del laser deve essere mantenuta bassa per conservare tessuti viventi. Aumento HV / guadagno e del diametro pinhole (<5 micron) sono generalmente preferibile una maggiore intensità del laser.
   3. Tenere il diametro del foro abbastanza largo per raccogliere le immagini in modo tempestivo, con una media set a 4. La Z-intervallo deve essere sempre impostato sulla distanza ottimale suggerito per il diametro pinhole. Eseguire scansioni brevi (media = 1) con diverse impostazioni, e utilizzare l'intensità minima laser che raggiunge la risoluzione desiderata.
7. Esegui l'esperimento per il tempo desiderato. In seguito, rimuovere embrione dal palco riscaldato e lentamente separare le lamelle. Immergere il vetrino ed embrione in EM in una capsula di Petri 30 millimetri. Usando una pipetta di vetro lavare delicatamente l'embrione fuori del vetrino e rimuovere il vetrino dalla piastra di Petri. Posizionare l'embrione in un incubatore 28,5 ° C di continuare a sviluppare.
8. Confronta crescita. Alla fine dell'esperimento, prendere individuale Zsimmagini virata di embrioni fratelli montato agarosio che analogamente sono stati in scena al provino all'inizio dell'esperimento, ma sono state sollevate in EM in un incubatore 28,5 ° C.
9. Misurare archi faringei, se necessario. Le misurazioni possono essere eseguite in alcune suite software confocale. Misure trovati qui sono stati eseguiti utilizzando Fiji25 importando e Z-proiezione di file. LSM di singoli fotogrammi.

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Risultati

In wild-type embrioni, seguendo la popolazione cresta neurale, gli archi faringei allungano lungo gli assi ventrali anteriori / posteriori e dorsali / mentre si muove in una direzione rostrale (Movie 1). A 30 ore dopo la fecondazione (HPF), la lunghezza anteriore / posteriore del primo arco faringeo è compreso tra 1,8-1,9 volte la sua dorsale / ventrale altezza. Dorsale / allungamento ventrale procede costantemente, più veloce di estensione anteriore / posteriore fino a 36,5 hpf. Da qui, dorsale / ven...

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Discussione

Time-lapse microscopia confocale è un potente strumento per l'analisi dello sviluppo. Qui, dimostriamo l'utilità del metodo nello studio della faringe arco morfogenesi in zebrafish che sono mutante per vie di segnalazione importanti utilizzando un transgenici che le etichette cellule della cresta neurale. Oltre al livello del tessuto analisi, analisi lasso di tempo sono applicabili ad analisi su scala cellulare ²⁸ anche. Molti metodi di zebrafish ampiamente utilizzati possono anche essere incorporat...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.