Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Resumo

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Resumo

Imagiologia de lapso de tempo é uma técnica que permite a observação directa do processo de morfogénese, ou a geração de forma. Devido à sua claridade óptica e responsabilidade para com a manipulação genética, o embrião de peixe-zebra tornou-se um organismo modelo popular com a qual para realizar a análise de lapso de tempo de morfogênese em embriões vivos. Imagem confocal de um embrião do peixe-zebra vivos exige que um tecido de interesse é persistentemente marcado com um marcador fluorescente, tal como um transgene ou corante injectado. O processo exige que o embrião é anestesiado e mantido no lugar, de tal maneira que o desenvolvimento prossegue normalmente saudável. Parâmetros para a imagem deve ser ajustado para ter em conta o crescimento tridimensional e para equilibrar as exigências da resolução de células individuais ao obter fotos rápidas de desenvolvimento. Os nossos resultados demonstram a capacidade de executar a longo prazo in vivo de imagens de embriões de peixes-zebra marcados com fluorescência para detectar e comportamentos de tecidos em variadasda crista neural cranial que causam anomalias craniofaciais. Atrasos de desenvolvimento causados ​​pela anestesia e montagem são mínimos, e os embriões são ileso pelo processo. Embriões temporizadoP fotografada pode ser devolvido ao meio líquido e subsequentemente visualizados ou fixado em pontos mais tarde no desenvolvimento. Com um aumento da abundância de linhas de peixes-zebra transgénicos e mapeamento de destino bem caracterizados e as técnicas de transplante, imagiologia qualquer tecido desejado é possível. Como tal, de lapso de tempo em imagem in vivo combina poderosamente com métodos genéticos peixe-zebra, incluindo análises de embriões mutantes e microinjetados.

Introdução

Morfogênese craniofacial é um processo multi-passo complexo que requer interações coordenadas entre vários tipos de células. A maior parte do esqueleto craniofacial é derivada a partir de células da crista neural, muitas das quais devem migrar a partir do tubo neural dorsal em estruturas transientes chamados arcos faringe ^1. Tal como acontece com muitos tecidos, morfogênese do esqueleto craniofacial é mais complicado do que pode ser entendido por imagens estáticas de embriões em pontos específicos de tempo de desenvolvimento. Embora seja para realizar demorado, in vivo, a microscopia de lapso de tempo proporciona uma aparência contínua em células e tecidos de um embrião em desenvolvimento. Cada imagem em uma série de lapso de tempo dá contexto para os outros, e ajuda a um movimento em direção investigador deduzir por que um fenômeno ocorre, em vez de deduzir o que está ocorrendo naquele momento.

Na imagem in vivo é, portanto, uma poderosa ferramenta descritiva de abordagens experimentais paradesconstruir os caminhos que guiam morfogênese. O Danio rerio peixe-zebra é um modelo genético popular de desenvolvimento embrionário dos vertebrados, e é particularmente bem adaptado para imagiologia in vivo de morfogénese. Modern, métodos convenientes para transgenia e genômica modificação estão avançando rapidamente o número de ferramentas disponíveis para pesquisadores peixe-zebra. Estas ferramentas de melhorar os métodos já robustos para manipulação genética e microscopia. Imagem in vivo de praticamente qualquer tecido em quase qualquer contexto genético desejado é mais próximo da realidade do que a fantasia.

Movimentos morfogenéticos dos arcos faríngeos são guiados por sinalização interações entre a crista neural e do epitélio adjacente, tanto ectoderma e endoderma. Existem inúmeras moléculas sinalizadoras expressas pelo epitélio que são necessários para accionar a morfogénese dos elementos esqueléticos craniofaciais. Entre essas moléculas sinalizadoras, Sonic Hedgehog (Shh) é extremamente importante fou desenvolvimento craniofacial ^2-8. Shh é expressa tanto pelo ectoderma oral e faringe endoderme ^2,6,9,10. A expressão de Shh em endoderme regula movimentos morfogenéticas dos arcos ^10, padronização de crista neural dentro dos arcos ^10, e o crescimento do esqueleto craniofacial ^11.

Bmp sinalização também é extremamente importante para o desenvolvimento craniofacial ¹² e pode alterar a morfogênese dos arcos faríngeos. Sinalização Bmp regula dorsal / ventral padronização de crista dentro dos arcos faríngeos ^13,14. Rompimento de smad5 em zebrafish provoca graves defeitos palatais e um fracasso das cartilagens de Meckel para fundir de forma adequada na linha média ^15. Além disso, os mutantes também exibem reduções e fusão dos elementos de cartilagem ventrais, com o ² o, 3 ^o, e, por vezes, os elementos do arco 4 ^º faringe fundidos na linha média ¹⁵. Estas fusões sugerem fortemente que a sinalização BMP dirige a morfogênese destes elementos da faringe.

Sinalização PDGF é necessário para o desenvolvimento craniofacial, mas tem papéis desconhecidos em arco faríngeo morfogênese. Ambos rato e mutantes PDGFRA peixe-zebra tem profunda clefting terço médio da face ^16-18. Pelo menos, no peixe-zebra este clefting média facial é devido a uma falha de migração de células da crista neural apropriado ^16. Células da crista neural continuam a expressar PDGFRA depois de terem entrado os arcos faríngeos. Além disso, os ligandos de PDGF são expressos por epitélios facial e dentro dos arcos da faringe ^16,19,20, assim sinalização PDGF pode também desempenhar um papel importante na morfogénese dos arcos da faringe após a migração. No entanto, as análises da morfogênese dos arcos faríngeos em mutantes PDGFRA não foram realizadas.

Aqui, nós demonstramos em microscopia confocal in vivo de pharyngulum estágio zebrafish transgênicos e descrever a morfogênese dos arcos faríngeos dentro deste período. Demonstramos mais comportamentos de tecido que são afetados por mutações que perturbam a BMP, PDGF, e Shh vias de sinalização.

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Protocolo

1. Pecuária e Mutant alelos

1. Levantar e produzir peixe-zebra como descrito ^21.
2. Alelos mutantes Zebrafish utilizados neste estudo foram PDGFRA ^{b1059 16, B1100} smad5 ^22, e ^b577 smo ^23. Fontes para essas cepas zebrafish incluem Zirc.

2. Preparação de Soluções e Implementos

Nota: Todas as soluções e as ferramentas podem ser feitas com antecedência e armazenado para uso futuro.

1. Adicione mídia embrião (EM) como descrito anteriormente ^21.
2. Adicione 4 g / L de MS-222 (tricaina). Dissolve-se 4 g de fosfato dissódico (Na ₂ HPO ₄₎ em 450 ml de água estéril. Adicionar 2 g MS-222 à solução. Ajustar o pH para dentro de 7,0-7,2. Adicionar água estéril para um volume total de 500 ml.
3. Opcional: Faça 4 g / L de óleo de cravo. Pesar 0,2 g óleo de cravo puro em um tubo de 50 ml. Adicionar EM para um volume total de 50 ml. Armazenar a 4 ° C.
4. Faça 3% methylcellulosi. Traga 50 ml de EM + 0,1 M HEPES para ferver. Retire do fogo. Misture em 1,5 g de metilcelulose até que a solução é homogênea. Armazenar a 4 ° C.
5. Adicione 0,2% de agarose. Adicionar 0,1 g de agarose com 50 ml de EM. Traga EM para ferver no microondas ou numa placa de aquecimento e verifique se a agarose se dissolva. Alíquota em 500 volumes ul em tubos de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C. Nota: Os volumes podem ser ajustados conforme necessário.
6. Faça pokers capilares. Coloque uma gota de super-cola dentro de um tubo capilar 0,9 milímetros ID. Inserir um comprimento de 4-5 cm de 6 £ de teste de linha de pesca monofilamento no interior do tubo capilar de tal modo que, aproximadamente, 3-4 mm de linha estende-se para além da extremidade do tubo.
7. Faça duas lamelas em ponte por espécime. Super-cola 22 x 22-1 tampa de vidro em cada extremidade de uma tampa de vidro de 24 x 60-1 deixando o meio livre. Faça singles (1 pequena tampa de vidro por fim) para os embriões com menos de um dia de idade, duplos (dois copos pequenos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para os embriões de um a quatro days de idade, ou triplos (três pequenos copos de cobertura em cima uns dos outros por fim) para embriões cinco dias ou mais.
8. Encha uma seringa de 10 ml, com alta graxa de vácuo. Nota: Vácuo graxa serve como um vedante para evitar a desidratação de espécimes durante longos períodos de tempo, e tem um baixo potencial de toxicidade em comparação com os selantes mais voláteis.

3. Montagem embriões Zebrafish por microscopia confocal (veja a Figura 1)

1. Prepare médio anestésico. Derreter-se uma alíquota de 0,2% de agarose por microondas em intervalos de 20 seg até completamente líquido. Misturar 8 ul de MS-222 em 192 uL de 0,2% de agarose ou 5 ul de 4 g / L de óleo de cravo em 195 ul de 0,2% de agarose. Manter em um bloco de aquecimento de 42 ° C. Nota: A exposição longa a MS-222 provoca atrasos de desenvolvimento mais fortes do que o óleo de cravo faz no peixe-zebra embrionária ^24.
2. Se necessário: dechorionate manualmente embriões transgénicos não eclodidos para ser analisada imediatamente antes da análise. Utilizando uma pinça, lentamente tear o córion aberto até o embrião é liberado.
3. Anestesiar os embriões de peixe-zebra. Adicionar 1 ml de uma unidade de 4 g / L de MS-222-24 ml de meio de embrião. Alternativamente, adicione 390 mL de 4 g / L de óleo de cravo a 24 ml de água de peixe ^24. Nota: atos óleo de cravo lentamente para realizar esta etapa, pelo menos, 15-20 minutos antes de microscopia de lapso de tempo.
4. Coloque uma gota de graxa de vácuo em torno do espaço centro de uma lamela de ponte para cima virada. Empurrar lentamente a gordura vácuo para fora da seringa, fazendo com que um talão suave, contínua, que é adjacente e no interior das pontes e a extremidade da lamela.
5. Espalhe um círculo de 4% de metilcelulose em meio da lamela em ponte usando um aplicador de madeira.
6. Transferência do embrião a ser trabalhada. Quando o embrião é anestesiado desenhar-lo em uma pipeta de vidro. Manter a pipeta-se verticalmente para permitir que o embrião se afundam para o fundo do líquido na pipeta. Mover a pipeta para dentro da solução de agarose e permitir que o embrião a cairem que a agarose. Não expulsar o líquido.
7. Colocar a amostra. Desenhar uma solução de agarose e o embrião para a pipeta. Expelir o embrião de uma gota da solução de agarose no topo da metilcelulose. Use um atiçador capilar para empurrar o embrião para baixo na metilcelulose e orientar o embrião como desejado para a imagem latente.
8. Selar o espécime.
   1. Coloque uma lamela em ponte na parte superior da montagem de um, virado para baixo. Aplique pressão uniforme para ambos os lados das lamelas imprensado até as pontes fazer contato direto e os selos gota de agarose a ambos lamelas. Verifique se o embrião está orientado corretamente.
   2. Esfregue um aplicador de madeira ao longo do vidro para suavizar rachaduras e falhas no talão de graxa de vácuo. Limpe o excesso de graxa das bordas.

4. Time-lapse confocal de Transgênicos Zebrafish embriões

(Este protocolo foi otimizado para uma Zeiss LSM 710 microscópio confocal nosing software de imagem ZEN, e pode ser modificado para ser utilizado com outros sistemas.)

1. Ative equipamento. Ligue o microscópio confocal a laser e todos os dispositivos externos. Ligue o computador conectado ao microscópio confocal. Abra o software de imagem confocal e selecione "Sistema Start" para ativar os controles de aquisição de imagem.
2. Prepare palco aquecida. Abaixe a plataforma de teste do microscópio confocal e mover as lentes objetivas fora de posição. Substitua o estágio padrão com uma fase aquecida eletrônico. Ligue o controlador para a fase aquecida e ajustar a temperatura para 29,5 ° C.
3. Coloque a amostra no campo de visão. Coloque as amostras montadas no palco. Mova a lente objetiva de 20X para a posição e elevar a plataforma de teste. Ative o emissor de luz visível e olhar através das oculares. Centralize a cabeça do embrião no campo de visão.
4. Definir configurações da experiência.
   1. Ative canais de fluorescência, selecionandoo comprimento de onda fluorescente para ser detectado e escolher tabelas de pesquisa de cores (LUT) para cada canal. Se necessário, use os controles manuais no software para ligar os lasers necessárias (por exemplo, 561 nm para RFP). Para cada canal de fluorescência, a intensidade do laser definido para 10,0 e a voltagem do fotomultiplicador (HV ou ganho) entre 600-700. Defina a média a 4 e a profundidade de bits para 16 bits.
   2. Ative os módulos da série Z-stack e time. Defina o pinhole para uma resolução Z-5 mm ou menor, e definir o Z-intervalo para a distância ideal sugerido.
      Nota: Geralmente, 5 mm Z-resolução permite que cada imagem Z-stack a recolher rapidamente o suficiente para um "instantâneo" do embrião em um ponto de tempo específico e ao mesmo tempo resolver células individuais. Baixando a média também reduz a quantidade de tempo por imagem.
   3. Definir o intervalo de tempo desejado entre imagens (geralmente 10-20 minutos) e o comprimento total do experimento.
5. Definir posicionalinformações.
   1. Ligue a câmera para o modo de viver. Ajuste o foco e aumentar a intensidade do laser se necessário, para ver a fluorescência. Defina o zoom digital de 0,6 para uma visão mais ampla, se desejar.
   2. Posicione o palco de tal forma que todas as estruturas de interesse são visíveis e há espaço no campo de visão para dorsal conseqüência e anteriormente. Concentre-se através do embrião para os limites superiores e inferiores de fluorescência. Defina as primeiras e últimas posições fatia Z-stack, no mínimo, 100 mm ou mais para além destes limites.
6. Otimizar intensidade de fluorescência.
   1. Defina a LUT exibição para variar indicador. Estruturas fluorescentes agora deve aparecer branco, e no resto do campo de visão deve ser azul (sem detecção) ou preto.
   2. Aumentar HV / ganho para um nível logo abaixo de onde saturada (vermelho) pixels aparecer. Se necessário, ajuste compensar assim a maior parte do fundo não é detectado (azul). Nota: diâmetro pinhole menor e aumento da intensidade do laser, tanto melhorar a imagem defrial, mas a intensidade do laser deve ser mantida baixa para preservar os tecidos vivos. Aumento HV / ganho e diâmetro do furo de pino (<5 mm) são geralmente preferidas para o aumento da intensidade do laser.
   3. Mantenha o diâmetro pinhole grande o suficiente para coletar imagens em tempo hábil, com média de sets a 4. O intervalo de-Z deve sempre ser definida para a distância ideal sugerido para o diâmetro pinhole. Realizar exames de curta duração (média = 1) com configurações diferentes, e usar a intensidade mínima de laser que atinge resolução desejada.
7. Executar o experimento para o período de tempo desejado. Depois, retire do embrião a partir da fase aquecida e lentamente separar as lamelas. Mergulhe a lamela e embrião em EM em um 30 milímetros placa de Petri. Usando uma pipeta de vidro lavar cuidadosamente o embrião fora da lamela e remover as lamelas da placa de Petri. Coloque o embrião para uma incubadora de 28,5 ° C para continuar a desenvolver-se.
8. Comparar crescimento. No fim do experimento, tomar Zs indivíduotack imagens de embriões irmão montado na agarose que foram similarmente encenadas para a amostra no início da experiência, mas foram levantadas em EM numa incubadora 28,5 ° C.
9. Meça arcos faríngeos, conforme necessário. As medições podem ser realizadas em alguns conjuntos de software confocal. Medidas encontrados aqui foram realizadas utilizando Fiji25 importando e Z-projetando arquivos. LSM de quadros individuais.

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Resultados

Em embriões do tipo selvagem, seguindo população crista neural, os arcos da faringe alongar ao longo dos anterior / posterior e dorsal / ventral eixos enquanto se move em uma direção rostral (Filme 1). Aos 30 horas após a fertilização (hpf), a duração anterior / posterior do primeiro arco faríngeo é entre 1,8-1,9 vezes o seu dorsal / altura ventral. Dorsal / alongamento ventral procede de forma constante, mais rápido do que a extensão anterior / posterior até 36,5 hpf. A partir daqui, dor...

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Discussão

Microscopia confocal Time-lapse é uma ferramenta poderosa para a análise do desenvolvimento. Aqui, nós demonstramos a utilidade do método no estudo da faringe arco morfogênese no peixe-zebra, que são mutantes por vias de sinalização importantes usando um transgênico que rotula células da crista neural. Além do nível de tecido análises, análises de lapso de tempo também são aplicáveis ​​para análises de uma escala celular ^28. Muitos métodos de peixe-zebra amplamente utilizados também po...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 lb Test monofilament line	Cortland Line Company	SLB16
Agarose I	Amresco	0710
Argon laser	LASOS Lasertechnik GmbH	LGN 3001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C8106
Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID	FHC	30-31-0
Clove oil	Hilltech Canada, Inc.	HB-102
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
Isotemp dry-bath incubator	Fisher Scientific	2050FS
Laser scanning microscope	Carl Zeiss AG	LSM 710
Magnesium sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Microscope cover glass, 22 x 22-1	Fisher Scientific	12-542-B
Microscope cover glass, 24 x 60-1	Fisher Scientific	12-545-M
Potassium chloride	Fisher Scientific	M-11321
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786
Sodium chloride	Fisher Scientific	M-11624
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S7907
TempController 2000-2	PeCon GmbH
Tricaine-S	Western Chemical, Inc.