המיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) מושרה ניסויי אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) בעכברים C57BL / 6

Summary

Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסויי (EAE) הוא מודל חיה הוקם בטרשת נפוצה. C57BL / 6 עכברים שחוסנו עם גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין פפטיד (MOG) 35-55 (ש"א _35-55), וכתוצאה משיתוק רפה עולה שנגרם על ידי תאי מערכת החיסון אוטוריאקטיבים במערכת העצבים המרכזית. פרוטוקולים לזירוז מחלה וניטור יידונו.

Abstract

טרשת נפוצה היא הפרעת demyelinating neuroinflammatory כרונית של מערכת העצבים המרכזית עם מרכיב ניווניות חזק. בעוד אטיולוגיה של המחלה המדויקת עדיין אינה ברורה, לימפוציטים מסוג T אוטוריאקטיבים הם חשבו לשחק תפקיד מרכזי בפתופיזיולוגיה שלה. הטיפול בטרשת נפוצה הוא יעיל רק באופן חלקי עד כה, ומאמצי מחקר להמשיך ולהרחיב את הידע שלנו על הפתופיזיולוגיה של המחלה ולפתח אסטרטגיות טיפול חדשניות. Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסויי (EAE) הוא מודל החיה הנפוץ ביותר לטרשת נפוצה שיתוף מאפיינים קליניים וpathophysiological רבים. יש מגוון רחב של דגמי EAE המשקפים היבטים קליניים, חיסוניים והיסטולוגית שונים של MS האנושי. EAE פעיל המושרה בעכברים הוא המודל מושרה הקל ביותר עם תוצאות חזקות ושכפול. זה מתאים במיוחד לחקר ההשפעות של תרופות או של גנים מסוימים באמצעות עכברים הטרנסגניים לערער על ידי neuroi אוטואימוניותnflammation. לכן, עכברים שחוסנו עם homogenates או פפטידים של חלבוני המיאלין במערכת העצבים המרכזית. בשל פוטנציאל immunogenic הנמוך של פפטידים אלה, אדג'ובנטים חזקים נמצאים בשימוש. רגישות EAE ופנוטיפ תלוי באנטיגן נבחר והמתח מכרסם. C57BL / 6 עכברים הם הזן הנפוץ המשמש לבניית עכבר מהונדס ולהגיב בין ההיתר לגליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (ש"א). MOG epitope immunogenic _35-55 מושעה בadjuvant של פרוינד המלא (CFA), לפני רעל חיסון שעלת ומיושם ביום של חיסון ויומיים מאוחר יותר. עכברים לפתח EAE monophasic "קלאסי" עצמי מוגבל עם שיתוק רפה עולה בתוך 9-14 ימים לאחר חיסון. עכברים מוערכים מדי יום באמצעות מערכת ניקוד קלינית ל25-50 ימים. שיקולים מיוחדים לטיפול בבעלי החיים עם EAE, כמו גם יישומים ומגבלות פוטנציאל של מודל זה הם דנו.

Introduction

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה דלקתית demyelinating כרונית של מערכת העצבים המרכזית שבה הרס oligodendrocytes ותוצאות הנוירונים בתסמינים קליניים הטרוגנית וצבירה. הטרשת הנפוצה נחשבת למחלה אוטואימונית אב טיפוס של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומודלים של בעלי החיים פותחו על מנת לשפוך אור על הפתוגנזה המורכבת שלה. יתר על כן, טיפולים שוטפים הם יעילים רק באופן חלקי ולהתמקד בעיקר בשלב דלקתי של המחלה ואילו רכיב ניווניות הוא כנראה האתגר הגדול עבור טיפולי עתידי גישות ^1,2.

בעוד אטיולוגיה של המחלה המדויקת עדיין לא ברורה, תגובה אוטואימונית נגד אפיטופים על מעטפת המיאלין של האקסונים במערכת העצבים המרכזית הנחה היא לעורר התפרצות של המחלה. חוסר ויסות של מערכת החיסון, פגיעות גנטית וגורמים סביבתיים (למשל זיהומים, ויטמין D) הם האמינוהיבטים מרכזיים השפעה של מנגנוני pathophysiological של טרשת נפוצה.

שלושה סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים כרגע שהוקמו לחקירה של דפוסים פתולוגיים של MS: מודלים ויראלי כמו הווירוס של Theiler העכברי Encephalomyelitis (TMEV), מודלים הנגרמים על ידי חומרים רעילים כמו cuprizone, ולבסוף גרסאות שונות של Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסיוני (EAE) ^{3, 4.} למרות שכולם מחקים את התכונות של MS, הם שונים מאוד בתכונות פתולוגיים בסיסית כמו המעורבות של המערכת החיסונית אדפטיבית. EAE הוא מודל החיה הנפוץ ביותר כפי שהוא שימושי במיוחד כדי לחקור את מסלולי neuroinflammatory ולעתים קרובות משמש כמודל "הוכחה של עיקרון" ליעילות של אסטרטגיות טיפול חדשניות ^5,6. יכול להיגרם EAE בבעלי חיים רבים ושונים (לדוגמא: עכברים, חולדות, miniswine, שרקנים, תרנגולות, או קופים). עם זאת, עכברים הפכו את המינים הנפוצים ביותר בשימוש נרחב אשר לפחות בחלקו בשללהרחבת רפרטואר של מהונדס מתוחכם או עכברים בנוקאאוט ^7.

הפתופיזיולוגיה של EAE מבוססת על התגובה של מערכת החיסון נגד אנטיגנים ספציפיים במוח. תגובה זו גורמת לדלקת והרס של המבנים בספרי אנטיגן, וכתוצאה מכך תכונות נוירולוגיות ופתולוגיים דומות שאלו שנצפו בחולי טרשת נפוצה. ניתן להבחין בשלוש גישות שונות: EAE פעיל המושרה (aEAE; חיסון פעיל), באופן פסיבי הועבר EAE (pEAE; העברת תאי encephalitogenic מבעלי חיים שחוסנו), ומודלי עכבר EAE ספונטניים יותר לאחרונה (sEAE) המאפשר לימוד אוטואימוניות מנגנונים ללא מניפולציה חיצונית. המודל מושרה הקל ביותר הוא aEAE בעכברי מניב בתוצאות מהירות וחזקה. מודל זה נחשב כמו "תקן הזהב" של מודלים של בעלי החיים neuroimmunological על ידי חוקרים רבים בתחום ^8.

לזירוז aEAE, בעלי החיים הוא מחוסן בהזרקה תת עורית של תחליב המכיל את האנטיגן הנבחר ולהשלים adjuvans של פרוינד (CFA), מלווה בזריקת intraperitoneal של רעלן שעלת ביום של חיסון ויומיים מאוחר יותר. כתוצאה מכך, לימפוציטים מסוג T המיאלין הספציפי מופעלים בפריפריה ולהעביר לתוך מערכת העצבים המרכזית על פני הדם למוח המכשול. עם כניסתו למערכת העצבים המרכזית, תאי T מחדש על ידי תאי מציגי אנטיגן חדירה מקומיים וכתוצאה ממפלים דלקתיים, המעורבות הבאה של תאים אחרים כמו מונוציטים או מקרופאגים וסופו של דבר בפגיעה במיאלין ומוות של תאים באקסון ^9. בהתאם לפרוטוקול החיסונים ושילוב של זן עכבר (למשל C57BL / 6, SJL / J, Biozzi) ואנטיגן (למשל גליקופרוטאין המיאלין oligodendrocyte (ש"א), חלבון המיאלין בסיסי (MBP), חלבון המיאלין proteolipid (PLP)), המחלה כמובן יכול לקחת כמובן חריפה, כרונית מתקדמת או התקפית מחלה התקפית.

= "Jove_content"> C57BL / 6 עכברים הפכו הזן הנפוץ ביותר המשמש לבניית עכברים הטרנסגניים ושפע הולך וגדל של נוקאאוט או עכברים הטרנסגניים זמין. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לחיסון של עכברי C57BL / 6 עם MOG _35-55 פפטיד ¹⁰ שתוצאת EAE monophasic עם תסמינים הראשונים אחרי 9-14 ימים, מקסימום מחלה כ 3-5 ימים לאחר תחילת מחלה והחלמה סימפטום איטית וחלקית על 10-20 הימים הקרובים. כפוטנציאל immunogenic של פפטיד ש"א _35-55 לבדו אינו מספיק כדי לגרום למחלה, אדג'ובנטים כגון CFA נחוצים. הנחה הוא, כי מרכיבי CFA להפעיל phagocytes מונונוקלארים גרימת phagocytosis של מולקולות אלה ואת הפרשת ציטוקינים. התוצאה היא הארכה של הנוכחות של אנטיגנים והובלה יעילה יותר של אלה למערכת הלימפה. האינדוקציה EAE היא הקלה על ידי יישום של רעלן שעלת (PT) שבין יתר הוצע לווסתמחסום דם המוח והתגובה החיסונית עצמה ^11. לאחר אינדוקציה מחלה, טיפול מיוחד יש לנקוט להערכה יומית של עכברים לתסמיני מחלה.

Protocol

1. הערות כלליות לניסויים בעכבר

1. כל הניסויים באמצעות עכברים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש המתאים.
2. שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ומאפשר להם לקבל גישה כלרצונך מודעת מזון ומים. הערה: חשוב להשתמש גיל ועכברים בהתאמה מין בקבוצות ניסוי בגלל רגישות למחלה יכולה להשתנות עם גיל ומין.
3. בהתאם לתנאי הניסוי שנבחרו, קבוצת ביקורת, חוסן דמה יכולה להיחשב בו פפטיד ש"א _35-55 הוא הוחלף על ידי אחד PBS ללא אנטיגן או הפפטיד nonencephalitogenic.
4. אנא שקלו היבטים מתודולוגיים לקראת ניסויי התחלה (ראה גם בהמשך). אנו ממליצים לערב את המשקיפים סנוורו אחד או שניים לשערו של EAE.

2. הכנת MOG _35-55 אמולסיה

1. 200 μl של יחס של 1:1 של MOפתרון G _35-55 פפטיד וCFA צריך להיות מוזרק לכל עכבר. יש כמה אובדן של התחליב צמיג בעת הכנה והזרקה. לכן, להכין 1.5-2x מהכמות הנדרשת. לחשב את הנפח הכולל של התחליב ומתחלקים ב -2 לכמויות הדרושות של שתי פתרון פפטיד ש"א _35-55 וCFA.
2. לדלל MOG lyophilized _35-55 בDDH ₂ O לריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר. אנחנו בדרך כלל להשתמש 200 MOG מיקרוגרם _35-55 פפטיד לכל עכבר. סכום זה כלול בשל פתרון המניות 100 μl. פתרון פפטיד צריך להיות מאוחסן ב -20 ° C.
3. מניחים את התוכן של 1 בקבוקון של H37RA המיובש שחפת Mycobacterium (100 מ"ג) למרגמה.
   1. קרקע עם מכתש ועלי כדי להשיג אבקה דקה.
   2. הוסף 10 מיליליטר של אדג'ובנטים של פרוינד שלם כדי להשיג פתרון מניות 10 מ"ג / מיליליטר CFA אשר ניתן לאחסן ב 4 ° C.
   3. לפני החיסון, לדלל שנינות פתרון מניות CFAשעות IFA לריכוז סופי של 2 מ"ג / מיליליטר. מערבבים היטב לפני כל שימוש לresuspend חלקיקי חומר ולשקול כמה אובדן נפח של התמיסה צמיגה במהלך ההכנות ניסיוני.
   4. מערבבים 01:01 עם פתרון פפטיד ש"א _35-55 עד הריכוז הסופי של 1 מ"ג / מיליליטר הוא הגיע.
      זהירות: שחפת Mycobacterium-נהרג חום ממריצה את התגובה החיסונית המולדת. הימנע משאיפה, בליעה ומגע עם עור ועיניים.
4. Precool פתרונות על קרח.
   1. צייר את 1 מיליליטר של 2 מ"ג / מיליליטר CFA ו1 מיליליטר של 2 מ"ג / מיליליטר ש"א _35-55 פתרון לשתי 2 מיליליטר מזרקים. לחשב את מספר המזרקים הנדרשים על פי מספר בעלי החיים שחוסנו.
      זהירות: להקפיד להימנע מתפרים במהלך תקופת ההכנה של אדג'ובנט מכיוון שהוא עלול לגרום לגרנולומות או לגרום לתגובות אוטואימוניות.
   2. השתמש בצינורית G 27 לפתרון ש"א _35-55 ו20 צינורית G לCFA. למנוע בועות אוויר ולחבר את שני המזרקים עם בhree-כיוון שסתום.
   3. שלח תחליב ממזרק אחד למשנהו ומערבבים היטב לדקות לפחות 10 כתחליב טוב הוא שלב קריטי. קרוב לסגור את שלוש דרך השסתום כדי לתמוך בתחליב. הפתרון צריך להיות לבן, נוקשה וצמיג ללא הפרדה של שלבים.
   4. תחליב יכול להיות מאוחסן במשך כמה ימים לפני החיסון. חכה לפחות 30 דקות לאחר הכנת התחליבים כדי לראות אם הם יציבים. לפני החיסון, לצייר את הפתרון לאחת משני מזרקים ולחבר את צינורית G 27.

3. הכנת רעלן שעלת

1. ניתן למצוא כמויות שונות של רעלן שעלת בספרות שגם תלויה בתוואי של ממשל (למשל דרך הווריד או intraperitoneally). המעבדה שלנו משתמשת 400 ננוגרם של רעלן שעלת ב200 μl של PBS intraperitoneally ביום של חיסון ויומיים מאוחר יותר. זהירות: רעלן שעלת יש הרבה השפעות ביולוגיות. הימנע משאיפה, בליעה, ומגע עם עור ועיניים.
2. מחדש 50 מיקרוגרם של הרעלן שעלת ב500 μl DDH ₂ O לפתרון מניות 100 מיקרוגרם / מיליליטר. חנות ב 4 ° C.
3. לדלל 01:50 עם PBS. 200 μl עכשיו מכיל 400 ng של PBS. הכן את הסכום הדרוש של מזרקים ולשקול נפח עודף נוסף של ~ 100 μl עבור כל רכזת מחט.

4. בעלי החיים חיסונים

1. נא עיין בועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית לקריטריונים ספציפיים להמתת חסד לטווח קצר הנדרש. המעבדה שלנו משתמשת בהרדמה קצרה עם isoflurane ואילו פרוטוקולים אחרים כגון הזרקת קטמין / xylazine או halothan יכולים להיות גם אפשריים. חכה להרדמה ולהשתמש קמצוץ הבוהן ברגל קדמי כדי להעריך את רמת ההרדמה.
2. ודא כי חיסון מתבצע על ידי אדם מנוסה כדי למזער את הלחץ לבעלי חיים ועל מנת להבטיח חיסון אופטימלי.
3. הזרק של אנטי 100 μlמתחת לעור תחליב gen / CFA לשני אתרים שונים בכל אגף האחורי. ודא שצורות המוניות בולבוסי מתחת לעור שאמורה להימשך לאורך כל הניסוי.
4. הזרק 200 μl של רעלן שעלת intraperitonelly.
5. להבטיח כי עכברים בודדים יכולים להיות מזוהים בקלות להערכה יומית, למשל על ידי סימוני צבע על בסיס הזנב.
6. שלו מנה שנייה של רעלן שעלת ביום שני לאחר חיסון.

5. ניטור EAE

1. משקל וציון קליני צריכים להיות מוערך מדי יום. תחילתה של EAE בדרך כלל בקורלציה עם ירידה במשקל, אשר יכול לשמש כמדד לפעילות מחלה. נא עיין בטיפול בבעלי החיים המוסדי ועדת שימוש כדי להגדיר מראש קריטריונים כאשר עכברים בודדים צריכים להילקח מתוך הניסויים. זה צריך להילקח בחשבון כאשר ירידה במשקל עולה על 20% ממשקל הגוף הראשוני או כאשר סימנים קליניים חמורים (EAE ציון 7 או גרוע מכך) להתרחש. עיין מחדשהנחיות פרספקטיבה של ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדי ושימוש בהתאמה לציונים מרביים מוותרים.
2. כאשר יש לי עכברים סימפטומים קליניים של EAE, חשוב להבטיח שעדיין ניתן להגיע לבקבוק המים ומזון שמונח על רצפת הכלוב.
3. ניתן להשתמש בם סימפטומים ניקוד שונים. במעבדה שלנו בקנה מידה 0-10 היא הוקמה.

ציון	סימן קליני	הערה
0	ללא סימנים קליניים	בהליכה רגילה, מהלכי זנב והוא יכול להיות מורם, זנב עוטף סביב חפץ עגול אם עכבר הוא נערך בבסיס הזנב
1	זנב חלקית צליעה	בהליכה רגילה, קצה הזנב משתפל
2	זנב משותק	בהליכה רגילה, זנב משתפל
3	paresis גפיים אחורית תנועה, ללא תיאום	הליכה לא מתואמת, זנב צולע, גפיים אחוריות מגיבים לצביטה
4	גפיים אחוריות אחד משותק	הליכה ללא תיאום עם גרירת גפיים אחורית אחד, זנב צולע, גפיים אחוריות אחד לא מגיבים לצבוט
5	שני גפיים האחוריות משותקים	הליכה מתואמת בשני הגפיים האחוריות גרירה, זנב צולע, שני גפיים האחוריות אינם מגיבים לקמצוץ
6	גפיים אחוריות משותקים, חולשה בforelimbs	הליכה ללא תיאום עם forelimbs להיאבק כדי למשוך את הגוף, רפלקס forelimbs לאחר צביטות, זנב צולע
7	גפיים אחוריות משותקים, forelimb אחת משותק	עכבר לא יכול לזוז, forelimb אחד מגיב לקמצוץ הבוהן, זנב צולע
8	גפיים אחוריות משותקים, שני forelimbs משותק	עכבר לא יכול לזוז, גם forelimbs אינו מגיב לקמצוץ הבוהן, זנב צולע
9	גוסס	אין תנועת נשימה משתנה,
10	מוות

שיטת ניקוד קלינית טבלת מס '1..

תוצאות

לאחר חיסון, עכברים צריכים להיות מוערכים מדי יום לשינויים במשקל ותסמינים קליניים. התפרצות מחלה בקורלציה בדרך כלל עם הפחתת משקל אשר עשוי להתחיל 1-2 ימים לפני שתסמיני EAE גלויים. סימנים קליניים של EAE בדרך כלל מתחילים בין היום 9 ו14 הודעה חיסון. כנגעים בעיקר הם מקומיים לחוט השדרה בMOG-EAE בעכברי C57BL / 6, הם בדרך כלל מפתחים תסמינים בעיקר מוטוריים בזנב לתבנית מקורי. תמונת מופת של עכבר מחוסן עם סימפטומים EAE (ציון 6) מתואר באיור 1 א. כמה תסמיני EAE לא טיפוסיים עלולים להתרחש גם כמו מתגלגל באופן צירי סיבובית, מראה כפוף או רגישות יתר שאינם באות לידי ביטוי בתוך EAE הקלאסי הציון מתואר בטבלה 1. כסימפטומים מוטוריים הם המאפיין העיקרי במודל זה, ציון זה ייתן לנו אינדיקציה טובה לחומרת מחלה. מערכות שונות ניטור (למשל ציון 0 -5 או 0-6) ועוד עשרות רבות מרוכבים מורכבים הערכת גירעונות שונים גם פורסמו. אנא שים לב כי עכברים עם תסמינים חמורים צריכים להילקח מתוך הניסוי על פי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדי ושימוש המתאימה. עכברים להראות התאוששות בדרך כלל חלקית של סימפטומים על 10-20 הימים הקרובים. מהלך מחלה נציג מתואר באיור 1. יש נקודות זמן שונות במהלך EAE יש בם עניין להערכת פרמטרים תוצאה. כמה טיפוסי מבחני אשר לעתים קרובות ניתן למצוא מתוארים לזמן קצר מאוד. במרבית המחלות, ניתן להעריך עכברים לייצור ציטוקינים או התפשטות לאחר restimulation של תאים חיסוניים מבודדים עם פפטיד ש"א _35-55 במבחנה (assay זוכר ש"א). יכולים גם להיות מבודדים תאים חיסוניים מהמוח וחוט השדרה מעכברים עם תסמיני EAE ומעובד יותר, למשל על ידי cytometry זרימה. ניתוח היסטולוגית של קטעי חוט השדרה יכול להתבצע במ 'מחלהaximum לעומס נגע ופגיעה במיאלין, ואילו במועד מאוחר יותר מצביע סמנים לניוון מוחיה ומוות של תאים עצביים עשוי להיות עניין.

איור 1. נציג תוצאות EAE. תמונת נציג א של עכבר C57BL / 6 חוסן עם תסמיני EAE (EAE ציון 6). מהלך מחלה ב נציג לאחר חיסון מעל 30 ימים. הנתונים מוצגים כממוצע ושגיאת תקן של הממוצע (n = 5). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

מספר רב של דגמי EAE שונים עם פרוטוקולי חיסון פעילים כבר תאר בעשורים האחרונים. בעוד מודלים של עכברים היו בשימוש נרחב עד לאחרונה, עכברים נמצאים כעת אורגניזם המודל הפופולרי ביותר למחקר EAE. התפתחות זו היא, בין השאר בשל הרפרטואר הרחב והולך וגובר של עכברים הטרנסגניים זמינים. חיסון של עכברי C57BL / 6 עם MOG _35-55 פפטיד הוא אחד דגמי EAE המופצים נרחב ביותר ויכול להיחשב כמודל חיה אמיד שימוש אמין, שכפול ו. בהרבה מעבדות neuroimmunological, MOG _35-55 EAE המושרה הוקם כמודל של בחירה ואילו דגמי EAE אחרים משמשים לשאלות ניסיוניות יותר ספציפיות.

נקודה קריטית היא לשקול את התכנון של ההגדרות הניסיוניות כדי להבטיח שניסויי EAE מבוצעים נכונים מתודולוגית. לתוקף פנימי, ניקוד עיוור של תסמיני מחלה מומלץ מאוד. Experקבוצות imental צריכה להיות גיל, משקל, והתאמת מין ועכברים צריכים להיות מוקצה באופן אקראי לקבוצות טיפול. תמיד צריכים להתבצע ניסויים בקנה אחד עם תקנות צער בעלי חיים. מחקרי EAE הם לעתים קרובות חלשים ולא לוקחים בחשבון את הסוג II טעויות סטטיסטיות. לכן, לפני ניסויים, יש לבצע חישובי גודל מדגם. גדלי קבוצה הדרושים תלויים בגודל ההשפעה הצפוי. ייעוץ של מומחה לניתוח סטטיסטי עשוי להיחשב לפני תחילת ניסויי EAE.

מגבלות מסוימות של הפרוטוקול צריכים להיות כל הזמן בראש. והכי חשוב, פרשנות של נתונים aEAE נפגעת על ידי המצב של חיסון עם השימוש ברעלן אדג'ובנט ושעלת שיש להם גם השפעה נוספת על התגובה החיסונית. צריך גם לקחת בחשבון כי המודל ש"א _35-55 EAE מראה בעיקר תאי CD4 ⁺ T מונעים תגובה חיסונית. תאי CD8 ⁺ T ותאי B לשחקתפקיד פחות בולט ופרוטוקולים חלופיים יש לשקול בעת טיפול בסוגים אלה של תאים. מהלך המחלה הצפויה הוא חריף, monophasic ועצמית מוגבלים. לחלופין, מהלך מחלה בשלב התקפי יכול גם להיות מושגת במודלים של EAE חלופיים. מגבלה חשובה נוספת של הפרוטוקול היא הטיה מסוימת לכיוון הרכיב החיסוני של הפתופיזיולוגיה הטרשת הנפוצה. בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי MS יש מרכיב ניווניות חזק. מותו של oligodendrocytes ותוצאות הנוירונים בהצטברות הדרגתית של גירעונות נוירולוגיות. זה חייב להילקח בחשבון כי מודל EAE לא יכול להיות מתאים באופן מלא כדי לענות על שאלות הנוגעות לניסוי מנגנוני ניווניות של דלקת אוטואימונית. מודלים של בעלי חיים אלטרנטיביים עם דגש על הפתולוגיה של מערכת העצבים המרכזית עלולים להיחשב - למשל מודל cuprizone שפוגע פגיעה במיאלין רעילה ללא מעורבות של מערכת החיסון ההיקפית.

הפרוטוקול המתואר להיחשב כמודל ניסיוני neuroimmunological בסיסי ועשויים להיות שונה עבור יישומים אחרים. הליך הניסוי שתואר לעיל ניתן ליישם בקלות לפרוטוקולי EAE אחרים על ידי זני עכברים שונים או הסוג והכמות של חלבון (לדוגמא להשתמש PLP _139-151 פפטיד ועכברי SJL למהלך מחלה EAE בשלב התקפי אשר מתאים במיוחד להערכה טיפולית השפעות על התקפים). גם הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לניסויים מאמצת העברה (EAE הפסיבי). במודל זה, C57BL / 6 עכברים שחוסנו עם פפטיד ש"א _35-55 CFA וכפי שתואר לעיל. לעומת זאת, רעלן שעלת אינו נדרש. אחרי 7-15 ימים, טחול או בלוטות לימפה מבודדות ותאי חיסון restimulated במבחנה עם MOG _35-55 פפטיד וציטוקינים שונים לפני העברה לקבוצה חדשה של עכברי C57BL/6se. עכברי נמען אלה לפתח EAE כמה ימים מוקדם יותר מאשר על clasחיסון sical. יכולים להיות מגוונים במבחנה תנאים לשאלות החיסוניות ספציפיות (למשל לקיטוב T _H 1 או T _H 17 תאים).

לפעמים, שכיחות נמוכה של מחלה או סימפטומים חלשים עשויה להיות אתגר ניסיוני. כמה המלצות לפתרון בעיות הן:

- חומרת מחלה יכולה להיות מגוונת עם כמויות שונות של פפטיד / עכבר.

- ריכוז האופטימלי CFA עשוי להשתנות 1-5 מ"ג / מיליליטר. לשקול טיטרציה של CFA כאשר הקמת הניסויים. אנא עיין בהנחיות המתאימות של ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדי ושימוש בהתאמה לריכוזי CFA אפשרו כתקנות רבות וחליל ריכוזי CFA עולה על 2 מ"ג / מיליליטר.

- שיטות שונות מתוארות להכנת התחליב. שיטות אלטרנטיביים כגון vortexing עבור שעה 1 או sonication עשויות להיחשב אם תחליב עני נחשב כpossibמקור שגיאת le.

- גיל, מין, עונת השנה והתנאים סביבתיים במתקן בעלי החיים הם גורמים חשובים המשפיעים על רגישות EAE. יש להבטיח כי תנאים דומים בין ניסויים בלתי תלויים.

כפי שתואר לעיל, בפרוטוקול שהוזכר יכול לשמש כנקודת התחלה עבור ניסויי EAE מאמצים. מודל זה מתאים במיוחד להפרדת השפעות היקפי ומערכת העצבים המרכזית של הפנוטיפ גנטי (למשל על ידי העברת תאי נוקאאוט encephalitogenic לעכברים נמען wildtype) ולשאלות החיסוניות ספציפיות כמו הפנוטיפ של התאים שהועברו יכול להיות מאופיין באופן יסודי. ההתפתחות האחרונה במחקר EAE בשנים האחרונות הן עכברים הטרנסגניים קולטן תא T. עכברים אלו מפתחים תסמיני EAE באופן ספונטני ללא השפעה חיצונית לעקוף את הבעיה של חיסון אדג'ובנט. עם זאת, מודל זה דורש כמויות גדולות של בעלי חיים לbreeding כדי להבטיח גדלי קבוצה מספיק. הערכה של עכברי נוקאאוט דורשת הכלאות לפני ניסויי EAE בניגוד לaEAE. כמו כל עכבר מתפתח תסמיני מחלה ביום אחר, ההערכה של חומרי רומן יכולה להיות די מסובכת. לכן, הערך של aEAE הקלאסי לneuroimmunological נותר ללא עוררין.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Female C57BL/6 mice, age 10-12 weeks, ~20 g weight	e.g. Jackson Laboratory, Charles River
MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)	e.g. Pepceuticals Ltd		Store at -20 °C
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)	e.g. Sigma-Aldrich Co.	F5506	Store at 4 °C
Syringes, 1 ml with 26 G 3/8 in needle	e.g. Becton Dickinson & Co.	309625
Syringes, 2 ml	e.g. B. Braun	7389
Needles, 25 G 5/8 in and 30 G 1/2 in	e.g. Becton Dickinson & Co.,	305122, 305106
Three way valve	e.g. B. Braun	16494 C
Pertussis toxin, lyophilized in buffer	Enzo Life Sciences Inc.	BML-G100	Store at 4 °C
M. tuberculosis H37 RA	BD Difco	231141	Store at 4 °C