תאי חוט Tetrode הקלטה במוח של חופשיות הליכה חרקים

Summary

אנחנו פיתחנו בעבר טכניקה להשתלת חוטי tetrode לתוך המתחם המרכזי של מוח של מקק המאפשר לנו לעקוב אחר פעילות ביחידות בודדות של מקקים קשורים. כאן אנו מציגים גרסה שונה של טכניקה המאפשרת לנו גם כדי להקליט את פעילות המוח במעבר חרקים באופן חופשי.

Abstract

עניין גובר בתפקיד של פעילות המוח בשליטה מוטורית חרקים מחייב אותנו להיות מסוגל לפקח על פעילות עצבית בזמן חרקים לבצע התנהגות טבעית. אנחנו פיתחנו בעבר טכניקה להשתלת חוטי tetrode לתוך המתחם של מוח של המקק שאיפשר לנו להקליט פעילות מתא העצב מרובה בו זמנית המרכזי תוך מקק קשור פנה או מהירות הליכה שונה. בעוד התקדמות גדולה, הכנות קשורות לספק גישה להתנהגויות מוגבלות ולעתים קרובות חוסר תהליכי משוב המתרחשים במעבר בעלי חיים באופן חופשי. כעת אנו מציגים גרסה שונה של טכניקה המאפשרת לנו להקליט מהקומפלקס של לנוע בחופשיות מקקים כשהם הולכים בזירה ולהתמודד עם מחסומים על ידי סיבוב, טיפוס או מנהור המרכזי. יחד עם וידאו במהירות גבוהה וחיתוך אשכול, עכשיו אנחנו יכולים להתייחס פעילות מוח לפרמטרים שונים של התנועה של חרקים מתנהגים בחופשיות.

Introduction

מאמר זה מתאר מערכת מוצלחת להקלטה מתא העצב במתחם המרכזי (CC) של המקק, discoidalis Blaberus, כחרק הולך בזירה ועוסק באובייקטים שגורמים לו להסתובב, מנהרה מתחת, או לטפס מעל מכשולים. יכול גם להיות מחוברים לחוטי ממריץ לעורר פעילות בneuropil שמסביב עם שינויים התנהגותיים וכתוצאה מכך.

בעשור האחרון תשומת לב רבה מופנה לתפקידים שמילאו אזורים שונים במוח בשליטה על התנהגות חרקים. חלק גדול ממיקוד זה כבר מופנה לneuropils מוח קו האמצע, כי הם יכונו מורכבים המרכזיים (CC). הושגתי התקדמות כתוצאה מזנים רחבים של טכניקות מיקוד שאלות על תפקידה של CC בהתנהגות. טכניקות אלה נעות בין מניפולציות neurogenetic, בעיקר בדרוזופילה, בשילוב עם behaviניתוח אוראלי ^1-3, לטכניקות אלקטרו העוקב אחר פעילות עצבית בתוך CC והניסיון להתייחס לפעילות שפרמטרים רלוונטיים התנהגותית.

טכניקות אלקטרו כוללות הקלטה תאית מתא העצב בודד מזוהה ^4-9 והקלטה תאית, לעתים קרובות עם בדיקות רבת ערוצי ^10,11. שתי טכניקות אלה הן ללא תשלום. הקלטה תאית עם אלקטרודות חדות או תא כל תיקון מספקת נתונים מפורטים מאוד על נוירונים שזוהו, אך מוגבלת לתא אחד או שניים בכל פעם, דורשת תנועה מוגבלת או לא, ויכולה להישמר לתקופות זמן קצרות יחסית. ניתן להגדיר בקלות את הקלטות תאיים, אינו דורשות איפוק, ויכולות להישמר במשך שעות. עם tetrodes רב ערוצים וחיתוך אשכול, אוכלוסיות גדולות למדי של תאי עצב ניתן לנתח בו זמנית ^9,12. בעוד patc תא כולושעות כבר השתמשו בהצלחה בחרקים קשורים ^13, אנחנו מרגישים שיש גם צורך בטכניקות המאפשרות לנו להקליט פעילות עצבית במוח לפרקי זמן ארוכים במתנהגים חרקים באופן חופשי כפי שהם להתמודד עם חסמים לתנועה קדימה.

את הצורך ברישום כמהלכי חרקים וקופץ למעלה ולמטה דחף אותנו לכיוון שיטות הקלטה תאית. היו לנו הקלטת הצלחה טובה בהכנות מאופקות עם בדיקות סיליקון 16 ערוצים זמינים מסחרי ^11, עם זאת גודלו הקטן של אפילו מקקים גדולים אומר שהבדיקות צריכים להיות מותקנת מחוץ לגוף. זה, בשילוב עם העדינות של שיני הבדיקה, הפך אותם לבלתי ראוי להכנת הליכה חופשית. בשני פרויקטים קודמים, השתמשנו צרורות של חוטים עדינים ויוצרים tetrode להשיג מאפייני הקלטה דומים, אבל בהסדר חזק יותר. חבילות tetrode אלה אפשרו לנו להקליט ממקקים קשוריםd מתייחס פעילות יחידת CC לשינויים במהירות הליכה ¹⁴ והפיכת התנהגות כתוצאה ממגע מחושים עם מוט ^10.

שימושי כמו הכנות קשורות אלה היו וימשיכו להיות, הם עושים להציג כמה מגבלות. ראשית, ההתנהגויות שהחרקים יכולים לבצע מוגבלות למישור אחד. כלומר, אנחנו בקלות יכולים לעורר שינויים במהירות הליכה או מפנה, אבל פעולות טיפוס ונהור לא היו אפשריות, לפחות להסדר לקשור הטיפוסי. שנית, ההכנות קשורות שלנו הן "לולאה פתוחה". כלומר, הם אינם מאפשרים למשוב תנועה קשורים נורמלי למערכת. לכן, כפי שהמקק מופעל לקשור שלנו, העולם החזותי שלה לא שונתה בהתאם. אפשר לבנות מערכות לקשור לולאה סגורות להציג את משוב מסוג זה. עם זאת, הם מוגבלים על ידי המורכבות של תכנות והחומרה של הסביבה החזותית מדומה. Neverthelesים, הרגשנו שאנחנו יכולים לשפר את שיטות ההקלטה קשורות הקיימות שלנו על ידי הקלטה מבעלי החיים כפי שהוא הלך בחופשיות בזירה או מסלול ואובייקטים נתקלו כפי שהוא היה בסביבתו הטבעית.

למרות שמערכות אלחוטיות להקלטת פעילות מוח ¹⁵ תהיה אידיאלית, יש מערכות נוכחיות יש מגבלות במספר ערוצי הקלטה, הזמן של רכישת נתונים, אורך חיי סוללה ומשקל. אנו, אפוא, העדפנו לנסות ולהתאים את מערכת ההקלטה קשורה שלנו לשימוש במעבר הכנות באופן חופשי. כמו מערכות אלחוטיות טובות יותר תהיינה זמינות, בטכניקה זו ניתן להתאים בקלות למכשירים כאלה. המערכת מתוארת במאמר זה היא קל משקל, עובדת טוב מאוד ונראה שיש השפעה מזיקה קטנה בהתנהגות של המקק. עם מצלמה במהירות גבוהה זולה ותוכנת חיתוך אשכול, פעילות בתאי עצב במוח אדם יכולה להיות קשורה לתנועה. כאן אנו מתארים את preparע חוטי tetrode וההשתלה שלהם לתוך מוחו של החרק, כמו גם טכניקות הקלטה עבור פעילות חשמלית ותנועה, ואיך נתונים אלה יכול להיות הביא יחד לניתוח שלאחר מכן.

Protocol

1. הכנת חוטי Tetrode

1. משוך את חוט nichrome דק מאוד (12 מיקרומטר קוטר, ציפוי PAC) של כ 1.1 מ 'אורך. צרף תג קלטת לכל קצה. לתלות את החוט על מוט הברגה אופקי כך ששני הקצוות הם באותו הגובה ליד המעבדתיים.
2. חזור על שלב 1.1 לחוט שני, מה שהופך את שני קצוות יותר עבור סכום כולל של 4, ולמקם אותו בסמוך לחוט הראשון (כ 1 סנטימטר ביניהם).
3. היצמד ארבעה הקצוות יחד עם תג קלטת ולצרף את התג למכשיר מסתובב ממונע מתפתל. מכשיר זה יכול להיות עשוי ממנוע DC זול.
4. בסופו של tetrode בכיוון אחד למשך 2 דקות (60 סל"ד) ולהירגע זה בכיוון ההפוך ל30 שניות.
5. השתמש באקדח חום למזג את החוטים יחד. אל תיגעו בחוטים עם האקדח. להשתמש בשלוש למעלה ולמטה עובר מכיוונים לסירוגין, עם כל מעבר לוקח כ -10 שניות.
6. חותכים את החלק העליון והתחתון של חוטי הפצע. ארבעה החוטים שזוריםד התמזגו יחד בקצה אחד אבל להפריד באחר.
7. הוסף את הצינור התומך. חותכים אורך 30 סנטימטר של צינורות פוליאתילן (קוטר: בתוך 0.28 מ"מ, מ"מ 0.61 בחוץ). השחל את tetrode מאוד לאט ובזהירות לתוך הצינור התומך, כך שזה לא שגעון.
8. ברגע שסופו של הדבר התמזגו מופיע את הצד השני, למשוך אותו דרך כך שיש אורך שווה של חוט בשני קצותיו של צינור המדריך.
9. תפוס את הסוף הנפרד של כל חוט עם מלקחיים. שימוש בבסיס של הלהבה של מבער גז, לשרוף בזהירות את הבידוד מעל מ"מ שעבר 2 או 3 של כל חוט. מחממים את החוט עד שזה זוהר, אבל לא להתכרבל.
10. חבר את tetrode עם מתאם שקע IC בין גברים לנשים שמתאים למכשיר ההקלטה שלך. שים סוף deinsulated של כל חוט לתוך שקע של המתאם עם מלקחיים שונה. לייצב את החוט בשקע עם סיכת נחושת קטנה. השתמש מלחם נקודת קנס ולמלא את השקע עם ההלחמה המותכת. היזהר שלא ליצור קשר עםהחוט השברירי עם מלחם.
11. בדוק את העכבה של כל חוט ועכבת היתר של כל זוג של חוטים.
    1. מניחים את הקצה התמזגו, מעוות לתוך מיכל של מי מלח ולהתחבר מנצח חוטי נחושת מתמיסת מלח למטר אוהם.
    2. חבר את הקצה השני של המטר לפין השקע המכיל את החוט. העכבה של כל חוט צריכה להיות מתחת ל -3 MΩ.
    3. אם הערכים הנ"ל לא הושגו, reattempt חיבורי ההלחמה.
    4. הסר את החוטים מהמלוחים, לשטוף את הטיפים עם מים, ולבדוק את עכבת חוט היתר עבור כל זיווג (n = 6). עכבת השאר צריכה להיות מעל 5 MΩ.
    5. אם הערכים הנ"ל לא הושגו, פורס כמות קטנה של את הקצה בסוף התמזגו ובדוק שוב.
    6. לבטל את כל סט חוטים שאינו עומד בשתי דרישות עכבה לכל החוטים.
12. Secure tetrode.
    1. מקפלים slig תיבת נייר מלבני קטנהhtly גדול יותר מאשר מתאם השקע.
    2. העבר את המתאם לתוך התיבה עם הצד הגברי בתחתית. לחדור לתיבה, כך שכל הפינים של הצד הגברי הם מחוץ לקופסה ואילו השאר של המתאם הוא בתוך הקופסה.
    3. תדביק את הפינות של התיבה בצד החיצוני. השתמש בפיסות קטנות של סרט דביק דו צדדי בצד הפנימי של התיבה כדי לייצב כל גדילים בודדים של תיל. החוט צריך להיות התמזגו עם יציאתו מהתיבה.
    4. מערבבים את אפוקסי 2 חלק מהיר להגדיר ויוצקים לתוך התיבה כדי לאבטח את המתאם ואת כל החוטים.
    5. צרף את הקצה הקרוב של צינורות המדריך לצד אחד מהקופסה עם שעוות שיניים אבל להשאיר את הצינור לפתוח כזה שtetrode יכול להיות משך דרך בחופשיות בשני הקצוות.
13. לחדד את tetrode.
    1. לפני כל ניסוי, לחתוך את קצה tetrode עם סכין חד אזמל, לא במספריים. זה מונע ריסוק ופילוח של החוט מסתיים תוך מתן יתרון נקי ושטוח לשלב הבא.
       1. השתמש בכלי סיבובי קטן אנכי רכוב עם דיסקי מלטש חצץ בינוני וקנס (ניתן לשלב הבאים על פלטפורמה אחת) כדי למרק tetrode ולהסיר חלק בידוד קצה. החזק את החבילה הקרובה לסיומו עם מלקחיים. הטה את קצה החוט שנקבע ל45 ° זווית ביחס למלטש הדיסק ולגעת בעדינות אותו לדיסק מסתובב במהירות בינוני במשך כ 1 או 2 שניות כל אחד על המדיום ולאחר מכן הגריסים בסדר. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות, axially מסתובבת צרור 90 ° בכל פעם. זה קריטי, כי כיוון הספין של הדיסקים מלטש הוא מהזווית הרדודה של קצות החוט, אחרת הפרדת החוטים עלולה להתרחש.
       2. התוצאה הרצויה הופכת את סוף החבילה מקצה ישר לקצה מחודד עם כמויות קטנות של בידוד הוסרו מסיומו של כל חוט. בדוק את הנקודה באמצעות מיקרוסקופ לנתח לפני ציפוי tetrode. אם כולן מתפורר מתרחש בקצה, חתכתי מחדש וrepolish.
       3. אם בדיקות עכבה בsubsequצעד ציפוי ent מציג ערכי חוט בין נמוכים ביותר (פחות מ 4 MΩ), זה מצביע על יותר מדי חומר שהוסר במהלך שלב הליטוש. חתכתי מחדש וrepolish tetrode.
    2. פלייט tetrode. שים את קצה tetrode לפתרון רווי נחושת גופרתית (85 מיליליטר מים, חומצה גופרתית 5 מיליליטר, נחושת גופרתית 50 גר '). צלחת כל חוט עם נוכחית של 2.5 μA עם מבודד גירוי. הזרק הנוכחי עבור 1 שניות, להשהות ל1 שניות ולחזור על תהליך זה 4x.
    3. בדוק את העכבה של כל חוט וinterimpedance של כל זוג של חוטים. העכבה של כל חוט צריכה להיות בין 0.5-1 MΩ ועכבת השאר צריכה להיות מעל 4 MΩ.
    4. הר את המתאם על headstage של מערכת הקלטה רבת ערוצים.
    5. צרף סיכת חרק כפופה לmicromanipulator. צרף את קצה tetrode לסיכת החרקים בשעוות שיניים

2. הכנת בעלי החיים

1. הרדימימקק עם קרח.
2. אחרי המקק מפסיק לזוז, לרסן את המקק אנכי כנגד משטח פקק שטוח עם סיכות אוכף גדולות שיושבות על החרקים אבל לא לחדור כל חלק של הגוף שלה.
3. העבר את ההכנה לתוך מיכל פלסטיק ומניח את הקרח סביב בעלי החיים כדי למזער את זרימת דם ואת תנועות גוף.
4. מקם צווארון פלסטיק בצוואר כדי לתמוך בראש ומניח את שעוות שיניים סביב הראש כדי לייצב אותו.
5. לחתוך חלון קטן בין ocelli בסכין גילוח ולהסיר את העור המת מהראש.
6. הסר את רקמות חיבור ושומן עם מלקחיים כדי לחשוף את המוח.
7. מקום קצת מלוח מקק לתוך הקפסולה הראש כדי לכסות את רקמת המוח.
8. לdesheath המוח, להשתמש במלקחיים בסדר לתפוס בעדינות את הנדן על החלק העליון של המוח ולהשתמש אחר מלקחיים בסדר לקרוע את הנדן לגזרים באזור המושתל התיל.
9. פתח חור קטן בקפסולה הקדמית ועד ראש שנינות המוחשעות סיכת חרק. הכנס את הצמה של שלושה קטרים ​​גדולים יותר (56 מיקרומטר) בידוד חוטי נחושת לתוך החור לשמש כאלקטרודה השוואתית / קרקע.
10. מנמיכים את הקצה של tetrode אל פני השטח המוח עם micromanipulator ולמקם אותו בסמוך לאזור במוח של עניין.
11. בזהירות במקום שתי חתיכות קטנות של גיליון אצטט דק (2 מ"מ x 1 מ"מ), מעט גדול יותר מהחור בכמוסת הראש, קדמיים ואחוריים לtetrode.
12. הפעל את מערכת ההקלטה.
13. לאט לאט להוריד את מיקרומטר tetrode 150-250 מתחת לפני השטח במוח בהתאם לאיכות ההקלטה.
14. כבה את מערכת ההקלטה.
15. הזז את שני חלקים של גיליון אצטט קרובים לtetrode ככל האפשר מבלי לגעת בו (איור 1 א).
16. מחממים מרית קטנה או מזרק שטוח והכניס אותו לתוך שעוות שיניים כזה שיש שעווה נוזלית בקצה של המרית. לגעת בקצה המרוחק של כל חתיכה של גיליון אצטט בזהירותtetrode עם המרית כך ששעווה נוזלית יכולה לזרום על כל חתיכה ולאטום את הפער בינו לבין לציפורן הראש.
17. חזור על שלב 2.16. זרוק כמות קטנה של שעווה נוזלית על הסדין אצטט בכל פעם. התחל את התהליך הרחק מtetrode ולעבור בהדרגה לכיוון זה. סופו של הדבר tetrode יעוגן על ידי שעוות שיניים. הימנע מקבל שעווה חמה לתוך החלל ועל המוח.
18. השתמש באותה השיטה כמו צעדים 2.16 ו2.17 לעגן את האלקטרודה התייחסות / קרקע עם שעווה.
19. מחממים את השעווה שמתחברת tetrode לmicromanipulator לשחרר tetrode ממנו.
20. לולאת tetrode לשעוות שיניים על הראש כדי לספק הקלה מתח (איור 1).
21. כסה את ההקלה מתח הלולאה עם שעוות שיניים (איור 1 ג).
22. מוציא בזהירות את האילוצים ולהעביר את ההכנה על גבי צלחת פטרי. לרסן את הצד הגבי הכנה עם סיכות אוכף גדולות.
23. לצרףמוט לpronotum באמצעות אקדח דבק. זה מקל עץ המשתרע מpronotum מעל הבטן.
24. צרף את הקצה של צינור tetrode לקצה האחורי של המוט עם שעוות שיניים.
25. לעגן tetrode ואלקטרודה השוואתית / קרקע לקצה הקדמי של המוט עם שעוות שיניים.
26. משוך את tetrode מקצה השקע של הצינור עד כמה שניתן, אבל לא מושך אותו, כדי לחסל את הסיכוי שבעלי החיים עלולים לגרום נזק לחלק של tetrode מחוץ לצינורות (1D איור).
27. הסר את כל האילוצים. צרף את האלקטרודה התייחסות / קרקע לצינורות tetrode בשעוות שיניים.
28. חכה לפחות 60 דקות לבעלי החיים להתאושש מהרדמת הקרח לפני כל ניסוי.

3. פרוצדורות

1. חיבור מחשב עם שני מערכות ההקלטה ונורית באמצעות USB לכבל יציאה טורית.
2. להתחיל הקלטות עצביות.
3. להתחיל הקלטות וידאו ב20 פריימים לשניה להליכה ניסויים באמצעות חבילת תמונת Motmot רכישת ¹⁶ או 120 fps לטיפוס ניסויים באמצעות מצלמה במהירות גבוהה.
4. הנח את המקק ל40 סנטימטר x 40 זירת פרספקס סנטימטר לניסויי הליכה או 58 סנטימטר, רוחב 5 סנטימטר, ו 5 ס"מ גובה זירה לטיפוס ניסויים. יש זירת ההליכה מחסום שקוף המשתרע מאמצע הקיר הימני למרכז הזירה, ומעליו headstage ממוקמת. המחסום משמש למניעת בעלי חיים מהליכה באזורים בהם את תצוגת המצלמה חסומה על ידי headstage. יש זירת טיפוס בלוק אקרילי (או 1.2 סנטימטר או 1.8 סנטימטר, ורוחב 5 ס"מ) או מדף הממוקם בגובה דומה במרכז.
5. ליצור דופק TTL מהמחשב באמצעות פקודת MATLAB מותאמת אישית. (ים = סדרתי ('COM4'); fopen (ים); s.RequestToSend = 'כבוי' / s.RequestToSend = 'על' /; fclose () s; למחוק (ים) ;). דופק TTL יוצר פעמיםלסתום למערכת ההקלטה וגם מדליק או מכבה את אור LED.
6. לאפשר המקק לחקור את הזירה עד שהוא מפסיק לזוז במשך יותר מ 30 שניות לניסויים בהליכה. לאפשר למקק או לטפס על הבלוק / מדף או מנהרה דרך המדף לטיפוס ניסויים.
7. תפסיק הקלטות וידאו.
8. תפסיק הקלטות עצביות.
9. רשום את חותמת הזמן שנוצר על ידי דופק TTL.
10. הסר את המקק מהזירה ולחכות לפחות 3 דקות.
11. חזור על שלבים 3.2-3.10 לניסוי הבא.
12. ברגע שכל ההקלטות כבר הושלמו, עובר 5 שניות של זרם 5 μA DC דרך אחד מהטיפים התיל (האנודה) ואלקטרודה השוואתית (קטודה) להפקיד נחושת לתוך המוח בקצה החוט.

4. ניתוח מנותק

1. לסנכרן את וידאו ונתונים עצביים על ידי קישור את המסגרת שבה אור LED מופעל והחותמת נרשמה על ידי מערכת ההקלטה ברגע זה.
2. חוט קצה מקומות מארק. השתמש בהליכי התעצמות טימס כדי לזרז ולבחון את הנחושת ב12 מיקרומטר סעיפים סידוריים ^17. בולטים פיקדונות צריכים להיות גלויים ב3-8 חלקים סמוכים (כ 18-48% מאורכו של מטוס הגחון הגב של אזורנו להקליט מ) (איור 2).
3. לתאם דחפים חשמליים ספציפיים לפעילותם של נוירונים בודדים. עקוב ספייק הליכי מיון הציגו בפירוט במקומות אחרים ^10,14,18. השתמש בתכנית KlustaKwik (הגרסה 1.5, מחבר ק האריס, אוניברסיטת רטגרס) ליצירת אשכולות ראשוניים, אוטומטיים. לייבא אותם לתוך התכנית MClust (גרסה 3.5, סופרי הספירה redish et al., אוניברסיטת מינסוטה) לחידוד נוסף וניתוח (איור 3).
4. לעקוב אחר תנועותיו של המקק. להליכה ניסויים, לחלץ את עמדתו של המרכז של המקק (החזותי) של מסה וכיוון הגוף שלה בכל מסגרת של vidהקלטות EO באמצעות מרובה טוס Tracker קלטק (גרסת 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) וארגז הכלים FixErrors הקשורים לMATLAB ^19. לטיפוס ניסויים, לחלץ את עמדתו של הבלוק וראשו של התיקן וpronotum בכל מסגרת של הווידאו באמצעות חבילת תוכנה לניתוח תנועה.

תוצאות

הקלטנו את הפעילות העצבית של 50 יחידות מCC ב27 הכנות לניסויי הליכה. ל15 של הכנות אלה (23 יחידות), ניסויי טיפוס היו גם ביצעו. יחידות בודדות בשם פי מספרי הכנה ויחידה (לדוגמה, יחידה 1-2 מציינת הכנה 1, יחידה 2).

תמונות של הווידאו של ניסוי טיפ?...

Discussion

בעוד שהמחקרים קודמים על אלקטרו CC או אזורים אחרים של מוח החרק סיפקו לנו תובנות השליטה המרכזית של התנהגות, רובם בוצעו בשתי הכנות מאופקות ^9,11 או קשורים אלה ^10,14. כתוצאה מכך, של החיה חוויה חושית ומצב פיסיולוגי יכול להיות שונה מאוד מאלו בסביבה טבעית. יתר על כן, המש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis