Extracellulare Wire Tetrode registrazione in Brain di Liberamente Walking Insetti

Riepilogo

Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci permette di monitorare l'attività in singole unità di scarafaggi frenati. Qui vi presentiamo una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare anche l'attività cerebrale nel muoversi liberamente insetti.

Abstract

Crescente interesse per il ruolo di attività cerebrale nel controllo degli insetti motore richiede che saremo in grado di monitorare l'attività neurale, mentre gli insetti eseguono comportamento naturale. Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci hanno permesso di registrare l'attività da più neuroni contemporaneamente, mentre uno scarafaggio tethered acceso o la velocità alterata piedi. Mentre un grande passo avanti, preparati frenati fornire l'accesso a comportamenti limitati e spesso non hanno processi di feedback che si verificano nel muoversi liberamente animali. Presentiamo ora una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare dal complesso centrale di muoversi liberamente scarafaggi mentre camminano in un'arena e affrontare le barriere ruotando, arrampicata o tunneling. Accoppiato con video ad alta velocità e taglio cluster, ora possiamo riguardare l'attività cerebrale di vari parametri del movimento degli insetti banche si comportano.

Introduzione

Questo articolo descrive un sistema di successo per la registrazione dai neuroni all'interno del complesso centrale (CC), della scarafaggio, discoidalis Blaberus, come l'insetto entra in un'arena e si occupa di oggetti che causano a girarsi, tunnel sotto o scavalcare ostacoli. I fili possono essere collegati ad uno stimolatore per evocare attività nel neuropil circostante con cambiamenti comportamentali conseguenti.

Negli ultimi dieci anni grande attenzione è stata rivolta ai ruoli svolti dalle varie regioni del cervello a controllare il comportamento degli insetti. Gran parte di questa attenzione è stata rivolta verso la linea mediana neuropils cerebrali che sono indicate collettivamente come il complesso centrale (CC). Progressi sono stati compiuti a seguito di ampia varietà di tecniche rivolte domande sul ruolo del CC nel comportamento. Tali tecniche vanno da manipolazioni neurogenetici, principalmente in Drosophila, accoppiato con behavianalisi orale ^1-3, a tecniche elettrofisiologiche che monitorano l'attività neurale all'interno del CC e il tentativo di mettere in relazione tale attività ai parametri comportamentale rilevanti.

Tecniche elettrofisiologiche includono la registrazione intracellulare da singoli neuroni identificati ^4-9 e registrazione extracellulare, spesso con sonde multicanale ^10,11. Queste due tecniche sono gratuiti. Registrazione intracellulare con elettrodi taglienti o cerotto cellula intera fornisce dati molto dettagliati sui neuroni identificati, ma si limita a una o due celle contemporaneamente, richiede limitato o nessun movimento, e può essere mantenuta per periodi relativamente brevi di tempo. Registrazioni extracellulari possono essere facilmente impostati, non richiedono moderazione, e può essere mantenuta per ore. Con tetrodi multicanale e taglio cluster, abbastanza grandi popolazioni di neuroni possono essere analizzati simultaneamente ^9,12. Mentre tutta PATC cellulareh è stato utilizzato con successo negli insetti tethered ^13, riteniamo che ci sia anche la necessità di tecniche che ci permettono di registrare l'attività neurale del cervello per lunghi periodi di tempo in banche comportarsi insetti hanno a che fare con le barriere al movimento in avanti.

La necessità di registrare come l'insetto si muove e rimbalza su e giù ci ha spinto verso metodi di registrazione extracellulari. Abbiamo avuto successo in buona registrazione preparazioni trattenuto con commercialmente disponibili sonde 16 canali silicio ^11, tuttavia le piccole dimensioni anche di grandi scarafaggi significa che le sonde devono essere montati dal corpo. Questo, insieme con la delicatezza dei denti sonda, fatta inadeguate per una preparazione gratuita piedi. In due precedenti progetti, abbiamo utilizzato fasci di fili sottili che formano un tetrodo per compiere proprietà di registrazione simili, ma in una disposizione più robusto. Questi bundle tetrode ci ha permesso di registrare da scarafaggi frenati und riguardano l'attività dell'unità CC ai cambiamenti nella velocità di marcia ¹⁴ e girando comportamento risultante dal contatto antenne con una canna ^10.

Utile come queste preparazioni tethered sono stati e continueranno ad essere, fanno presentare alcune limitazioni. In primo luogo, i comportamenti che l'insetto può eseguire soltanto un piano. Cioè, potremmo facilmente evocare cambiamenti nella velocità di camminata o di svolta, ma le azioni di arrampicata e tunnel non fosse possibile, almeno con la disposizione tipica cavezza. In secondo luogo, la nostra preparazione frenati sono "a ciclo aperto". Cioè, non consentono il normale movimento correlata feedback al sistema. Così, come lo scarafaggio acceso nostra tether, il suo mondo visivo non è stata modificata di conseguenza. E 'possibile costruire sistemi ad anello cavezza chiusi per introdurre questo tipo di feedback. Tuttavia, essi sono limitate dalla complessità della programmazione e hardware dell'ambiente visivo simulato. Nevertheless, abbiamo sentito che potevamo migliorare i nostri metodi di registrazione frenati esistenti registrando dall'animale mentre camminava liberamente in un'arena o pista e oggetti che si incontrano come sarebbe nel suo ambiente naturale.

Sebbene sistemi wireless per registrare l'attività cerebrale ¹⁵ sarebbe ideale, sistemi attuali hanno limitazioni nel numero di canali di registrazione, il tempo di acquisizione dei dati, la durata della batteria e peso. Abbiamo, quindi, deciso di provare a migliorare il nostro sistema di registrazione tethered per l'uso in muoversi liberamente preparati. Poichè i migliori sistemi wireless saranno disponibili, questa tecnica può essere facilmente adattato a tali dispositivi. Il sistema che viene descritto in questo articolo è leggero, funziona molto bene e sembra avere un effetto deleterio sul comportamento del scarafaggio. Con una telecamera ad alta velocità poco costoso e software di taglio cluster, l'attività di singoli neuroni del cervello può essere legato al movimento. Qui si descrive la prepazione dei fili tetrode e il loro impianto nel cervello dell'insetto nonché tecniche di registrazione per attività elettrica e di movimento e come tali dati possono essere riuniti per successive analisi.

Protocollo

1. Preparazione dei Fili tetrodo

1. Estrarre un nichelcromo filo molto sottile (12 micron di diametro, rivestimento PAC) di circa 1,1 m di lunghezza. Applicare un tag nastro ad ogni estremità. Appendere il filo su una barra orizzontale filettata tale che le due estremità sono alla stessa altezza vicino al banco.
2. Ripetere passo 1.1 per un secondo filo, rendendo più due estremità per un totale di 4, e posizionarlo accanto al primo filo (circa 1 cm intermedie).
3. Attaccare le quattro estremità insieme con un tag nastro e allegare il tag a un dispositivo motorizzato rotante di avvolgimento. Questo dispositivo può essere costituito da un motore a corrente continua economico.
4. Avvolgere il tetrodo in una direzione per 2 min (60 rpm) e rilassarsi nella direzione opposta per 30 sec.
5. Utilizzare una pistola di calore per fondere i fili insieme. Non toccare i fili con la pistola. Utilizzare tre su e giù passa da direzioni alterne, con ogni passaggio prendendo circa 10 sec.
6. Tagliare la parte superiore e la parte inferiore dei cavi ferita. Le quattro fili sono intrecciati und fuse ad una estremità ma separare all'altra.
7. Aggiungere il tubo portante. Tagliare una lunghezza di 30 centimetri di tubo di polietilene (diametro interno 0,28 millimetri, al di fuori 0,61 millimetri). Infilare il tetrodo molto lentamente e con attenzione nel tubo di supporto in modo da non piegare.
8. Una volta che l'estremità fusa appare dal lato opposto, tirarlo attraverso modo che ci sia una lunghezza uguale di filo ad entrambe le estremità del tubo di guida.
9. Afferra la fine separata di ciascun filo con una pinza. Utilizzando la base della fiamma di un bruciatore a gas, bruciare con attenzione l'isolamento off dell'ultimo 2 o 3 mm di ciascun filo. Riscaldare il filo fino a quando non brilla, ma non arricciare.
10. Collegare il tetrodo con un maschio-femmina IC presa adattatore che si inserisce il dispositivo di registrazione. Mettere fine deinsulated di ciascun filo in una presa diversa della scheda con una pinza. Stabilizzare il filo nella presa con un piccolo perno in ottone. Utilizzare una punta fine saldatore e riempire il portalampada con la saldatura fusa. Fare attenzione a non contattareil filo fragile con il saldatore.
11. Controllare l'impedenza di ciascun filo e l'inter impedenza di ciascuna coppia di fili.
    1. Posizionare il fuso, fine ritorto in un contenitore di soluzione fisiologica e collegare un filo conduttore di rame dalla soluzione salina allo strumento ohm.
    2. Collegare l'altra estremità del metro al pin presa contenente il filo. L'impedenza di ciascun filo deve essere inferiore a 3 mW.
    3. Se i valori di cui sopra non vengono raggiunti, riprovare le connessioni di saldatura.
    4. Rimuovere i fili dal salino, sciacquare le punte con acqua, e testare l'impedenza del filo tra per ogni associazione (n = 6). L'impedenza tra deve essere superiore a 5 mW.
    5. Se i valori di cui sopra non vengono raggiunti, tagliare una piccola quantità della punta fino alla fine fuso e ripetere il test.
    6. Scartare qualsiasi insieme filo che non soddisfa entrambi i requisiti di impedenza per tutti i fili.
12. Fissare il tetrodo.
    1. Piegare una piccola scatola di carta rettangolare SLIGhtly più grande della presa adattatore.
    2. Trasferire l'adattatore nella scatola con il lato maschio in basso. Penetrazione dell'acqua in modo tale che tutti i pin del lato maschio sono fuori area mentre il resto della scheda è all'interno della scatola.
    3. Nastro angoli della scatola all'esterno. Utilizzare piccoli pezzi di nastro adesivo a doppia facciata all'interno della scatola per stabilizzare eventuali singoli fili di filo. Il filo deve essere protetta in quanto esce dalla scatola.
    4. Mescolare velocemente set 2 parte epossidica e versare nella casella per fissare l'adattatore e tutti i cavi.
    5. Attaccare l'estremità vicina del tubo resoconto di un lato della scatola con cera dentale ma lasciano il tubo aprire tale che il tetrodo può essere tirato attraverso banche alle due estremità.
13. Contrasta il tetrodo.
    1. Prima di ogni esperimento, tagliare la punta del tetrodo con una lama di bisturi affilato, non forbici. Questo impedisce frantumazione e divaricazione del filo termina fornendo un bordo piatto per la fase successiva.
       1. Utilizzare un piccolo utensile rotante montato verticalmente con i dischi di levigatura media e fine grana (questi possono essere combinati su una piattaforma) per lucidare il tetrodo e rimuovere alcuni isolamento punta. Tenere il fascio vicino alla sua estremità con una pinza. Inclinare la fine impostare legare ad un angolo di 45 ° rispetto al disco abrasivo e toccare delicatamente il disco rotante velocità moderata per circa 1 o 2 sec ciascuno sul supporto e poi le belle grane. Ripetere questo tre volte di più, la rotazione assiale del fascio di 90 ° ogni volta. E 'fondamentale che la direzione di rotazione dei dischi abrasivi è fuori l'angolo delle estremità del filo superficiale, altrimenti separazione dei fili può verificarsi.
       2. Il risultato desiderato trasforma l'estremità fascio da un regolo di una punta con piccole quantità di isolante rimosso dall'estremità di ciascun filo. Verificare il punto utilizzando un microscopio da dissezione prima placcatura tetrodo. Se qualche sfilacciamento si verifica sulla punta, ripassare e rilucidare.
       3. Se il test di impedenza durante il subsequpasso placcatura ent mostra valori filo interrelazioni estremamente basse (meno di 4 mW), indica troppo materiale rimosso durante la fase di lucidatura. Recut e rilucidare il tetrodo.
    2. Piatto tetrodo. Mettere la punta del tetrodo in una soluzione satura di solfato di rame (acqua 85 ml, 5 ml di acido solforico, 50 g di solfato di rame). Piastra ogni filo con una corrente di 2,5 μA con un isolatore stimolo. Iniettare la corrente per 1 sec, una pausa di 1 sec e ripetere questo processo 4x.
    3. Controllare l'impedenza di ciascun filo e la interimpedance di ciascuna coppia di fili. L'impedenza di ciascun filo deve essere compresa tra 0,5-1 mW e tra l'impedenza deve essere superiore a 4 mW.
    4. Montare l'adattatore sulla headstage di un sistema di registrazione multicanale.
    5. Collegare un pin insetto piegato per un micromanipolatore. Fissare la punta del tetrodo al pin insetto con impronte dentarie

2. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare l'scarafaggio con ghiaccio.
2. Dopo lo scarafaggio smette di muoversi, frenare lo scarafaggio verticale su una superficie di sughero piatta con grandi perni sella a cavallo che l'insetto, ma non penetrano qualsiasi parte del suo corpo.
3. Trasferire il preparato in un contenitore di plastica e posizionare ghiaccio intorno all'animale di minimizzare il flusso di sangue e movimenti del corpo.
4. Posizionare un collare di plastica al collo per sostenere la testa e mettere la cera dentale intorno alla testa per stabilizzarlo.
5. Tagliare una piccola finestra tra il ocelli con una lama di rasoio e rimuovere la cuticola dalla testa.
6. Rimuovere i tessuti connettivi e grassi con una pinza per esporre il cervello.
7. Mettere un po 'di soluzione salina scarafaggio nella capsula testa per coprire il tessuto cerebrale.
8. Per desheath cervello, utilizzare una pinza sottile per afferrare delicatamente la guaina sulla parte superiore del cervello e utilizzare un altro pinza sottile strappare la guaina a parte nella zona impiantato filo.
9. Aprire un piccolo foro nella testa capsula anteriore per l'arguzia cervelloh un pin insetto. Inserire una treccia di tre diametri più grandi (56 micron) isolati fili di rame nel foro per servire come un elettrodo di riferimento / massa.
10. Abbassare la punta del tetrodo alla superficie del cervello con micromanipolatore e posizionarlo vicino alla regione del cervello di interesse.
11. Posizionare con cura due piccoli pezzi di foglio di acetato sottile (2 millimetri x 1 mm), leggermente più grande del foro nella capsula testa, anteriore e posteriore al tetrodo.
12. Accendere il sistema di registrazione.
13. Abbassare lentamente il tetrodo 150-250 micron sotto la superficie del cervello a seconda della qualità di registrazione.
14. Spegnere il sistema di registrazione.
15. Spostare i due pezzi di lamiera acetato più vicino al tetrodo possibile senza toccarlo (Figura 1A).
16. Scaldare una piccola spatola o appiattita ago ipodermico e metterlo in cera dentale tale che vi sia cera liquida sulla punta della spatola. Toccare con attenzione il fondo di ogni pezzo di foglio di acetato dallatetrodo con la spatola in modo che la cera liquida può affluire su ogni pezzo e sigillare il divario tra essa e la cuticola testa.
17. Ripetere passo 2.16. Drop un piccola quantità di cera liquida sul foglio di acetato di volta in volta. Avviare il processo lontano dal tetrodo e muoversi gradualmente verso di esso. Alla fine il tetrodo sarà ancorato da impronte dentarie. Evitare di entrare cera calda nella cavità e sul cervello.
18. Utilizzare lo stesso metodo passaggi 2.16 e 2.17 per ancorare l'elettrodo di riferimento / terra con cera.
19. Riscaldare la cera che attribuisce tetrodo al micromanipolatore per rilasciare il tetrodo da esso.
20. Loop tetrodo nella cera dentale sulla testa per fornire un sollievo strain (Figura 1B).
21. Coprire il ciclo antistrappo con cera dentale (Figura 1C).
22. Rimuovere con attenzione i vincoli e trasferire la preparazione su una piastra di Petri. Frena la parte di preparazione dorsale con grandi perni sella.
23. Allegareun'asta per il pronoto utilizzando una pistola per colla. Questo è un bastone di legno che si estende dal pronoto sopra l'addome.
24. Fissare la punta del tubo tetrodo alla estremità posteriore della barra con cera dentale.
25. Ancorare il tetrodo e l'elettrodo di riferimento / terra per l'estremità anteriore della canna con la cera dentale.
26. Estrarre il tetrodo dal terminale del tubo, per quanto possibile, ma non tirare su di esso, in modo da eliminare la possibilità che l'animale può danneggiare la parte del tetrodo fuori del tubo (Figura 1D).
27. Rimuovere tutti i vincoli. Fissare l'elettrodo di riferimento / terra per il tubo tetrodo con cera dentale.
28. Attendere almeno 60 minuti per consentire all'animale di riprendersi dall'anestesia ghiaccio prima di ogni esperimento.

3. Procedure sperimentali

1. Collegare un PC sia con il sistema di registrazione e di una luce a LED utilizzando un cavo USB per porta seriale.
2. Iniziate le registrazioni neurali.
3. Inizia registrazioni video a 20 fotogrammi al secondo per camminare esperimenti utilizzando il pacchetto di acquisizione di immagini Motmot ¹⁶ o 120 fps per salire esperimenti utilizzando una telecamera ad alta velocità.
4. Posizionare lo scarafaggio in un 40 centimetri x 40 centimetri plexiglas arena per esperimenti a piedi o A 58 cm di lunghezza, 5 cm di larghezza e 5 cm di altezza arena per l'arrampicata esperimenti. Il walking arena ha una barriera trasparente che si estende dal centro della parete destra al centro dell'arena, sopra il quale si trova il headstage. La barriera è usato per impedire agli animali di camminare in zone in cui la telecamera è bloccata dal headstage. L'Arena arrampicata ha un blocco acrilico (sia 1,2 centimetri o alta 1,8 centimetri e larga 5 cm) o una mensola situata ad un'altezza paragonabile al centro.
5. Genera un impulso TTL dal PC utilizzando un comando MATLAB personalizzata. (S = di serie ('COM4'); fopen (s); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = 'on' /; fclose (s), delete (s) ;). L'impulso TTL genera voltetamp per il sistema di registrazione e sia accende o si spegne la luce del LED.
6. Lasciare lo scarafaggio per esplorare la scena fino a quando non si ferma per più di 30 secondi per esperimenti a piedi. Lasciare lo scarafaggio a uno scavalcare il blocco / scaffale o tunnel attraverso la piattaforma per l'arrampicata esperimenti.
7. Smettere di registrazioni video.
8. Smettere di registrazioni neurali.
9. Annotare il timestamp generato dal impulso TTL.
10. Rimuovere lo scarafaggio dall'arena e attendere almeno 3 minuti.
11. Ripetere i passaggi 3,2-3,10 per la prova successiva.
12. Una volta che tutte le registrazioni sono state completate, passare 5 sec di corrente 5 μA DC attraverso una delle estremità del filo (anodo) e l'elettrodo di riferimento (catodo) per depositare rame nel cervello sulla punta del filo.

4. Analisi Offline

1. Sincronizzare video e dati neurali collegando il fotogramma in cui si accende la luce LED e il timestamp registrato dal sistema di registrazione aquel momento.
2. Segna località punta del filo. Utilizzare le procedure intensificazione Timms per precipitare e osservare il rame in 12 sezioni micron di serie ^17. Depositi prominenti dovrebbero essere visibili in 3-8 sezioni adiacenti (circa 18-48% della lunghezza del piano ventrale dorsale della zona abbiamo da registrare) (Figura 2).
3. Correlare specifici impulsi elettrici per l'attività dei singoli neuroni. Seguire picco procedure di selezione indicate nel dettaglio altrove ^10,14,18. Utilizzare il programma KlustaKwik (versione 1.5, autore K. Harris, Rutgers University) per generare iniziale, clustering automatico. Importarli nel programma MClust (versione 3.5, gli autori AD Redish et al., University of Minnesota) per un ulteriore affinamento e l'analisi (Figura 3).
4. Seguire i movimenti del scarafaggio. Per camminare esperimenti, estrarre la posizione di (visivo), il centro di scarafaggio della massa e del suo orientamento corpo in ogni fotogramma del vidregistrazioni eo utilizzando il Caltech multipla Fly Tracker (versione 0.1.5.6, http://ctrax.sourceforge.net/) e il FixErrors toolbox associato per MATLAB ^19. Per l'arrampicata esperimenti, estrarre la posizione del blocco e la testa del scarafaggio e pronoto in ogni fotogramma del video utilizzando il pacchetto software di analisi del movimento.

Risultati

Abbiamo registrato l'attività neurale di 50 unità dal CC in 27 preparazioni per esperimenti a piedi. Per 15 di questi preparati (23 unità), sono stati eseguiti esperimenti di arrampicata. Le singole unità sono denominati in base ai numeri di preparazione e di unità (ad esempio unità 1-2 indica di preparazione 1, 2 unità).

Istantanee del video di una prova arrampicata sono mostrati in Figura 4. L'intero video è disponibile in supplementare Vid...

Discussione

Mentre precedenti studi elettrofisiologici sulla CC o di altre regioni del cervello dell'insetto ci hanno fornito intuizioni nella centrale di controllo del comportamento, la maggior parte di loro sono stati eseguiti sia in preparazioni trattenuti ^9,11 o quelli frenati ^10,14. Come risultato, dell'animale esperienza sensoriale e lo stato fisiologico potrebbe essere molto diverse da quelle in un ambiente naturale. Inoltre, i compiti comportamentali che l'animale può eseguire soltanto un ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis