Serbestçe Böcekler Yürüyüş Beyin Ektraselüler Tel Tetrode Kaydı

Özet

Biz daha önce bize gergin hamamböceği bireysel birimlerin etkinliğini izlemek için izin verir hamamböceği beyinlerinin merkezi kompleksi içine tetrode telleri implante için bir teknik geliştirdi. Burada bize de özgürce böcekler hareket beyin aktivitesini kaydetmenize olanak sağlayan tekniğin değiştirilmiş bir sürümü mevcut.

Özet

Böcek motor kontrolünde beyin aktivitesinin rolü artan ilgi biz böcekler doğal davranışı gerçekleştirmek ise nöral aktiviteyi izlemek mümkün olmasını gerektirir. Bir gergin hamamböceği çıktı veya değiştirilmiş yürüme hızı Biz ise daha önce aynı anda birden bize nöronların aktivitesini kaydetmek için izin hamamböceği beyinlerinin merkezi kompleksi içine tetrode telleri implante için bir teknik geliştirdi. Büyük bir ilerleme olsa da, gergin hazırlıklar sınırlı davranışlara erişim sağlar ve genellikle serbestçe hayvanlar hareket meydana geribildirim süreçleri yoksundur. Şimdi bize de bir arenada yürümek ve dönüm tırmanma ya da tünel yoluyla engelleri ile uğraşmak gibi özgürce hamamböceği hareket merkezi kompleksinden kaydetmenize olanak sağlayan tekniğin değiştirilmiş bir sürümü mevcut. Yüksek hızlı video ve küme kesme ile birleştiğinde, biz şimdi özgürce davranmak böceklerin hareketinin çeşitli parametrelere beyin aktivitesini ilgili olabilir.

Giriş

Böcek o altında, etrafında tünel açmak, ya da engeller üzerinde tırmanmaya neden nesnelerle bir arenada ve fırsatlar yürür gibi bu makalede, merkezi kompleksi hamamböceği, Blaberus discoidalis ve (CC) içerisindeki nöronların kayıt için başarılı bir sistem anlatılmaktadır. Telleri de buna bağlı olarak davranış değişiklikleri ile çevresindeki nöropilde aktivitesi uyandırmak için bir uyarıcı bağlanabilir.

Son on yılda büyük ilgi böcek davranışlarını kontrol çeşitli beyin bölgeleri tarafından oynanan roller yönelik olmuştur. Bu odak çok toplu merkezi kompleksi (CC) olarak adlandırılan orta hat beyin neuropils doğru yönlendirilir edilmiştir. İlerleme davranış MK rolü hakkında sorular hedefleme teknikleri geniş çeşitleri bir sonucu olarak yapılmıştır. Bu teknikler davranışına ile birlikte esas olarak Drosophila nörogenetik manipülasyonlar, aralığıCC ve davranışsal ilgili parametreler için bu aktivite ile ilgilidir girişimi içinde nöral aktiviteyi izlemek elektrofizyolojik teknikler oral analiz ^1-3.

Elektrofizyolojik teknikler çoğu zaman, çok kanallı probları ^10,11 ile, tek tek tanımlanmış nöronlar ^4-9 ve hücre dışı kayıt hücre içi kayıt içerir. Bu iki teknik ücretsizdir. Sivri elektrotlar veya bütün hücre yama ile hücre içi kayıt tespit nöronlarda çok ayrıntılı sağlar, ancak aynı anda bir veya iki hücreler ile sınırlıdır, sınırlı ya da hiç hareket gerektirir ve zaman nispeten kısa bir süre için muhafaza edilebilir. Ekstrasellüler kayıtları kolayca kısıtlama gerekmez, kurulabilir ve saat için muhafaza edilebilir. Çok kanallı tetrodes ve küme kesim, nöronların oldukça büyük nüfusları aynı anda ^9,12 analiz edilebilir. Da bütün hücre patch başarıyla gergin böcekler ¹³ kullanılmıştır, biz onlar ileriye hareket engelleri ile uğraşmak gibi bize serbestçe böcekler davranıyor uzun süre için beyindeki nöral aktiviteyi kaydetmek için izin teknikleri için de ihtiyaç olduğunu hissediyorum.

Aşağı böcek hamle ve yukarı sıçrar ve olarak kaydetmek için ihtiyaç dışı kayıt yöntemleri bize doğru itti. Biz piyasada mevcut 16 kanal silikon sondalar ¹¹ ile ölçülü hazırlıklarında iyi bir başarı kayıt vardı, ancak hatta büyük hamamböceği küçük boyutlu sondalar vücudunu monte edilmesi anlamına gelir. Yani, prob kollarının incelik ile birlikte, bir ücretsiz yürüyüş hazırlanması için uygun olmaktan yaptı. Önceki iki projelerde, benzer kayıt özelliklerini gerçekleştirmek için bir TETRODE oluşturan ince tellerin demetleri kullanılan ancak daha sağlam bir düzenleme. Bu tetrode demetleri bizi gergin hamamböceği kaydetmek için izin verilen birhızı ¹⁴ yürüme ve bir çubuk ¹⁰ ile antennal temas sonucunda davranış dönüm değişikliklere CC birim aktivite ile ilgilidir d.

Bu gergin hazırlıklar olmuştur ve olmaya devam edecektir olarak yararlı, bazı sınırlamalar mevcut yapmak. İlk olarak, böcek gerçekleştirebilir davranışlar bir düzleme sınırlıdır. Yani, biz kolayca yürüme hızında ya da dönüm değişiklikleri uyandırmak olabilir, ama tırmanma ve tünel eylemleri en azından tipik urgan düzenleme ile mümkün değildi. İkincisi, bizim gergin hazırlıkları "açık döngü" vardır. Yani sisteme normal hareket ile ilgili geribildirim için izin kalmamasıdır. Hamamböceği Sabrımızın açık olarak Böylece, görsel dünya buna göre değişmiş değildi. Bu geribildirim, bu tür tanıtmak için kapalı döngü urgan sistemleri kurmak mümkündür. Bununla birlikte, simüle edilmiş görsel ortamının programlama ve donanım karmaşıklığı ile sınırlıdır. Nevertheless, biz bunun doğal ortamda olduğu gibi bir arena veya pist ve karşılaşılan nesneler özgürce yürürken biz hayvandan kaydederek, mevcut gergin kayıt yöntemleri geliştirmek olduğunu hissettim.

Beyin aktivitesini ¹⁵ kayıt için kablosuz sistemler ideal olacaktır rağmen, mevcut sistem kayıt kanallarının sayısının, veri toplama, pil ömrü ve ağırlık zamanında sınırlamaları vardır. Biz bu nedenle, özgürce hazırlıkları hareketli kullanım için gergin kayıt sistemi adapte etmeye seçti. Daha iyi bir kablosuz sistemler kullanılabilir hale gibi, bu tekniğin bu tür cihazlara kolaylıkla adapte edilebilir. Bu makalede açıklanan sistem, hafif çok iyi çalışır ve böceğin davranışına çok az zararlı bir etkiye sahip olduğu görülmektedir. Ucuz bir yüksek hızlı kamera ve küme kesme yazılım ile, bireysel beyin nöronları aktivite hareketi ile ilgili olabilir. Burada Prepar tariftetrode teller ve böceğin beyin içine implantasyonu yanı sıra elektriksel aktivite ve hareket ve nasıl bu veri için kayıt teknikleri tirme sonraki analiz için bir araya getirilebilir.

Protokol

1.. Tetrode Teller hazırlanması

1. Yaklaşık 1.1 m uzunluğunda çok ince nikrom tel (12 mikron çapında, PAC kaplama) çekin. Her ucuna bir teyp etiket takın. Iki ucu, masa üstü yanında aynı yükseklikte olacak şekilde yatay dişli çubuk üzerinde tel asın.
2. 4 bir toplam iki ucu yapma, ikinci bir kablo için bir adım 1.1 yineleyin ve sonraki birinci tel arasında (yaklaşık 1 cm) için koyun.
3. Bir kaset etiketi ile birlikte dört ucu sopa ve bir motorlu döner sarma cihazına iliştirirsiniz. Bu cihaz, ucuz bir DC motorundan yapılabilir.
4. 2 dakika boyunca (60 rpm) için, bir yönde tetrode rüzgar ve 30 saniye için ters yönde açmak.
5. Birlikte telleri kaynaştırmak için bir ısı tabancası kullanın. Tabanca ile teller dokunmayın. Her geçiş yaklaşık 10 saniye alarak, yukarı ve aşağı geçer alternatif yönlerde üç kullanın.
6. Üst ve yara tellerin alt kesin. Dört teller bükülür bird bir ucunda birbirine bağlı ama diğer ayrılmasına.
7. Destek tüpü ekleyin. Polietilen boru 30 cm uzunluğunda (: inside 0.28 mm, dış 0.61 mm çap) kesin. Çok yavaş ve dikkatli bir şekilde destek borusu içine doğru kıvırmayın kalmaması TETRODE geçirin.
8. Kaynaşık ucu ise diğer yan göründüğünde, kılavuz tüpün her iki uçta tel eşit uzunlukta olacak şekilde, içinden geçirin.
9. Bir forseps ile her telin ayrı ucunu tut. Bir gaz brülör alev tabanı kullanılarak, dikkatle her tel son 2 veya 3 mm kapalı yalıtım yakmak. O parlıyor kadar tel ısıtmak, ama kıvırın değil.
10. Lütfen kayıt cihazı uyan bir erkek-kadın IC priz ile TETRODE bağlayın. Bir forseps ile adaptörü farklı bir prize her telin deinsulated sonuna koyun. Küçük bir pirinç iğne ile sokete tel stabilize. Ince bir nokta havya kullanın ve erimiş lehim ile soketi doldurun. Temas etmemeleri için dikkatli olunhavya ile kırılgan tel.
11. Her bir tel empedansını ve tellerin her bir çiftin arası empedans kontrol edin.
    1. Tuzlu su bir kap içine erimiş, bükülmüş ucunu ve ohm metre tuzlu bir bakır tel iletken bağlayın.
    2. Teli içeren soket pin metre diğer ucunu. Her bir tel empedansı 3 MQ altında olmalıdır.
    3. Yukarıdaki değerler elde değilseniz, lehim bağlantıları reattempt.
    4. , Tuzlu gelen kabloları çıkarın suyla durulayın ipuçları ve her bir eşleştirme için inter tel empedans testi (n = 6). Arası empedans 5 MQ üzerinde olmalıdır.
    5. Yukarıdaki değerler elde değilseniz, kaynaşmış sonunda ucu kapalı küçük bir miktar dilim ve yeniden test edin.
    6. Tellerin tüm empedans gereksinimleri hem uymayan herhangi bir kablo seti atın.
12. TETRODE sabitleyin.
    1. Küçük bir dikdörtgen kağıt kutusu Slig Foldpriz daha büyük ı çözünebilir durumda bulundu.
    2. Altındaki erkek tarafı ile kutunun içine adaptörü aktarın. Adaptörün kalan kutunun içinde iken erkek tarafı bütün iğneler kutunun dışında olduğu şekilde kutuyu nüfuz.
    3. Dış kutunun köşelerine bantlayın. Tel herhangi bir bireysel ipliklerini dengelemek için kutunun iç çift taraflı yapışkan bant arasında küçük parçalar kullanın. Bu kutu çıkan kablo bağlı olmalıdır.
    4. Hızlı set 2 parça epoksi karıştırın ve adaptörü ve tüm kabloları sabitlemek için kutunun içine dökün.
    5. Diş balmumu ile kutunun bir tarafına kılavuz boru yakın ucunu ancak boru tetrode her iki uçta da serbest bir şekilde çekilebilir şekilde açık bırakır.
13. TETRODE netleştirin.
    1. Her deneyden önce, keskin bir neşter bıçak, makas değil ile TETRODE ucunu kesti. Bu ezme önler ve bir sonraki aşama için bir temiz ve düz bir kenar sağlarken telin meyletme sona erer.
       1. Küçük bir döner alet TETRODE lehçe ve bazı uç izolasyon kaldırmak için (bu bir platform üzerinde kombine edilebilir) orta ve ince kum zımpara diskleri ile dikey olarak monte kullanın. Forseps ile sonuna paket tutun. Zımpara diske 45 ° açı ile tel ayarlamak ucunu eğin ve hafifçe ortamda her biri yaklaşık 1 ya da 2 saniye boyunca orta hızda dönen bir disk için dokunun ve daha sonra ince irmik. Demetin eksenel olarak 90 ° döner, her zaman, bu üç kez tekrarlayın. Bu başka tellerin ayrılması meydana gelebilir, zımpara disklerin dönüş yönünün uzak kablo uçlarının sığ açısı olması önemlidir.
       2. Arzu edilen sonuç, her bir telin ucundan çıkarılır yalıtım az miktarda olan bir sivri ucu düz bir kenardan paket ucu dönüştürür. TETRODE kaplama önce bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak noktasını doğrulayın. Herhangi bir yıpranma ucunda oluşursa, recut ve repolish.
       3. Eğer subsequ boyunca empedans testient kaplama adım son derece düşük inter tel değerleri (az 4 MQ) gösterir, bu parlatma adımı sırasında çıkarılan çok malzemeyi gösterir. Recut ve TETRODE repolish.
    2. TETRODE Plate. Doymuş bakır sülfat çözeltisi (85 mi su, 5 ml sülfürik asit, 50 g bakır sülfat) içine tetrode ucu koyun. Levha bir uyaran izolatör ile 2.5 uA bir akım ile her tel. , 1 saniye akımı enjekte 1 saniye duraklama ve bu işlemi 4x tekrarlayın.
    3. Her bir tel empedansını ve tellerin her bir çiftin interimpedance edin. Her telin empedans 0.5-1 MQ ve arası empedans 4 MQ üzerinde olmalıdır arasında olmalıdır.
    4. Çok kanallı kayıt sistemi headstage üzerine montaj adaptörü.
    5. Bir micromanipulator bükük bir böcek pin takın. Diş balmumu ile böcek pimine tetrode ucu takın

2. Hayvan Preparasyon

1. Uyutmakbuz ile hamamböceği.
2. Hamamböceği hareket durduktan sonra, böcek apışıp büyük eyer iğneler ile düz bir mantar yüzeye karşı dikine hamamböceği dizginlemek ama onun vücudunun herhangi bir bölümünü nüfuz etmezler.
3. Plastik bir kap içine aktarın hazırlama ve kan akışı ve vücut hareketleri en aza indirmek için, hayvanın etrafında buz yerleştirin.
4. Başını desteklemek ve stabilize başının etrafında diş mumu yerleştirmek için boynunda bir plastik bilezik yerleştirin.
5. Bir jilet ile ocelli arasında küçük bir pencere kesin ve baş kütikül çıkarın.
6. Beyin ortaya çıkarmak için forseps ile bağ dokuları ve yağ çıkarın.
7. Beyin dokusu kapsayacak baş kapsülü içine bazı hamamböceği tuzlu yerleştirin.
8. Beyin desheath için, hafifçe beyin üstüne kılıfı kapmak ve tel implante alanında ayrı kılıfı gözyaşı başka bir ince forseps kullanılacak bir ince forseps kullanır.
9. Beyin zekâ baş kapsül anterior küçük bir delik açınh bir böcek pin. Bir referans / toprak elektrot olarak hizmet deliğe bakır teller izolasyonlu üç büyük çaplarda (56 mikron) bir örgü yerleştirin.
10. Mikromanipülatör ile beyin yüzeyine TETRODE ucu düşürmek ve faiz beyin bölgesi yakınında konumlandırmak.
11. Dikkatlice tetrode ince asetat tabaka iki küçük parçalar kafa kapsül içindeki delik biraz daha büyük (2 mm x 1 mm), ön ve arka yerleştirin.
12. Kayıt sistemi açın.
13. Yavaşça kayıt kalitesine bağlı olarak beyin yüzeyinin altında tetrode 150-250 mikron düşük.
14. Kayıt sistemini kapatın.
15. (Şekil 1A) dokunmadan mümkün olduğunca TETRODE yakın olarak asetat levha iki adet taşıyın.
16. Küçük bir spatula veya düzleştirilmiş derialtı iğne ısıtın ve sıvı balmumu spatula ucunda olduğu şekilde diş mumu koydu. Dikkatle gelen asetat tabakanın her parçasının uzak ucuna temassıvı balmumu her parça üzerine akmasına ve onunla baş manikür arasındaki boşluğu kapamak böylece spatula ile TETRODE.
17. Adımı 2.16 tekrarlayın. Asetat tabaka her üzerine sıvı balmumu küçük bir miktar bırakın. Uzakta TETRODE gelen işlemini başlatın ve doğru yavaş yavaş hareket. Sonunda tetrode diş balmumu tarafından demirlemiş olacaktır. Boşluğuna ve beynin üzerine sıcak balmumu kaçının.
18. Balmumu ile başvuru / toprak elektrot demirlemek için 2,16 ve 2,17 adımları gibi aynı yöntemi kullanın.
19. Ondan TETRODE serbest bırakmak için micromanipulator TETRODE verdiği balmumu ısıtın.
20. Döngü bir gerginlik rahatlama (Şekil 1B) sağlamak için kafasına diş balmumu içine tetrode.
21. Dişçilik mumları (Şekil 1C) ile gerginlik kabartma döngü örtün.
22. Dikkatlice kısıtlamaları ortadan kaldırmak ve bir Petri kabı üzerine hazırlanmasını aktarın. Büyük eyer pimleri ile hazırlık dorsal yüzü yukarı dizginlemek.
23. IliştirmekBir tutkal tabancası kullanarak pronotum bir çubuk. Bu karın üzerinde pronotum uzanan bir tahta sopa.
24. Diş balmumu ile çubuğun arka ucuna tetrode boru ucu takın.
25. Diş balmumu ile çubuğun ön ucuna tetrode ve referans / toprak elektrotu Çapa.
26. Mümkün olduğunca boru soketi ucundan tetrode çekin, ama hayvan boru (Şekil 1D) dışında tetrode bölümünü hasar ihtimalini ortadan kaldırmak amacıyla, üzerinde römorkör yoktur.
27. Tüm kısıtlamalar çıkarın. Diş balmumu ile tetrode boru için başvuru / toprak elektrot takın.
28. Her deneyden önce buz anestezi kurtarmak için bir hayvan için en az 60 dakika bekleyin.

3. Deney Prosedürleri

1. Kayıt sistemi ve seri port kablosu için bir USB kullanarak bir LED ışık hem de bir PC'ye bağlayın.
2. Sinir kayıtları başlayın.
3. Yüksek hızlı kamera kullanarak deneyler tırmanma Motmot görüntü toplama paketini ¹⁶ veya 120 fps kullanarak deneyler yürüyüş için saniyede 20 kare video kayıtları başlayın.
4. Yürüyüş deneyler ya bir 58 cm uzun, 5 cm genişliğinde ve deneyleri tırmanış için 5 cm yüksek arena için x 40 cm pleksiglas arena 40 cm içine hamamböceği yerleştirin. Yürüme arena headstage bulunduğu yukarıda arenada merkezine doğru duvarının ortasında uzanan şeffaf bir engel vardır. Bariyer kamera görünümü headstage tarafından engellenen alanlarda yürüyüş hayvanlar önlemek için kullanılır. Tırmanma arena bir akrilik blok (1.2 cm ya da 1.8 cm yüksekliğinde ve 5 cm genişliğinde olarak) veya merkezde benzer bir yükseklikte yer alan bir raf sahiptir.
5. Özelleştirilmiş bir MATLAB komutunu kullanarak PC'den bir TTL darbe üretir. (S = seri ('COM4'); fopen (ler); s.RequestToSend = 'off' / s.RequestToSend = / 'üzerinde'; fclose (ler);) s (silin ;). TTL darbe bir kez oluştururkayıt sistemi için bastırmaya ve açılır veya LED ışığı kapanır ya.
6. Bu yürüyüş deneyler için daha 30 saniye boyunca durana kadar hamamböceği arenada keşfetmenizi sağlayacak. Hamamböceği deneyleri tırmanma için raf yoluyla blok / raf veya tünel tırmanmak ya izin verir.
7. Video kayıtları durdurmak.
8. Sinir kayıtları durdurmak.
9. TTL darbe tarafından oluşturulan damgası yazın.
10. Arenada hamamböceği çıkarın ve en az 3 dakika bekleyin.
11. Tekrar bir sonraki duruşma için 3,2-3,10 adımları.
12. Bir kez tüm kayıtları tamamlandı, tel uçları (anot) ve tel ucunda beyin içine bakır yatırmak için referans elektrot (katot) biri aracılığıyla 5 uA DC akım 5 saniye geçmektedir.

4. Çevrimdışı Analizi

1. LED ışık açıldığında çerçeve ve en kayıt sistemi tarafından kaydedilen damgası bağlayarak video ve nöral verileri senkronizeo an.
2. Mark tel ucu yerleri. 12 mikron seri bölümleri ¹⁷ bakır çöktürmek ve gözlemlemek için Timms yoğunlaşma işlemleri kullanın. Tanınmış mevduat 3-8 bitişik bölümleri (alan dorsal ventral uçağın uzunluğunun yaklaşık 18-48% biz kayıt) (Şekil 2) görünür olmalıdır.
3. Tek bir nöron aktivitesi özgü elektrik darbeleri Correlate. Başka ^10,14,18 ayrıntılı ortaya koydu sıralama prosedürleri başak izleyin. İlk, otomatik kümelenme oluşturmak için programı KlustaKwik (sürüm 1.5, yazar K. Harris, Rutgers Üniversitesi) kullanın. Ileri arıtma ve analizi (Şekil 3) için programa MClust (sürüm 3.5, yazarlar AD Redish vd., Minnesota Üniversitesi) aktarmak.
4. Böceğin hareketlerini takip. Deneyleri yürüyüş için, vid, her çerçeve içinde kitle ve vücut yönelim böceğin (görsel) merkezi konumunu ayıklamakve MATLAB ¹⁹ için ilişkili FixErrors araç kutusunu, Caltech Çoklu Fly Tracker (http://ctrax.sourceforge.net/ version 0.1.5.6) kullanılarak eo kayıtları. Deneyleri tırmanışı için, hareket analizi yazılım paketi kullanarak videonun her karesinde blok ve böceğin baş ve pronotum konumunu ayıklayın.

Sonuçlar

Biz yürüme deneyleri için 27 hazırlıklarında CC 50 adet nöral aktiviteyi kaydetti. Ancak bu preparasyonların (23 adet) 15 için, deneyler tırmanma yapıldı. Bireysel birimler (örneğin birim 1-2 hazırlık 1, ünite 2 gösterir) hazırlama ve birim numaralarına göre adlandırılır.

Bir tırmanma deneme video Anlık Şekil 4'te gösterilmiştir. Tüm video (ses ünitesi 1-2 dan) ek video 1'de kullanılabilir. Kayıt doğru fan b...

Tartışmalar

Böcek beyin KK yada diğer bölgelerde önceki elektrofizyolojik çalışmalar davranışın merkezi kontrol içgörü ile bize vermiş olsa da, çoğu ölçülü hazırlıkları ^9,11 veya bağlı olanlar ^10,14 ya yapılmıştır. Sonuç olarak, hayvan duyusal deneyimi ve fizyolojik durum doğal bir ortamda bu çok farklı olabilir. Bundan başka, hayvan gerçekleştirebilir davranış görevleri olan durumlar altında bir düzlemde sınırlıdır. Burada özgürce davranıyor hamamböceği CC kay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nichrome wire	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	Use for tetrode
Biomedical polyethylene tubing	A-M Systems	800700	Use for tetrode tubing
Lynx-8	Neuralynx		Use for multiunit recording
Cheetah 32	Neuralynx		Use for multiunit recording
High speed camera	Basler	A602f	Use for video recording for walking experiments
High speed camera	Casio	EX-FC150	Use for video recording for climbing experiments
WINanalyze	Winanalyze	version 1.4 3D	Use for video tracking
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	Use for TTL pulse generation and offline data analysis