הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

Summary

הרשתית המכרסם כבר זמן רב מוכרת כחלון נגיש למוח. במאמר זה טכני אנו מספקים פרוטוקול אשר מעסיק את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן כדי ללמוד את המנגנונים שיובילו לכישלון של התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית, לאחר פגיעה איסכמית. המערכת המתוארת גם ניתן לרתום לבחון אסטרטגיות לקידום צמיחה מחודשת של כלי דם פונקציונליים בתוך הרשתית ומערכת העצבים המרכזית.

Abstract

רשתית המכרסמים היא אולי מערכת היונקים הנגיש ביותר בו כדי לחקור את יחסי גומלין עצבים וכלי דם במערכת העצבים המרכזית (CNS). זה יותר ויותר הכיר בכך שכמה מחלות ניווניות כגון אלצהיימר, טרשת נפוצה, ואלמנטי Amyotrophic Lateral Sclerosis הנוכחיים של פשרה כלי דם. בנוסף, הסיבות העיקריות לעיוורון באוכלוסיות גיל ילדים ועבודה (רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית, בהתאמה) מתאפיינות בניוון וכישלון כלי דם של צמיחה מחודשת של כלי דם פיזיולוגית. מטרת מאמר טכני זה היא לספק פרוטוקול מפורט ללמוד התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית ברשתית. השיטה יכולה להיות מועסק על מנת להבהיר את המנגנונים מולקולריים שיובילו לכישלון של צמיחת כלי דם לאחר פגיעת איסכמית. בנוסף, שיטות טיפוליות פוטנציאל להאיץ ולשחזר plexuses כלי דם בריא יכולות להיחקר. ממצאי obtaineד שימוש בגישה שתוארה עשויה לספק אפיקים טיפוליים לRetinopathies איסכמי כמו זו של סוכרת או פגות ואולי ירוויח מחלות כלי דם אחרות של מערכת העצבים המרכזית.

Introduction

לאורך פיתוח של מערכת העצבים המרכזית, עצבים, תאי מערכת החיסון וכלי דם להקים רשתות בשילוב להפליא כדי להבטיח זלוף רקמות נאות ולאפשר העברת מידע החושי ^1-5. הפירוט של תוצאות מערכות כלי דם בחמצון מספיק רקמה ואספקה ​​מטבולים שנפרצו ומוכר יותר ויותר כתורם חשוב בפתוגנזה של מחלות ניווניות ^6. נשירת כלי דם ואת ההידרדרות של יחידת העצבים וכלי הדם בתוך המוח, למשל, קשורה לדמנציה וסקולרית, נגעים של כלי דם של החומר הלבן של המוח ⁷ ומחלת אלצהיימר עם היצרות של כלי דם קטנים וarterioles ^8. בנוסף, הוא חשב תפקוד מחסום כלי דם לקוי לתרום טרשת נפוצה ⁹ וטרשת לרוחב amyotrophic ^10.

של שייכות ישירה למודל הרשתית תואר בפרוטוקול זה, מסנוורמחלות כגון רטינופתיה סוכרתית ¹¹ ורטינופתיה של פגות ^{12, 13} מתאפיינות בשלב של ניוון של כלי דם מוקדם. מתח איסכמי שהתפתח על רשתית העצבים וכלי הדם מפעיל שלב שני של neovascularization מוגזם ופתולוגי, כי סביר להניח שמקורו כתגובה מפצה לחמצן מחדש instate ואספקת אנרגיית ^14-16. אסטרטגיה אטרקטיבית כדי להתגבר על מתח איסכמי שהוא מרכזי להתקדמות מחלה היא להחזיר את רשתות כלי דם פונקציונליות במיוחד באזורים איסכמי של נוירו הרשתית (איורים 2 ו -3). מעורר תגובת angiogenic מבוקר עלולה להתקל כמנוגד לאינטואיציה למצב בו טיפולים אנטי angiogenic כגון אנטי VEGFs נחשבים כטיפולים מותאמים. עם זאת, ראיות לתקפותה של גישה זו גוברת. לדוגמא, שיפור צמיחה מחודשת של כלי דם ", כמו פיזיולוגית" בischemRetinopathies ic הודגמה באלגנטיות באמצעות הקדמה של תאי האנדותל מבשר ^17, עיכוב של downregulation המושרה VEGF-הביע תא Müller של גורמים האחרים angiogenic ^18, הזרקה של אבות מיאלואידית ^19, עיכוב של אפופטוזיס מושרה מונואמין NADPH ^20, הגדלת שומן רב בלתי רווי בתזונה ω-3 צריכת חומצה ^21, טיפול שבבר carboxyl-הטרמינל של synthetase tRNA טריפטופן ^22, וניהול ישיר של VEGF או FGF-2 להגנה על תאי גליה ^23. יתר על כן, אנו מראים כי ויסות אותות הנחיה עצביות קלאסיים כגון Semaphorins או Netrins בRetinopathies איסכמי מאיצה את התחדשות כלי דם של כלי בריאים בתוך הרשתית וכתוצאה מכך מפחיתה את היווצרות כלי דם פתולוגיים ^{24, 25.} הרלוונטיות קלינית ישירה, כמה מהמחקרים בבעלי החיים האמורים לספק ראיות לכך שקידום מחדש של כלי דםדור בשלב המוקדם של איסכמי Retinopathies יכול להפחית באופן משמעותי neovascularization מסכנות ראייה מראש רשתית ^{19, 23, 24, 26,} סביר להניח שבאמצעות הפחתת נטל איסכמי.

גיבוש אסטרטגיות טיפוליות שלעורר התחדשות של כלי פונקציונליים עדיין מהוות אתגר משמעותי עבור ביולוגים של כלי דם. כאן אנו מתארים מערכת ניסיונית אשר מעסיקה את מודל העכבר של מחלת רשתית הנגרמת חמצן (OIR) לחקור אסטרטגיות כדי לווסת את צמיחה מחודשת של כלי דם בתוך הרשתית. שפותח על ידי סמית et al. ב -1994 ^27, מודל זה משמש כמדד לRetinopathies שגשוג אנושי וכולל חשיפה של גורי עכבר P7 75% O ₂ עד P12 ולאחר מכן מחדש מציגים את הגורים לO חדר הסביבה _2-מתח (איור 1). פרדיגמה זו באופן רופף מחקה תרחיש שבו פג מאוורר עם O _2. החשיפה של גורי עכבר לhyperoxia מעוררת התנוונות של נימים ונימי דם ברשתית, ותשואות אזור לשחזור של הרחבת כלי דם, הכחדה (VO) העריך בדרך כלל על יציאה מO ₂ בP12, למרות שהוא הגיע לאזור VO המקסימאלי ב48 שעה (P9) לאחר חשיפה לO ₂ ^28. בעכבר, אזורי VO avascular ספונטני להתחדש במהלך השבוע הבא מחדש מבוא לאוויר חדר וסופו של דבר אזורי VO הם לגמרי מחדש vascularized (איור 2). Re-מבוא לאוויר חדר של עכברים נתון OIR גם מעורר neovascularization מראש הרשתית (NV) (מקסימלי בP17) שהעריך בדרך כלל כדי לקבוע את היעילות של פרדיגמות טיפול אנטי angiogenic. בצורתו הטהורה ביותר, מודל OIR מספק כלי לשחזור וכמותיים מאוד להעריך ניוון של כלי דם נגרם על חמצן ולקבוע את מידת neovascularization מראש רשתית ההרסנית ^29-31.

ss = "jove_content"> פרדיגמות טיפול explorative שונות לווסת התחדשות כלי דם במערכת העצבים המרכזית יכולה להיחקר באמצעות מודל OIR כולל שימוש בחומרים פרמקולוגיים, ריפוי גנטי, מחיקת גן ועוד. הנטייה של גישה שניתנה להשפיע לצמיחה מחודשת של כלי דם נבחנת צעד חכם בחלון בין P12 (VO המקסימאלי לאחר יציאה מhyperoxia) וP17 (NV המקסימאלי). הערכה של תוצאות טיפול בNV פתולוגיים ניתן לקבוע במהירות ובקלות במקביל ותוארה ביסודיות על ידי טל ועמיתיו ^{30, 31 ב.} כאן אנו מספקים הליך של צעד אחר צעד פשוט כדי לחקור את האפנון של revascularization הפיזיולוגי בתוך הרשתית העצבית על ידי תרכובות תרופתית, תרופות פוטנציאליים, וקטורים ויראליים או ללמוד את ההשפעה של גנים מועמדים בעכברים מהונדסים או בנוקאאוט.

Protocol

שמירה על אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים שומרת הנחיות טיפול בבעלי החיים שהוקמו על ידי האגודה לחקר חזון העיניים הצהרה (ארוו) לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים וחזון המחקר והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.

1. רטינופתיה חמצן מושרה (OIR)

1. רשום תאריך לידה של גורי עכבר כP0.
2. להקליט את כל המשקולות של בעלי חיים עם כניסתו לO ₂ כדי להבטיח טווח משקל הולם. הערה: לעכברים C57BL / 6 בP17, משקל גוף צריך לנוע בין 5 ו7.5 גרם לNV המקסימאלי ^32. על מנת לשמור על עקביות סביבתית, מומלץ לשימוש להמלטה כבקרה (לעכברים מהונדסים גנטי, כמו גם עכברים שקבלו טיפולים ניסיוניים). כאשר להערכת השפעות של וקטור ויראלי, יש לקחת בחשבון כמיהות של הנגיף ולאפשר מספיק זמן לביטוי מלא של transgenes נמסר-באופן ויראלי. ויראלי במהירות להביעוקטורים כגון 3 lentiviruses הדור ^{שלישי 24, 25, 33} מומלצים.
3. גורי עכבר המקום בP7 (C57BL / 6 או רצוי זן) וCD1 טיפוח אם לתא חמצן נקבע על 75% O ₂ במשך 5 ימים ^27. לחות וטמפרטורה סביבתיות נערכו קבועים לאורך O ₂ חשיפה. הערה: מתקני מחקר מצוידים במקור של O ₂ מרכזי הם אידיאליים ולהגביל את ההחלפה מסורבלת של O הריק ₂ טנקים. אם עובד עם עכברים מהונדסים או בנוקאאוט, חשוב כדי להבטיח ששליטה ועכברי ניסוי נרכשות מאותו הספק להגביל את הסחף גנטי בתוך אותו ^{30 הזנים, 29.}
4. בP12, להסיר עכברים מתא החמצן ולהחזיר חיות לסביבת O _2.

2. הזרקת זגוגית עבור משלוח של תרכובות לרשתית הפנימית (מה עלי לעשותאפקטי en הערכה של מתחם תרופתי או חלבון רקומביננטי)

1. בP14, להרדים עכברים עם isoflurane 2% ב2 ליטר / דקת חמצן (או הרדמה-אישר ועדת הגנה על בעלי חיים של בחירה). כדי לבדוק את האפקטיביות של ההרדמה, ברצף לצבוט את הזנב, הרגל אחורית ואוזן עם מלקחיים.
2. מניחים את העכבר על הבטן שלה.
3. שימוש סטרילי מצויד משופעת מחט משכה זכוכית מזרק μl 10, לבצע הזרקה של נפח מקסימאלי של 1 μl של תמיסה המכילה התרכובת נחקרת או רכב (תמיסת מלח פיזיולוגית) בימבוס האחורי של העין, עם 45 ° זווית הימנעות העדשה. הערה: זכוכית המחט משכה מחוברת למזרק באמצעות טיפה של אפוקסי שרף.
4. החל ירידה של משחה סיכה עיניים (באופן אידיאלי עם אנטיביוטיקה) עם מקלון לעין של העכבר.
5. להחזיר את העכבר בחזרה לכלוב עם אמא של טיפוח. אז עכברים הם במעקב צמוד עד מחדשמכוסה ואמבולטורי באופן מלא.

3. הערכת זלוף כלי ותפקוד מחסום (Integrity) על ידי והעמסת אנגיוגרפיה

1. הרדימי עכברים עם isoflurane 2% ב2 ליטר / דקת חמצן (או הרדמה-אישר ועדת הגנה על בעלי חיים של בחירה). כדי לבדוק את האפקטיביות של ההרדמה, ברצף לצבוט את הזנב, הרגל אחורית ואוזן עם מלקחיים. הערה: זו מבוצעת בדרך כלל בP17 כאשר ההתחדשות מוערכת. גם לשאת את הניתוח בP19 P21 וכדי לקבוע אם שלמות כלי דם נשמרה לאורך זמן.
2. הרדים פעם, לשקול את העכבר.
3. לעשות חתך בבטן קו האמצע עם מספריים לנתח. הערה: מכשירי ביתור צריכים להיבדק באופן קבוע ומחודדים.
4. חותכים את צלעות רוחבית ולהעלות את בית החזה בעזרת מלקחיים. הערה: יש צורך לחתוך כרוחבי ככל האפשר, כדי למנוע נזק ללב.
5. לאחר הסרת peripרקמת heral מהלב, מהדקת את אב העורקים יורד עם מלקחיים עוצר דמום.
6. לאט לאט להזריק העמסה-dextran לחדר השמאלי באמצעות מחט 25 G. הערה: אם תפקוד מחסום כלי דם הוא נחקר, 70 העמסה-dextran kDa מועסק כפי שהוא ידלוף החוצה מכולים כאשר שלמות כלי היא בסכנה. אם החוקר רוצה להפיל כלי דם, משמש 2 העמסה-dextran מד"א. שלבים קריטיים: 1) כדי להבטיח חלוקה מחודשת הומוגנית, והעמסת-dextran צנטריפוגה ומזריק את supernatant, 2) על מנת למנוע כיווץ כלי, להזריק פתרון והעמסת-dextran מחומם, 3) זמן תפוצתו לא צריך עודף 4 דקות.
7. לערוף עכברים 2 דקות לאחר הזרקה במספריים הפעלה.

4. Enucleation ועיני קיבוע

הערה: בהערכת שיעורים של התחדשות כלי דם, לאסוף רשתיות ראשונה בP12 ובנוסף בP14 וP17. להגדיל את מספר נקודת זמן נדגמוים להגדרה מדויקת יותר של שיעורי revascularization ^24.

1. הטה את ראש העכבר ולמקם אותו על צדו.
2. הסר את העור ועפעפיים מכסים את העין באמצעות מספריים לנתח.
3. הנח מלקחיים מעוקלים מתחת לעין בעדינות למשוך אותו עד לעצב הראייה הוא ניתק.
4. לסובב את ראשו של העכבר על הצד האחר שלה ולבצע את אותם צעדים (שלבים 4.2 ו4.3).
5. כדי להבטיח חדירה טובה יותר של מקבע, לנקב חור בלשכה הקדמית של העין באמצעות מחט 30 G.
6. העבר את העיניים לצינור המכיל paraformaldehyde 4% (PFA) ולתקן במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
7. הסר PFA ולשטוף את עיני 4 פעמים עם פתרון של PBS קר כקרח.

5. Dissection רשתית

1. הנח את עיני עכבר בצלחת פטרי המכילה PBS הקר ולבצע נתיחה של הרשתית תחת סטראו.
2. להסיר את השומן / רקמה נוספת המקיפה את העין עם מדע מיקרו לנתיחהssors.
3. חותכים את הקרנית עם מספריים מיקרו לנתיחה.
4. באמצעות שני זוגות מלקחיים, בדקדקנות לקלף את לובן העין במרחק מהפריפריה לכיוון עצב הראייה וזורק.
5. צבוט את העדשה (כדור לבנבן מתחת לקרנית) עם מלקחיים ולחלץ אותו מכוס העין. השתמש זוג מלקחיים כתמיכה, והשני לאחיזה ולהעלות בזהירות ולהסיר את העדשה.
6. לנתק את כלי hyaloid מהצד הפנימי של הרשתית באמצעות מברשות קטנות (גודל 0) ומלקחיים.
7. הסרת חבילות של כלי hyaloid מחוברים לדיסק האופטי באמצעות מלקחיים.
8. העברה גזור רשתיות ל2 microcentrifuge צינורות מיליליטר המכילים PBS ומניחים על קרח לפני שתתחיל בהליך מכתים.

6. רשתית כלי דם מכתים

1. דגירה רשתית גזור לילה עם עדין רועד ב 4 ° C בתמיסה של fluorescently B4 מצמיד isolectin (rhodamine-לקטינים או אחרים) בPBS המכילים 1 מ"מ CaCl ₂ (1:100 דילול של פתרון B4 2 מ"ג / מיליליטר isolectin מומלץ). במהלך כל ההליך מכתים, לכסות צינורות ברדיד אלומיניום או בנייר כסף אטום כדי להגן מפני אור.
2. ביום שלאחר מכן, להסיר את הפתרון מכתים ולשטוף רשתית 3x ב PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת חדר.

7. הכנת הרשתית Flatmounts

1. העבר את הרשתיות, קולטי אור בצד למטה, לשקופית מיקרוסקופ ולעשות ארבעה חתכים רדיאליים במרחק שווה עמוקים באמצעות אזמל כירורגי כדי לחלק את הרשתית לארבעה רבעים שווים בגודלם. במהלך החתכים, לייצב את הרשתית עם מברשת, כך שהוא לא זז.
2. באמצעות שתי מברשות ספוגות ב-PBS, לרדד בזהירות את קולטי אור בצד למטה רביעים ולטבול את הרשתית בהרכבה בינונית כדי למנוע צילום הלבנה. לאחר מכן למקם בזהירות coverslip על פני השטח של הרשתית רכוב ללא הפעלת לחץ ולוודא כי בועות אוויר לא לצבור תחת להחליק את המכסה.

8. הדמיה וכימות של Vasoobliteration (VO) וneovascularization (NV) כפי שתואר ^{ביום 31} בעבר

1. קח תמונות של רשתית רכוב שלמה עם מיקרוסקופ עלית הקרינה בהגדלה של 10X.
2. פתח את התמונה ברשתית בתוכנה לעריכת תמונות, לתפור ולמדוד את השטח הכולל של הרשתית, ואזור avascular. אזור יכול לבוא לידי ביטוי בפיקסלים.
3. קביעה של VO מידה על ידי חלוקת מספר הפיקסלים באזור avascular ידי מספר הפיקסלים באזור הרשתית בסך הכל.
4. קביעה של NV מידה על ידי חלוקת מספר הפיקסלים של NV במספר פיקסלים באזור הרשתית כולל, כפי שתואר ^{ביום 31.}

תוצאות

מודל OIR נעשה שימוש נרחב ללמוד ניוון של כלי דם נגרם על חמצן וneovascularization פתולוגיים נגרם איסכמיה ברשתית וכבר סייע בפיתוח טיפולים אנטי angiogenic מועסקים כיום למחלות עיניים ^{27, 29, 30.} ממצאים שהתקבלו באמצעות מודל זה ניתן להסיק באופן רופף לRetinopathies איסכמי כגון רטינופתיה סוכרת?...

Discussion

מהי הדרך היעילה ביותר להמרצת צמיחה של כלי חדשים ובריאים ברקמת העצבים איסכמי? האם זה טיפולי תקף להפריע ולהאיץ באופן טבעי לצמיחה מחודשת של כלי דם? בפתולוגיות נוירו איסכמי כגון Retinopathies או שבץ איסכמי, ניוון של כלי דם קשור לתפקוד עצבי מופחת ^35-38. מכאן כדי להתמודד עם פג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945