Beurteilung der Gefäß Regeneration im ZNS Verwenden der Maus Retina

Zusammenfassung

Das Nagetier Retina wurde lange als eine zugängliche Fenster zum Gehirn erkannt. In diesem Fachbeitrag stellen wir ein Protokoll, das die Maus-Modell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie, die Mechanismen, die zum Versagen der vaskulären Regeneration im zentralen Nervensystem nach einem ischämischen Verletzungen führen studieren beschäftigt. Das beschriebene System kann auch genutzt werden, um Strategien zu erkunden, um das Nachwachsen der funktionellen Blutgefäße in der Netzhaut und ZNS zu fördern.

Zusammenfassung

Das Nagetier Retina ist vielleicht die am besten zugänglichen Säugetiersystem in dem Gefäßnervenzusammenspiel innerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) zu untersuchen. Es wird zunehmend erkannt, dass neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer, Multiple Sklerose und amyotrophe Lateralsklerose vorliegenden Elemente Blutungsstörungen. Darüber hinaus sind die prominentesten Ursachen von Blindheit bei Kindern und erwerbsfähigen Alter Populationen (Frühgeborenen-Retinopathie und diabetische Retinopathie, respectively) durch vaskuläre Degeneration und Versagen physiologischer Gefäß Nachwachsen aus. Das Ziel dieser Arbeit ist es, technische ein ausführliches Protokoll zu bieten CNS vaskuläre Regeneration in der Netzhaut zu untersuchen. Das Verfahren kann eingesetzt werden, um die molekularen Mechanismen, die zum Ausfall von Gefäßwachstum nach der ischämischen Schädigung führen aufzuklären. Darüber hinaus können potentielle therapeutische Modalitäten zu beschleunigen und Wiederherstellung gesunder Gefäßgeflechte erkundet werden. Würdigung obtained mit dem beschriebenen Ansatz kann therapeutische Wege für ischämische Retinopathien wie die von Diabetes oder Frühgeburten stellen und möglicherweise profitieren andere vaskuläre Erkrankungen des ZNS.

Einleitung

Während ZNS-Entwicklung, Nerven, Immunzellen und Blutgefäße zu etablieren bemerkens Netzwerke gekoppelt, um eine ausreichende Gewebedurchblutung zu gewährleisten und damit die Übertragung von sensorischen Informationen ^5.1. Die Aufschlüsselung der Gefäßsysteme führt zu einer unzureichenden Sauerstoffversorgung des Gewebes und Stoffwechselversorgung gefährdet und wird zunehmend als wichtiger Faktor für die Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen ⁶ anerkannt. Gefäß Dropout und die Verschlechterung der neurovaskuläre Einheit innerhalb des Gehirns, beispielsweise mit vaskulärer Demenz, vaskuläre Läsionen der weißen Substanz des Gehirns ⁷ und der Alzheimer-Krankheit mit einer Stenose von Arteriolen und kleinen Gefäße ⁸ verbunden. Darüber hinaus beeinträchtigt vaskulären Barrierefunktion gedacht, Multiple Sklerose ⁹ und amyotropher Lateralsklerose ¹⁰ beitragen.

Von unmittelbarer Relevanz für die in diesem Protokoll beschrieben, blendendes NetzhautmodellKrankheiten wie diabetischer Retinopathie und ¹¹ Frühgeborenen-Retinopathie ^{12, 13} sind durch eine Phase der frühen vaskulären Degeneration ist. Die anschließende ischämische Belastung der Gefäß-Nerven-Netzhaut löst eine zweite Phase der übermäßigen und pathologische Gefäßneubildung, die wahrscheinlich stammt als kompensatorische Reaktion auf die wieder einzusetzen Sauerstoff-und Energieversorgung ^14-16. Eine attraktive Strategie, um den ischämischen Stress, der zentrale Fortschreiten der Krankheit ist, zu überwinden, ist funktionelle Gefäßnetze insbesondere in den ischämischen Zonen des Neuronetzhaut (Fig. 2 und 3) wiederherzustellen. Eine kontrollierte Provokation angiogene Reaktion kann über so unlogisch für einen Zustand, in dem anti-angiogenen Therapien wie Anti-VEGF-Behandlungen werden als angepasst betrachtet kommen. Doch Beweise für die Gültigkeit dieses Ansatzes ist die Montage. Zum Beispiel, Verbesserung der "physiologischen-like" Gefäß Nachwachsen in ischemic Retinopathien wurde elegant durch die Einführung von endothelialen Vorläuferzellen ^17, Hemmung der Müller-Zelle exprimiert VEGF induzierte Herunterregulation der anderen angiogenen Faktoren ^18, Injektion von myeloischen Vorläuferzellen ^19, Hemmung der NADPH-Oxidase-induzierte Apoptose ^20, zunehmende Nahrungs ω-3 mehrfach ungesättigten Fettsäuren nachgewiesen Säurezufuhr ^21, die Behandlung mit einer Carboxy-terminale Fragment von Tryptophan tRNA-Synthetase ²² und die direkte Verabreichung von VEGF oder FGF-2 zum Schutz der Gliazellen ^23. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die Modulation der neuronalen klassischen Führungssignale wie Semaphorine oder netrins bei ischämischen Retinopathien beschleunigt vaskuläre Regeneration gesunder Gefäße in der Netzhaut und reduziert pathologische Angiogenese ^{24, 25.} Der direkte klinische Relevanz, mehrere der genannten Tierstudien belegen, dass die Förderung der GefäßwiederGeneration in der frühen Phase der ischämischen Retinopathien deutlich reduzieren kann visusbedrohenden Pre-Netzhaut-Neovaskularisation ^{19, 23, 24, 26,} wahrscheinlich durch die Reduktion von ischämischen Belastung.

Erarbeitung von therapeutischen Strategien, die Regeneration von Gefäßen anregen Funktions bleibt eine große Herausforderung für Gefäßbiologen. Hier beschreiben wir ein experimentelles System, das die Maus-Modell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie (ÖIR), um Strategien zu erkunden, um das Nachwachsen der Gefäß in der Netzhaut zu modulieren beschäftigt. Entwickelt von Smith et al. Im Jahr 1994 ^27, dient dieses Modell als Proxy für den menschlichen proliferative Retinopathie und besteht aus frei P7 Maus Welpen zu 75% O ₂ bis P12 und anschließend wieder die Einführung der Welpen auf Umgebungs Raum O _2-Spannung (Abbildung 1). Dieses Paradigma lose imitiert ein Szenario, wo ein Frühgeborenen ist belüftetmit O _2. Die Belichtung der Maus Welpen Hyperoxie provoziert Degeneration der Netzhaut-Kapillaren und Mikrogefäße und führt zu einem reproduzierbaren Bereich der Vaso-Verödung (VO), die typischerweise beim Austritt aus O ₂ bei P12 beurteilt, obwohl maximal VO Bereich bei 48 h (P9) nach Erreichen Exposition gegenüber O ₂ ^28. In der Maus, die avaskuläre Zonen VO spontan im Laufe der Woche zu regenerieren folgenden Wiedereinführung der Raumluft und schließlich VO Zonen sind komplett neu vaskularisiert (Abbildung 2). Wiedereinführung der Raumluft von Mäusen OIR unterworfen provoziert auch vorge retinale Neovaskularisation (NV) (maximal bei P17), die normalerweise beurteilt wird, um die Wirksamkeit von anti-angiogenen Behandlung Paradigmen bestimmen. In seiner reinsten Form stellt die OIR Modell eine hoch reproduzierbare und quantifizierbare Werkzeug, um Sauerstoff-induzierten vaskulären Degeneration bewerten und bestimmen das Ausmaß der zerstörerischen Pre-Netzhaut-Neovaskularisation ^29-31.

Verschiedene explorative Behandlung Paradigmen, die vaskuläre Regeneration ZNS modulieren kann mit dem Modell OIR einschließlich der Verwendung von pharmakologischen Verbindungen, Gentherapie, Gen-Deletion und mehr untersucht werden. Die Neigung eines bestimmten Ansatz zur Gefäß Nachwachsen beeinflussen bewertet wird schrittweise in das Fenster zwischen P12 (maximal VO nach dem Austritt aus Hyperoxie) und P17 (maximal NV). Auswertung der Behandlungsergebnisse auf pathologische NV kann schnell und einfach ermittelt werden parallel und gründlich von Stahl und Kollegen ^{30, 31} beschrieben. Hier bieten wir Ihnen einen einfachen Schritt-für-Schritt-Verfahren, um die Modulation der physiologischen Revaskularisierung innerhalb der neuronalen Netzhaut durch pharmakologische Verbindungen, prospektive Therapeutika, virale Vektoren zu untersuchen oder um den Einfluss von Kandidatengenen in transgenen oder Knockout-Mäusen zu studieren.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Alle Tierversuche hält die Tierpflege Richtlinien der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research und der kanadischen Rat der Tierpflege etabliert.

1. Sauerstoff induzierte Retinopathie (ÖIR)

1. Rekord Geburtsdatum der Maus Welpen als P0.
2. Notieren Sie alle Gewicht der Tiere bei der Einreise in O _2, um eine ausreichende Gewichtsbereich zu gewährleisten. Hinweis: Bei C57BL / 6 Mäusen bei P17, sollte das Körpergewicht zwischen 5 und 7,5 g für maximal ³² NV reichen. Um die Umwelt Konsistenz zu erhalten, empfiehlt es sich, Geschwistern als Kontrolle (für die genetisch veränderten Mäuse sowie Mäuse, die experimentelle Behandlungen) zu verwenden. Bei der Beurteilung der Auswirkungen eines viralen Vektors, muss man Tropismus des Virus zu berücksichtigen und genügend Zeit für vollen Ausdruck Viren-Transgene geliefert. Schnell ausdrücken VirusVektoren, wie ^{der 3.} Generation Lentiviren ^{24, 25, 33} werden empfohlen.
3. Bewegen Sie die Maus Welpen bei P7 (C57BL / 6 oder gewünschten Stamm) und eine CD1 Förderung Mutter in eine Sauerstoffkammer bei 75% O ₂ für 5 Tage ²⁷ gesetzt. Umwelt Luftfeuchtigkeit und Temperatur wurden während O _2-Exposition konstant gehalten. Hinweis: Forschungseinrichtungen mit einer zentralen Quelle von O ₂ ausgestattet sind ideal und die umständliche Austausch der leeren _A-2-Panzer zu begrenzen. Bei der Arbeit mit transgenen oder Knockout-Mäusen, ist es wichtig, sicherzustellen, dass Kontroll-und Versuchs Mäuse werden von dem selben Anbieter erworben, um genetische Drift innerhalb der gleichen Stämme ^{30, 29} zu begrenzen.
4. Bei P12, entfernen Mäuse aus der Sauerstoffkammer und Rück Tiere zu O ₂ Umgebungs.

2. Intravitreale Injektion für die Lieferung von Verbindungen zum inneren Retina (Whde Beurteilung der Auswirkungen einer Pharmakologische Verbindung oder rekombinantem Protein)

1. Bei P14, betäuben Mäuse mit 2% Isofluran in Sauerstoff 2 l / min (oder Tierschutz-Ausschuss genehmigt Betäubung der Wahl). Um die Wirksamkeit der Anästhesie zu überprüfen, nacheinander den Schwanz kneifen, hinteren Fuß und Ohr mit einer Pinzette.
2. Platzieren Sie die Maus auf seinem Bauch.
3. Verwendung einer sterilen Spritze mit 10 ul einer abgeschrägten zogenen Glasnadel angebracht, führen eine Injektion mit einem maximalen Volumen von 1 &mgr; l der Lösung, die die Verbindung untersucht oder Vehikel (physiologische Kochsalzlösung) an der hinteren Hornhautrand des Auges, mit einem 45 ° Winkel Vermeidung der Linse. Hinweis: Die gezogen Glas-Nadel an der Spritze mit einem Tropfen Epoxidharz befestigt.
4. Geben Sie einen Tropfen Schmiermittel Augensalbe (idealerweise mit Antibiotikum) mit einem Tupfer auf das Auge des Maus.
5. Bringen Sie die Maus wieder in den Käfig mit der Förderung Mutter. Mäuse werden dann sorgfältig überwacht, bis wiederbedeckt und uneingeschränkt gehfähig.

3. Beurteilung der Perfusion und Vessel Barrier Function (Integrität) durch Fluorescein-Angiographie

1. Anesthetize Mäuse mit 2% Isofluran in Sauerstoff 2 l / min (oder Tierschutz-Ausschuss genehmigt Betäubung der Wahl). Um die Wirksamkeit der Anästhesie zu überprüfen, nacheinander den Schwanz kneifen, hinteren Fuß und Ohr mit einer Pinzette. Hinweis: Diese wird typischerweise bei P17 durchgeführt, wenn die Regeneration bewertet. Auch Bring-die Analyse bei P19 und P21 zu bestimmen, ob Gefäßintegrität wird im Laufe der Zeit erhalten.
2. Sobald betäubt, wiegen Sie die Maus.
3. Machen Sie eine Mittellinie Bauch Schnitt mit Dissektionsscheren. Hinweis: sollte Zergliedern Instrumente regelmäßig überprüft und geschärft werden.
4. Schneiden Rippen seitlich und heben Sie den Brustkorb mit Hilfe der Pinzette. Anmerkung: Es ist notwendig, seitlich wie möglich geschnitten, um eine Beschädigung des Herzens zu vermeiden.
5. Nach dem Entfernen peripHeral Gewebe aus dem Herzen, klemmen die absteigende Aorta mit Arterienklemmen.
6. Langsam injizieren Fluorescein-Dextran an den linken Ventrikel mit einem 25 G-Nadel. Hinweis: Wenn vaskulären Barrierefunktion untersucht wird, ist 70 kDa Fluorescein-Dextran eingesetzt, wie es aus der Schiffe auslaufen, wenn Schiff Integrität gefährdet ist. Wenn die Ermittler, die Blutgefäße werfen will, wird 2 MDa Fluorescein-Dextran verwendet. Kritische Schritte: 1) Um eine homogene Verteilung, Zentrifuge Fluorescein-Dextran gewährleisten und spritzen den Überstand, 2) Um die Gefäßverengung zu verhindern, injizieren erwärmt Fluorescein-Dextran-Lösung, 3) Seine Umlaufzeit nicht Über sollte 4 min.
7. Enthaupten Mäuse 2 Minuten nach der Injektion mit Betriebs Schere.

4. Enukleation und Augenfixierung

Anmerkung: Bei der Beurteilung Raten von Gefäßregeneration, erste Netzhaut sammeln sich an P12 und P14 und zusätzlich an P17. Erhöhung der Anzahl der abgetasteten Zeitpunkts zur genaueren Bestimmung der Kurse von ²⁴ Revaskularisation.

1. Neigen Sie den Kopf der Maus und legen Sie es auf die Seite.
2. Haut und Augenlider für das Auge mit Dissektionsscheren entfernen.
3. Zeigen gebogenen Pinzette unter dem Auge und ziehen Sie sie vorsichtig, bis der Sehnerv durchtrennt wird.
4. Drehen Sie den Kopf der Maus auf der anderen Seite, und führen Sie die gleichen Schritte (Schritte 4.2 und 4.3).
5. Um eine bessere Durchdringung des Fixierungs sicherzustellen, Punktion ein Loch in die Vorderkammer des Auges mit 30 G-Nadel.
6. Übertragen Augen in ein Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und fixieren 1 h bei Raumtemperatur.
7. PFA entfernen und waschen Sie die Augen 4-mal mit einer Lösung von eiskaltem PBS.

5. Retinal Dissection

1. Zeigen Maus Augen in einer Petrischale mit kaltem PBS und führen Präparation der Netzhaut unter einem Stereomikroskop.
2. Entfernen Sie die zusätzlichen rund um das Auge mit Mikro-Dissektion sci Fett / Gewebessors.
3. Schneiden Sie die Hornhaut mit Mikro-Dissektion Schere.
4. Mit zwei Paar Zangen, minutiös schälen die Lederhaut weg von der Peripherie zum Sehnerv und entsorgen.
5. Klemmen Sie die Linse (weißlich Ball unter der Hornhaut) mit einer Pinzette und entpacken Sie es aus dem Augenbecher. Verwenden Sie eine Pinzette als Unterstützung, und die andere zu greifen und heben Sie vorsichtig und entfernen Sie die Linse.
6. Lösen Sie die Glaskörpergefäße von der Innenseite der Netzhaut mit kleinen Bürsten (Größe 0) und Pinzette.
7. Bündel von Glaskörpergefäße der Papille mit einer Pinzette entfernen verbunden.
8. Über seziert Netzhaut bis 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS und auf Eis vor dem Start des Färbeverfahren.

6. Retinale Gefäß Färbung

1. Inkubieren seziert Retinae Nacht unter leichtem Schütteln bei 4 ° C in einer Lösung von fluoreszenzkoppelten isolectin B4 (Rhodamin-Lectin oder andere) in PBS, enthaltend 1 mM CaCl ₂ (eine 1:100 Verdünnung einer 2 mg / ml Lösung isolectin B4 wird empfohlen). Während der gesamten Färbeverfahren, decken Rohre mit Aluminiumfolie oder einer lichtundurchlässigen Folie vor Licht zu schützen.
2. Am folgenden Tag, entfernen Farblösung und waschen Netzhaut 3x in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

7. Herstellung von Netzhautflatmounts

1. Übertragen Netzhaut, Photorezeptorseite nach unten, auf einen Objektträger und machen vier tiefe Einschnitte gleich weit radial mit einem chirurgischen Skalpell, um die Netzhaut in vier gleich große Quadranten aufteilen. Während die Einschnitte, die die Netzhaut Klammer mit einer Bürste, so dass er sich nicht bewegt.
2. Mit zwei Bürsten in PBS eingeweicht, sorgfältig glätten die Quadranten Photorezeptorseite-unten und eintauchen in die Netzhaut Montagemedium auf ein Foto, Bleich verhindern. Dann vorsichtig legen Deckglas auf der Oberfläche der Netzhaut befestigt, ohne Druck und dafür sorgen, dass keine Luftblasen unter dem Deckglas zu akkumulieren.

8. Bildgebung und Quantifizierung von Vasoobliteration (VO) und Neovaskularisation (NV), wie zuvor beschrieben ³¹

1. Nehmen Sie Bilder von ganzen montierten Netzhaut mit einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop bei einer Vergrößerung von 10X.
2. Öffnen Sie das Netzhautbild in Bildbearbeitungssoftware, Stich zusammen und messen Sie die Netzhautbereich und avaskulären Bereich. Die Umgebung kann in Pixeln angegeben werden.
3. Bestimmen Ausmaß VO durch Dividieren der Anzahl von Pixeln in der avaskulären Bereich der Anzahl von Pixeln in dem gesamten Netzhautbereich.
4. Bestimmen Ausmaß NV, indem die Anzahl von Pixeln des NV durch die Anzahl von Pixeln in dem gesamten Bereich der Netzhaut, wie beschrieben ^31.

Ergebnisse

Die OIR Modell wird häufig zur Sauerstoff-induzierten vaskulären Degeneration und Ischämie-induzierten pathologischen Gefäßneubildung in der Netzhaut zu studieren und war maßgeblich an der Entwicklung der derzeit eingesetzten anti-angiogenen Therapien für Augenkrankheiten ^{27, 29, 30.} Die Ergebnisse unter Verwendung dieses Modells erhalten wird, kann locker mit ischämischen Netzhauterkrankungen wie die proliferative diabetische Retinopathie und Frühgeborenen-Retinopathie ³⁰ hochgerechnet we...

Diskussion

Was ist der effektivste Weg, um das Wachstum neuer Gefäße gesund zu ischämischen Nervengewebe stimulieren? Ist es therapeutisch gültig zu stören und zu beschleunigen, natürlich vorkommenden Gefäß Nachwachsen? In neuro-ischämischen Erkrankungen wie ischämische Retinopathie oder Schlaganfall, Gefäßdegeneration wird mit reduzierten neuronalen Funktion ^35-38 verbunden. So früh Verletzungen zu begegnen, Wieder regionalen Mikrozirkulation in der unmittelbaren / frühen Segment der Krankheit kann sich a...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 mice (Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other)
CD1 nursing mothers	Vendor of choice
Operating Scissors straight	World Precision Instruments	14192
Dissecting Scissors straight	World Precision Instruments	14393
Vannas Eye Scissors	Harvard Apparatus	72-8483
Iris Forceps, curved, serrated	World Precision Instruments	15915
Brushes 362R size 0	Dynasty
Dumont Forceps #3; straight	World Precision Instruments	500338
Surgical Blade, size 10	Bard-Parker	371110
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Laboratories, Inc	RL-1102
Microscope slides	VWR	16004-368
Fluoromount G	Electron Microscopy Sciences	17984-25
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope	Zeiss
Leica MZ9.5 Stereomicroscope	Leica
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000	Sigma-Aldrich	46945