Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

Summary

סינתזה וייצור של סיבי electrospun ארוכים המשתרעים על שטח גדול יותר הפקדה באמצעות אספן חדש תוכנן מפולימר מתכלה רומן בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) דווחה. הסיבים היו מסוגלים לתמוך בצמיחה של תאים שמקורם בתאי גזע pluripotent עכבר.

Abstract

עבור יישומי הנדסת רקמות, הכנת פיגומים מתכלים ביולוגית היא המשימה הרצויה אך המאתגרת ביותר. בין שיטות ייצור השונות, electrospinning הוא אחד האטרקטיבי ביותר, בשל הפשטות והרבגוניות שלו. בנוסף, nanofibers electrospun לחקות את הגודל של מטריצה ​​תאית הטבעית הבטחת תמיכה נוספת להישרדות תא וצמיחה. מחקר זה הראה את הכדאיות של הייצור של סיבים ארוכים המשתרעים על הפקדת שטח גדול יותר לפולימר מתכלה ביולוגית חדשני בשם פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) ¹ באמצעות אספן חדש תוכנן עבור electrospinning. PGD ​​מפגין תכונות אלסטיות ייחודיות עם תכונות מכאניות דומות לרקמות עצבים, ולכן הוא מתאים ליישומי הנדסת רקמות עצביים. הסינתזה והגדרת ייצור להכנת חומרי פיגומים סיביים הייתה פשוט, לשעתקו מאוד, ולא יקרים. בbiocompatibilityבדיקות, תאים שמקורם בתאי גזע עובריים של עכברים יכולים לדבוק ולגדול על סיבי PGD electrospun. לסיכום, פרוטוקול זה סיפק שיטת ייצור תכליתית להכנת סיבי electrospun PGD כדי לתמוך בצמיחה של תאי שושלת תאי גזע העובריים של עכברים נגזרו עצביים.

Introduction

Electrospinning הוא אחת מהשיטות העיבוד היעילות לייצר פיגומי גודל סיבי מיקרו לננומטר. העיקרון הבסיסי של electrospinning כרוך קונוס טיילור של פתרון שמתקיים בפתח של מחט על ידי הפעלת מתח גבוה בין קצה המחט ואספן מקורקע. כאשר הדחייה אלקטרוסטטית בפתרון מתגברת מתח הפנים, סילון נוזל טעון הוא נפלט אל מחוץ לקצה המחט, עובר דרך האוויר עם אידוי ממס, ולבסוף הופקד על האספן מקורקע. משאבת המזרק מספקת זרימה רציפה של פתרון המתעוררים מspinneret ועותקים ובכך מרובים של סיבי electrospun יכולים להיות מפוברק בתוך תקופה קצרה של זמן. במהלך עוזב spinneret להגיע לאספן, הסילון הטעון יעבור מתיחה ומצליף על פי מספר הפרמטרים הכוללים את מתח הצמיגות ופני שטח של הפתרון פולימריים, electrostatiכוח ג בפתרון, ואת האינטראקציה של השדה החשמלי החיצוני, וכו ^'2.

בתהליך electrospinning, אספן משמש כמצע מוליך שבו יכולים להיות מופקדים סיבי מיקרו לננומטר. במחקר זה, סוג חדש של אספן סיבים נועד להשיג מחצלות סיבים עם הגודל הרצוי (רוחב x אורך). באופן מסורתי, רדיד אלומיניום משמש כאספן אבל קשה להעביר את הסיבים מהמשטח השטוח למצע אחר. הקושי של קצירת מחצלת סיבים ללא פגע מאספן מסורתי היה בעיקר בשל העובדה שסיבי electrospun לצרף מאוד על פני השטח של האספן. לכן, אנחנו שונה האספן על ידי קיפול פיסת נייר אלומיניום לרצועה מלבנית והצמדתו בניצב ללוחית מתכת שטוחה. סיבי electrospun נמתחים על פני השטח שבין הקצה של הרצועה ולוחית המתכת, שניתן להעביר בקלות לsubstrat אחרתדואר.

ריבית בפולימרי אלסטומרי תרמית crosslinked הוא גדל במהירות בגלל עבודתם החלוצית של קבוצתו של רוברט לנגר, שהציג את פולי (sebacate גליצרול) (PGS), פוליאסטר שהוא מקביל לגומי מגופר, ב2002 ^3. דומה לPGS, יש לנו פיתחנו בהצלחה פולי (גליצרול-dodecanoate) (PGD) על ידי עיבוי תרמית של גליצרול וחומצת dodecanedioic והפגינו קניין זיכרון צורה הייחודי שלה ^1. שלא כמו פולי נוקשה חומרים סינטטיים (בוטיראט הידרוקסיל) או פולי (L-lactide) (moduli של יאנג של 250 מגפ"ס ו660 מגפ"ס, בהתאמה), PGD מפגין רכוש אלסטומרי כמו גומי, עם מודול יאנג של 1.08 מגפ"ס כאשר הטמפרטורה היא מעל 37 ° C, שהוא משחק קרוב לעצבים באתר ההיקפיים (0.45 MPA). בנוסף, PGD הוא מתכלה וזמן הפירוק ניתן מכויל על ידי שינוי היחס של גליצרול וחומצת dodecanedioic. חומצת Dodecanedioic היא תת עשר פחמןעמדה עם שתי קבוצות קרבוקסיליות מסוף, HOOC (CH _{2) 10} COOH. חומצות dicarboxylic אפילו ממוספרות כמו חומצת sebacic וחומצת dodecanedioic יכולות להיות מפורקות לאצטיל-CoA והזן את חומצת tricarboxylic (TCA) מחזור / (חומצת לימון). מוצר חילוף החומרים של חומצות dicarboxylic, succinyl-CoA, הוא מבשר וביניים של מחזור ⁴ TCA gluconeogenetic. לפיכך, חלק מהמחקרים הראו כי הם יכולים להיות מנוצלים כמצע אלטרנטיבי דלק לתזונת Enteral וparenteral, במיוחד במצבים פתולוגיים. בנוסף, PGD מפגין זיכרון צורה ייחודית משום שטמפרטורת מעבר זכוכית שלה היא 31 במעלות צלזיוס, ובכך הוא מציג תכונות מכאניות שונות בטמפרטורת חדר ובטמפרטורת גוף. לסיכום, PGD הוא מתכלה, ביולוגית, המציג תכונות אלסטיות ייחודיות עם תכונות מכאניות דומות לרקמות עצבים; ולכן, זה חומר מתאים ליישומי הנדסת רקמת עצב. בפרוטוקול זה, electrospunסיבים ארוכים המשתרעים על שטח מרבץ גדול היו מפוברק באמצעות האספן החדש תוכנן מPGD. פיגומי הסיבים יכולים לתמוך בצמיחה בתאי גזע pluripotent עכבר ובידול.

Protocol

1. התקנת Electrospinning אספן

1. חותכים את רדיד האלומיניום לתוך חתיכה מלבנית.
2. מקפלים את החתיכה מלבנית לרצועה מלבנית, ולצרף אותו בניצב ללוחית מתכת שטוחה עם קלטת (איור 1). הערה: גודלו של שטיח הסיבים תלוי באורך וברוחב הרצועה. כך, ניתן להתאים את ממדי הרצועה לפי צורך.

2. פולימרית פתרון הכנה

1. מערבבים גליצרול וחומצת dodecanedioic (DDA) ב1:1 טוחנת בכוס ב-C ° 120 ל100 שעה להשיג פולימר PGD.
2. ממיסים פולי (אתילן אוקסיד) (PEO) וג'לטין באתנול 65% עם יחס משקל של 1.5:3:95.5 בצינור 15 מיליליטר, להדק את הכובע ולחמם את התערובת בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם ערבוב עד שזה הופך פתרון הומוגני (פתרון בסל).
3. לelectrospinning, לערבב פולימר PGD והפתרון הבסיסי ב04:06 יחס משקל. שים לב: יש ריכוז PGD דוהשפעה גרם בקוטר סיבים. 30% -50% PGD אחוזים מקובל לייצר סיבים ארוכים יותר מ -5 ס"מ עם קוטר סיבים מוגבר.
4. הוספת ריבופלאבין 0.1% לפתרון פולימריים ומערבבים היטב.

3. Electrospinning

1. להאכיל את פתרון פולימרים לתוך מזרק סטנדרטי 5 מיליליטר עם 18 G הקהה מחט פלדה אל חלד.
2. הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק.
3. צרף את ההובלה מקורקעת של מקור כוח במתח גבוה ללוחית המתכת ולהוביל מטען החשמלי החיובי למחט.
4. התאם את המרחק בין המחט ורצועת רדיד האלומיניום ל15 סנטימטר.
5. מקם את משאבת המזרק בזווית של כ -15 ° ביחס לאופק כדי למנוע הצטברות של הסיבים בחלק הקדמי של הרצועה.
6. הפעל את משאבת המזרק ולהתאים את קצב הזרימה של המשאבה ל0.6 מיליליטר / שעה.
7. הפעל את מקור החשמל במתח הגבוה ולהגדיר את מתח ההפעלה ל14.6 KV.

4.עיבוד סיבים

1. לאחר האיסוף יושלם, לחשוף את מחצלת סיבים לאור UV במשך 60 דקות לקישור צולב.
2. העבר את מחצלת הסיבים מרצועת רדיד האלומיניום לצלחת פטרי 100 מ"מ, ותחשוף אותה לאור UV לעוד 20 דקות לעיקור.
3. בארון בטיחות ביולוגי, לחתוך את מחצלת סיבים לחתיכות עגולות באותו הגודל עם להב כירורגים ומניחים את החתיכות לתוך צלחת 24 גם.
4. לטיפול מראש זריעת תאים, לטבול את דגימות סיבים ב 1 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה.
5. ביום שלאחר מכן, לשאוב PBS בזהירות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום התמיינות (DMEM/F12, N2, וFGF2) (ראה מתכון בטבלת חומרים) זה טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
6. בינוני בידול לשאוב בזהירות, להוסיף 0.2 מיליליטר של matrigel לכל דגימת סיבים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. שים לב: גם Laminin יכול לשמש לציפוי סיבים. הוספת 0.2 מיליליטר של 20 laminin מיקרוגרם / מיליליטרלסיבים ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות.
7. מוציא בזהירות matrigel העודף מכל טוב. לשטוף עם 2 מיליליטר של מדיום בידול פעם אחת. שים לב: דגימות הסיבים מוכנות לתרבית תאים.

5. נייד זריעה בסיבים

1. הוסף 1 מיליליטר של Accutase לצלחת תרבית תאי MES ודגירה של 10 דקות ב 37 ° C.
2. לאחר 10 דקות, תאי MES מנותקים ממנת התרבות. הוסף 4 מיליליטר של מדיום בידול לצלחת. לאסוף את תאי MES צף לתוך צינור 15 מיליליטר ותאי פיפטה מעלה ומטה כדי לשבור מושבות (כ 15x).
3. צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות ותאים מחדש להשעות ב4 מיליליטר של מדיום בידול.
4. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. העבר 200 μl של ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ"ל ולדלל אותו 10x עם מדיום בידול. העבר 15 μl של ההשעיה התא המדולל לתא על hemocytometer עם כיסוי להחליק במקום. רוזןהתאים בכיכר מרכז 1 מ"מ וארבעת ריבועי פינת hemocytometer מתחת למיקרוסקופ. הערה: נייד לכל מיליליטר = הספירה לכל מ"ר בממוצע x גורם לדילול x 10 ⁴
5. מקום כ 5 x 10 ⁴ תאי MES על כל טוב. לאט לאט שחרר את ההשעיה התא על אמצע דגימות סיבים, במקום מחליק לצד השני של הבאר, כדי למנוע מפתרון הניקוז מחוץ למזרן הסיבים.
6. הוסף 1 מיליליטר של מדיום בידול היטב כל אחד, ולשמור את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO ₂ כדי לאפשר מצורף תאים, גדילה והתמיינות.
7. לשאוב את המדיום הישן מכל טוב ולהחליף עם 1 מיליליטר של מדיום בידול טרי בכל יום אחר.

6. כדאיויות תא

1. לשאוב את המדיום הישן מכל טוב.
2. מערבבים 1/10 ^ה נפח של מגיב הקרינה Resazurin עם מדיום התרבות ולהוסיף 1 מיליליטר היטב כל אחד.
3. Incubאכלתי ב37 ° C ו 5% CO ₂ למשך 4 שעות, מוגן מפני אור ישיר.
4. לאחר 4 שעות, להעביר 100 μl 3x של המגיב מכל טוב לצלחת 96 היטב, ולאחר מכן הדגימות מוכנות להימדד על ספקטרופוטומטר הקרינה באמצעות הגדרות מסננים 560EX nm/590EM.

7. Real Time PCR

1. לאחר 14 ימים של תרבות, להוסיף למאגר תמוגה לדגימות ולבודד RNA המוחלט מהתאים בדגימות הסיבים.
2. השתמש 4 μl של רנ"א הכל לסנתז cDNA ב20 קשקשי תגובת μl ידי שעתוק לאחור.
3. מכין את תערובת PCR תגובה בכל צינור אופטי: 10 μl מיקס מאסטר (2x), 0.2 צבע μl, 8 המים Nuclease ללא μl, cDNA μl 1, ופריימר μl 1 (צבעי יסוד המשמשים במחקר זה מופיעים בטבלה 1).
4. להגדיר את תכנית ה-PCR: א. דקות 95 C ° 2:20, מחזור ב 1. דקות 95 ° C 3 שניות → 60 ° C 1, 40 מחזור ג. 95 ° C שניות 15, ד המחזור 1. 60 C ° 1דקות, דואר מחזור 1. 95 ° C שניות 15, מחזור 1. בחר את שיטת C _T השוואתית כדי לקבוע את רמות ביטוי הגנים יחסית.
5. לאחר PCR הוא סיים, לנתח את התוצאות בזמן אמת PCR עם תוכנת StepOne ולייצא את התוצאות ל-Excel.

תוצאות

המרכיבים העיקריים של electrospinning מוצגים באיור 1. מחצלת גודל סיבים גדולה הייתה בדרך כלל שהושגה באמצעות הרצועה המצורפת בניצב רדיד האלומיניום ולוחית מתכת שטוחה. איור 2 מציג את עיצוב האספן ומחצלת electrospinning סיבים. הרוחב והאורך יכולים להיות מותאם ליישומים שו?...

Discussion

המגבלות של אספנים פשוטים או המורכבות של מסתובב אספנים שכיום משמשים לelectrospinning להגדיל את המגבלה של קבלת האורך הרצוי וגודל של שטיח סיבים עבור יישומים מסוימים. בנוסף, העברת סיבים מאספן הקרקע למנת התרבות או מצעים אחרים היא אתגר ^5. בדו"ח זה, אספן חדש תוכנן, עשוי בפשט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
Dodecanedioic acid	Sigma-Aldrich	D1009
Gelatin	Sigma-Aldrich	D1890
Poly(ethylene oxide) (PEO)	Sigma-Aldrich	182028
Riboflavin	Sigma-Aldrich	132350250	0.10%
Mouse embryonic stem cells	GlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
N2 supplement	Invitrogen	17502048	1%
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng/ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	10010-031
Resazurin fluorescence dye	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV Total RNA Isolation System	Promega	Z3100
GoScript Reverse Transcription System	Promega	A5000
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001
Syringe pump	Fisher scientific	14-831-200
High voltage power source	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
UV light	Philips	308643	15W/G15T8
Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600	Perkin Elmer	8488
StepOne Real-time PCR System	Applied Biosystems	4376357