Electrospun волокнистых Строительные леса поли (глицерин-dodecanedioate) инженерного нервных тканях От эмбриональных стволовых клеток мыши

Резюме

Сообщалось Синтез и изготовление electrospun длинных волокон, охватывающих большую месторождения через новый дизайн коллектора от нового биоразлагаемого полимера под названием поли (глицерин-додеканоат) (ПГД). Волокна были способны поддерживать рост клеток, полученных из мышиных плюрипотентных стволовых клеток.

Аннотация

Для тканевой инженерии, подготовка биоразлагаемых и биосовместимых лесов является наиболее желательным, но сложной задачей. Среди различных методов изготовления, электропрядения является наиболее привлекательным благодаря своей простоте и универсальности. Кроме того, нановолокна имитировать размер естественной внеклеточного матрикса, обеспечивающего дополнительную поддержку за выживание и рост клеток. Это исследование показало, жизнеспособность изготовления длинных волокон, охватывающих большую депозит область для нового биоразлагаемого и биосовместимого полимера под названием поли (глицерин-додеканоат) (PGD) ¹ с помощью новой конструкции коллектора для электропрядения. PGD ​​демонстрирует уникальные упругие свойства с подобными механическими свойствами в нервной ткани, таким образом, она подходит для нейронных тканевой инженерии. Синтез и изготовление установка для изготовления волокнистых строительных лесов материалов был прост, легко воспроизводимым, и недорого. В биосовместимоститестирование, клетки, полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток может придерживаться и растут на electrospun ПГД волокон. Таким образом, этот протокол предоставляет универсальный способ изготовления для изготовления ПГД electrospun волокна для поддержки роста эмбриональных стволовых клеток мыши, полученных нейронального происхождения клеток.

Введение

Электропрядения является одним из эффективных методов обработки для получения микро-к-нанометра каркасов размер волокна. Основной принцип электроформования включает в себя Taylor конус раствором, который проходит в отверстие иглы с применением высокого напряжения между кончиком иглы и заземленной коллектора. Когда электростатическое отталкивание в растворе преодолевает поверхностное натяжение, заряженная струи жидкости выбрасывается из кончика иглы, проходит через воздух с испарения растворителя, и, наконец, осажденный на заземленной коллектора. Шприцевой насос обеспечивает непрерывный поток выходящего из фильеры растворе и, таким образом, несколько копий electrospun волокон может быть изготовлен в течение короткого периода времени. В ходе выходе из фильеры прибыть на коллекторе, взимается струя будет пройти растяжения и битья по ряду параметров, которые включают вязкости и поверхностного натяжения полимерного раствора, в electrostatiс силой в решении, и взаимодействие внешнего электрического поля, и т.д. ^2.

В процессе электропрядения, коллекционер служит подложкой, где микро-до-нм волокна могут быть депонированы. В этом исследовании, новый тип волокна коллектора был разработан для получения волокнистых матов с нужного размера (длина х ширина). Традиционно, алюминиевая фольга используется в качестве коллектора но трудно передать волокна от плоской поверхности на другую подложку. Трудность сбора нетронутыми фибролит от традиционного коллектора в основном за счет того, что electrospun волокна придают сильно к поверхности коллектора. Таким образом, мы модифицированный коллектор путем складывания кусок алюминиевой фольги в прямоугольной полосе и присоединение его перпендикулярно плоской металлической пластины. В electrospun волокна растягиваются по всей области между концом полосы и металлической пластиной, которые могут быть легко переданы другой Substratэ.

Интерес к термически сшитых эластомерных полимеров стремительно растет из-за новаторской работе группы Роберта Лангера, который представил поли (глицерин себацат) (PGS), полиэстера, который является аналогом вулканизированной резины в 2002 году ^3. Подобно PGS, мы успешно разработали поли (глицерин-додеканоат) (ПГД) по термической конденсации глицерина и додекандикарбоновой кислоты и продемонстрировала свою уникальным свойством памяти формы ^1. В отличие от жесткой синтетических материалов поли (гидроксил бутирата) или поли (L-лактида) (модули Юнга 250 МПа и 660 МПа, соответственно), ПГД проявляет эластомерного недвижимость как резина, с модулем Юнга 1,08 МПа, когда температура выше 37 ° С, что является близким матч на на месте периферического нерва (0,45 МПа). Кроме того, ПГД является биологически и время деградация может быть доработаны путем изменения соотношения глицерина и додекандикарбоновой кислоты. Додекандикарбоновой кислота является двенадцатилетний углерода субпозиция с двумя концевыми карбоксильными группами, HOOC (CH _{2) 10} COOH. Четные дикарбоновые кислоты, такие как себациновая кислота и додекандикарбоновой кислоты может быть метаболизируется до ацетил-КоА и введите трикарбоновых кислот (ТСА) / (лимонная кислота) цикла. Метаболический продукт из дикарбоновых кислот, сукцинил-КоА, является предшественником gluconeogenetic и промежуточное соединение TCA цикле ^4. Таким образом, некоторые исследования показали, что они могут быть использованы в качестве альтернативного субстрата топлива для энтерального и парентерального питания, особенно в патологических состояниях. Кроме того, PGD обладает уникальной памятью формы, так как его температура стеклования 31 ° C, при этом он показывает различные механические свойства при комнатной температуре и при температуре тела. В целом, ПГД является биологически, биосовместимых, демонстрируя уникальные упругие свойства с механическими свойствами, аналогичными нервных тканей; следовательно, является подходящим материалом для нервной ткани машиностроении. В этом протоколе, electrospunдлинные волокна, охватывающие большую площадь для хранения были изготовлены с помощью новой конструкции коллектора от ПГД. В леса волокна могут поддержать рост мыши плюрипотентных стволовых клеток и дифференцировки.

протокол

1. Настройка Электропрядения коллектор

1. Разрежьте алюминиевую фольгу в прямоугольный кусок.
2. Сложите прямоугольный кусок в прямоугольную полосу, и приложите его перпендикулярно плоской металлической пластины с лентой (рис. 1). Примечание: Размер волокнистого мата зависит от длины и ширины полосы. Таким образом, размеры полосы можно регулировать по мере необходимости.

2. Полимерные Подготовка решения

1. Смешайте глицерин и додекандикарбоновую кислоту (ДВР) в молярном соотношении 1:1 в химическом стакане при температуре 120 ° С в течение 100 ч, чтобы получить PGD полимера.
2. Растворить поли (этиленоксид) (ПЭО) и желатин в 65%-ном этаноле с весовом соотношении 1.5:3:95.5 в 15 мл пробирку, затянуть крышку и нагревают смесь в печи при 60 ° С в течение 1 часа при перемешивании пока она не станет однородной решение (базальной раствор).
3. Для электропрядения, смешать PGD полимер и базальную решение в 4:06 весовом соотношении. Примечание: ПГД концентрация имеет биг эффект от диаметра волокна. 30% -50% процентов PGD является приемлемым для производства волокон более 5 см с увеличением диаметра волокна.
4. Добавить 0,1% рибофлавин, чтобы полимерного раствора и хорошо перемешать.

3. Электропрядения

1. Поток полимерного раствора в 5 мл стандартного шприца с 18 G притупляются иглы из нержавеющей стали.
2. Вставьте шприц в шприцевой насос.
3. Прикрепите заземленный провод источника питания высокого напряжения на металлическую пластину и положительно заряженной приводят к игле.
4. Отрегулируйте расстояние между иглой и фольги полосы алюминия до 15 см.
5. Поместите шприцевой насос под углом около 15 ° к горизонтальной для предотвращения агрегации волокон в передней части полосы.
6. Включите шприцевой насос и регулировать расход насоса до 0,6 мл / час.
7. Включите источник питания высокого напряжения и установить рабочее напряжение до 14,6 кВ.

4.Волоконно Обработка

1. После сбора завершена, подвергать фибролит к ультрафиолетовому излучению в течение 60 мин для сшивания.
2. Передача волокнистый мат из фольги алюминиевой полосы в 100 мм чашки Петри, и подвергать его воздействию ультрафиолетового света течение еще 20 мин для стерилизации.
3. В кабинете биологической безопасности, разрезать волокнистый мат в круглые куски такого же размера с хирургическим скальпелем и поместить части в 24-луночный планшет.
4. Для клеточной терапии предварительно посева, погрузить образцы волокон в 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) и инкубировали при 37 ° С в течение ночи.
5. На следующий день, аспирации PBS тщательно, добавить 1 мл дифференциации среды (DMEM/F12, N2, и FGF2) (см. рецепт в материалах таблице) в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 3 часов.
6. Аспирируйте дифференциация среднего осторожно, добавьте 0,2 мл Матригель к каждому образцу волокна и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Примечание: Laminin также могут быть использованы для покрытия волокна. Добавить 0,2 мл 20 мкг / мл ламининна волокно и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 часов.
7. Осторожно снимите излишки Матригель из каждой лунки. Промойте 2 мл дифференциации среды один раз. Примечание: Образцы волокна готовы к клеточной культуре.

5. Сотовый Посев на волокна

1. Добавьте 1 мл Accutase к клеточной блюдо культуры MES и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С
2. Через 10 мин МОН клетки отделяют от культуры блюдо. Добавить 4 мл дифференциации среды к пластине. Соберите плавающие ЭСК в 15 мл трубки и пипетки клеток вверх и вниз, чтобы сломать колонии (около 15x).
3. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин и повторно приостанавливать клеток в 4 мл среды дифференцировки.
4. Граф клеток с помощью гемоцитометра. Передача 200 мкл клеточной суспензии в 15 мл пробирку и разбавить его с 10x дифференцировки среды. Трансфер 15 мкл разбавленного клеточной суспензии в камеру на гемоцитометре с покровным стеклом на месте. Считатьклетки в 1 мм площади центра и четырех угловых квадратов гемоцитометре под микроскопом. Примечание: Сотовый на мл = среднее значение в квадрате х на коэффициент разбавления х 10 ⁴
5. Поместите примерно 5 х 10 ⁴ ЭСК в каждую лунку. Медленно падение клеточной суспензии на середине образцов волокна, а скольжение в сторону скважины, чтобы предотвратить решение от спуске Волокнистый мат.
6. Добавить 1 мл дифференцировки среды в каждую лунку, и планшет держать в инкубаторе при 37 ° С и 5% СО _2, чтобы позволить прикрепления клеток, рост и дифференциацию.
7. Аспирируйте старый субстрат из каждой лунки и заменить 1 мл свежего дифференциации среды через день.

6. Жизнеспособность клеток

1. Аспирируйте старую среду из каждой лунки.
2. Смешайте ^1/10 объема резазурин флуоресценции реагента с культуральной среды и добавляют 1 мл в каждую лунку.
3. Incubели в 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 4 часов, защищенном от прямых солнечных лучей.
4. Через 4 часа, передача 3 раза 100 мкл реагента из каждой лунки в 96-луночный планшет, а затем образцы готовы быть измерена на флуоресцентном спектрофотометре с использованием параметров 560EX nm/590EM фильтра.

7. Настоящее ПЦР Время

1. Через 14 дней культивирования добавить лизирующего буфера для образцов и изолировать общей РНК из клеток на образцах волокна.
2. Использование 4 мкл тотальной РНК, чтобы синтезировать кДНК в 20 мкл реакционной масштабах путем обратной транскрипции.
3. Подготовка реакционной смеси ПЦР в каждой оптической трубы: 10 мкл Master Mix (2x), 0,2 мкл красителя, 8 мкл нуклеазы без воды, 1 мкл кДНК, и 1 мкл праймера (праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1).
4. Установите программу ПЦР: а. 95 ° C 2:20 мин, 1 цикл б. 95 ° C 3 сек → 60 ° C 1 мин, 40 цикл с. 95 ° С 15 сек, 1 цикл г. 60 ° C 1мин, 1 цикл э. 95 ° С 15 сек, 1 цикл. Выберите сравнительный метод C _T для определения уровней экспрессии относительно генов.
5. После ПЦР закончена, анализировать в режиме реального времени результаты ПЦР с StepOne программного обеспечения и экспортировать результаты в Excel.

Результаты

Основными компонентами электроформования показаны на рисунке 1. Большой размер коврик волокна обычно получают путем перпендикулярно прикрепленной полосы алюминиевой фольги и плоской металлической пластины. Рисунок 2 показывает конструкцию коллектора и мат электр?...

Обсуждение

Ограничения простых коллекционеров или сложностей вращающихся коллекционеров, которые в настоящее время используются для электропрядения увеличить ограничение получения желаемой длины и размер мата для некоторых приложений. Кроме того, передача волокна из основного коллектора к ч?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7757
Dodecanedioic acid	Sigma-Aldrich	D1009
Gelatin	Sigma-Aldrich	D1890
Poly(ethylene oxide) (PEO)	Sigma-Aldrich	182028
Riboflavin	Sigma-Aldrich	132350250	0.10%
Mouse embryonic stem cells	GlobalStem	GSC-5002
Matrigel	Becton Dickinson	356234
DMEM/F12	Thermo Scientific	SH30272.02
N2 supplement	Invitrogen	17502048	1%
FGF2	Stemgent	03-0002	10 ng/ml
Accutase	Invitrogen	A11105-01
Phosphate buffered saline (PBS)	Invitrogen	10010-031
Resazurin fluorescence dye	Sigma-Aldrich	62758-13-8
SV Total RNA Isolation System	Promega	Z3100
GoScript Reverse Transcription System	Promega	A5000
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6001
Syringe pump	Fisher scientific	14-831-200
High voltage power source	Spellman High Voltage Electronics Corporation		SL30
UV light	Philips	308643	15W/G15T8
Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader	BioTek
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600	Perkin Elmer	8488
StepOne Real-time PCR System	Applied Biosystems	4376357