שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Summary

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Abstract

Trypanosoma brucei הוא טפיל kinetoplastid שגורם trypanosomiasis אדם אפריקאי (HAT), או מחלת שינה, ומחלה ממארת, nagana, בבקר ^1. חלופות הטפיל בין זרם הדם של המארח של היונקים ווקטור זבוב tsetse. הרכב רב אברונים תאיים משתנה בתגובה לתנאים תאיים השונים אלה ^2-5.

Glycosomes הוא peroxisomes מאוד מיוחד שבו רב של האנזימים המעורבים בגליקוליזה הם ממודרים. Glycosome שינויי הרכב באופן התפתחותי ומוסדר לסביבה ^4-11. נכון לעכשיו, את הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש ללמוד glycosome דינמיקה הן מיקרוסקופ אלקטרונים וקרינה; טכניקות שאינן יקר, זמן והעבודה אינטנסיבית, ולא בקלות הסתגל לתפוקה גבוהה מנתח.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, מערכת כתב ניאון-glycosome בשהגדל חלבון צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף peroxisome מיקוד (PTS2), המכוון את חלבון ההיתוך לglycosomes ^12, כבר נקבע. על היבוא של חלבון היתוך PTS2eYFP, glycosomes הפך ניאון. השפלה אברון ותוצאות מחזור בהפסד של הקרינה שניתן למדוד על ידי cytometry זרימה. מספר גדול של תאים (5,000 תאים / sec) ניתן לנתח בזמן אמת ללא הכנת מדגם נרחבת כגון קיבעון והרכבה. שיטה זו מציעה דרך מהירה לזיהוי שינויים בהרכב אברון בתגובה לתנודות בתנאים סביבתיים.

Introduction

Trypanosoma brucei גורם מחלה אפריקה שינה בבני אדם ומחלה ממארת, nagana, בבקר. תרופות המשמשות לטיפול במחלות אלה הן מיושנות ורעילים ביותר, חיסונים אינם זמינים, ואת הפוטנציאל לפיתוח עמידות לתרופה מחייב חיפוש אחר מטרות תרופה חדשות ^1.

במהלך מחזור החיים שלה, ט brucei, מתחלף בין וקטור חרקים ומארח של יונקים; שני צבאות המציגים סביבות שונות מאוד שבו הטפיל חייב לשרוד. מספר השינויים מטבוליים ומורפולוגיים להתרחש כטפיל חשוף לתנאים סביבתיים שונים. חלק מהשינויים הדרמטיים ביותר שנצפו בmicrobodies הספציפי טפיל חד-מתוחם קרום, מכונה glycosomes ^13.

רמות הגלוקוז גבוהות יחסית (~ 5 מ"מ) בזרם הדם וטפילי דם (BSF) לייצר ATP באופן בלעדי דרך ש"ש גליקוליזהחילוף חומרים במיטוכונדריה ile מודחק ^14. בניגוד לאאוקריוטים אחרים בי הגליקוליזה מתרחשת בציטופלסמה, ט brucei ממדר את רוב אנזימי glycolytic בglycosomes ^14,15. הטפילים נתפסים על ידי זבוב tsetse במהלך bloodmeal וחווים ירידה ברמת סוכר, שנופלת לרמות בלתי ניתנות לגילוי בתוך 15 דקות מנטילה על ידי הזבוב. חילוף החומרים של חרק, צורת procyclic (PCF), טפילים הוא גמישה יותר וגלוקוז, וכן חומצות אמינו כגון פרולין, ניתן להשתמש בסינתזה של ATP ^16-18. מחקרי proteomic השוואתיים לגלות שינויי מחזור חיים תלויים בglycosomal וחלבוני המיטוכונדריה עם חלבוני glycolytic גדלו בטפילי דם וחלבוני המיטוכונדריה מעורבים במחזור TCA ושרשרת הנשימה ^13,19. בעוד שמחקרים רבים התמקדו בהבדלים בין BSF וglycosomes PCF, מעט מאוד ידוע על השינויים בglycosomes PCF המתרחשים בתגובה לenvשינויי ironmental.

במעי האחורי של הזבוב, רמות הגלוקוז נמוכות עם עליות חולפות במהלך האכלה ^20. ברוב בניסויים במבחנה, טפילי PCF גדלים בתקשורת המכילה גלוקוז. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שינויי חילוף חומרים PCF באופן משמעותי בתגובה לגלוקוז זמינות ^17. בהעדר של גלוקוז, ספיגת פרולין וגידול פעילות dehydrogenase פרולין ^18. שינוי בחילוף החומרים במיטוכונדריה זה סביר מלווה בשינוי בהרכב glycosome ומורפולוגיה, עם זאת, זה לא העריך באופן ישיר.

אלקטרונים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הם טכניקות נפוצות בשימוש ללמוד דינמיקת glycosome בט brucei ^2,21-24. פרוטוקולים אלה הם זמן ועבודה אינטנסיבית, יקרה, וקשה להסתגל ללימודים בזמן אמת ופרוטוקולי תפוקה גבוהה. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכת כתב ניאון-אברון uSED ללמוד האברונים במערכות יונקים ושמרים כבר שונה לשימוש בט brucei ^12.

מערכות כתב הניאון-אברון נעשו שימוש נרחב באאוקריוטים גבוהים יותר כמו שמרים, צמח, ותאי יונקים ^25-27. במערכות כאלה, חלבון פלואורסצנטי הוא התמזגו לרצף חומצות אמינו שמכוון את החלבון לאברונים ספציפיים. השפלה או הסינתזה של החלבונים הממוקדים נמדדה באמצעות הקרינה ושינויים בהרכב אברון באים לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולארי.

כאשר מסגרת הקריאה הפתוחה של חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף מיקוד peroxisomal הסוג II (PTS2) ^12, חלבון PTS2eYFP מיובא לglycosomes בוגר, יבוא ומוסמך וקרינה יכולה להיות במעקב באמצעות cytometry זרימה. וריאציות בglycosome הרכב באות לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולרית. מערכת זו יכולה לסייע בResolוינג המנגנונים המווסתים את השינויים הנגרמים לסביבה בglycosome הרכב.

כתב יד זה מתאר את הדור של מערכת כתב glycosome בטפילי PCF בשיתוף עם cytometry הזרימה לעקוב אחר דינמיקת glycosome בזמן אמת בטפילים בשידור חיים ומספק דוגמא לאופן שנעשה בו שימוש כדי לעקוב אחר שינויים בglycosome הרכב בתגובה לסביבות שונות. לסיכום, glycosome הרכב מושפע מריכוזי גלוקוז תאיים והמעבר של תרבויות log-שלב לתקשורת טרי מעוררת שינויים בglycosome הרכב. מערכת זו יכולה להיות שונה כדי ללמוד את ההתנהגות הדינמית של אברונים אחרים בtrypanosomes וטפילים אחרים.

Protocol

.1 כללי Trypanosome בעלי

1. שוקל מוצקים להכנת SDM79 תקשורת (טבלה 1).
2. חנות ב 4 ° C. ב50 חרוטי מ"ל או שקית ניילון אטומה. הערה: ריאגנטים יציבים במשך לפחות 6 חודשים.
3. סרום הפשרת שור עוברי (FBS) בwaterbath 37 מעלות צלזיוס, ומערבבים מעת לעת על ידי היפוך. הערה: FBS מתקבל מהספק כפתרון סטרילי. מסנן עיקור FBS מפחית את יכולתה לתמוך בצמיחה טפילה.
4. ברגע שכל הבקבוק מופשר, חום להשבית סרום ל30 דקות בwaterbath C 56 מעלות, ערבוב מעת לעת כדי למזער משקעים של רכיבים בסרום.
5. פניצילין הפשרה / פתרון סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), hemin (2 מ"ג / מ"ל ​​ב50 מ"מ NaOH), ופתרון ויטמין נשר בינוני בסיסי בטמפרטורת חדר.
6. ל1,000 מ"ל סיים גליל, להוסיף 20.2 גרם של מוצקי SDM79 (טבלה 1) לרכיבים נוזליים (טבלה 2) ומערבבים היטב על צלחת ומערבבים.
7. כדי להתאים את pH 7.35, ולהביא נפח ל850 מ"ל עם מים.
8. סנן לעקר תקשורת על ידי הצמדת צינור ואקום לחלק התחתון של בקבוק מסנן. החל ואקום עד הפתרון מסונן.
9. הסר עליון מסנן בקבינט הבטיחות הביולוגי ולהוסיף 150 מ"ל של החום מומת FBS. מסיר את מכסה פלסטיק מכובע סטרילי ובקבוק תקשורת חותם.
10. הכן תקשורת SDM80 באותו אופן כמו SDM79 עם החריגים הבאים; לא להוסיף סוכר באו גלוקוזאמין ולהשתמש MEM ללא גלוטמין. במקום של 150 מ"ל של החום מומת FBS, להוסיף 135 מ"ל של דיאליזה, חום מומת FBS, ו15 מ"ל של חום מומת FBS.
11. טפילי PCF תרבות ב25 סנטימטר בקבוק ² עם מדיום מתאים 10 מ"ל ב27 ° C ו 5% CO _2. הערה: תאים צריכים להיות נספרים מדי יום באמצעות hemocytometer או cytometer זרימה (ראה סעיף 6) ויש לשמור תרבויות בצפיפויות בין 1 x 10 ⁵ ו 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.

2 Transfection של טפילי PCF עם Construct כתב הניאון

הערה: כדי לעקוב glycosome דינמיקה, חלבון כתב המכיל את רצף peroxisomal המיקוד (PTS2) של aldolase התמזג חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר בא לידי ביטוי בטפילים. הרצף מקודד את חלבון ההיתוך משובט לתוך ¹² pXS2bla, המכיל את אמרגן procyclin ואזורים חוץ-טובולין, שרקומבינציה ישירה הומולוגית לתוך הגנום וגן התנגדות blasticidin לבחירה. שורות תאי Procyclic מחסה הגנים המקודדים המדכא פולימראז וטטרציקלין T7 (PF29-13) הופכות עם מבנה המיקוד, pXS2: PTS2eYFP.

1. הכן cytomix ידי ערבוב הרכיבים המפורטים בטבלה 3. סנן לעקר ולאחסן ב RT.
2. Linearize פלסמיד דנ"א עם MluI ידי pipetting 10 μl של DNA (1 מיקרוגרם / μl), חיץ אנזים הגבלה 5 μl, מים 33 μl, ו2 μ; L של אנזים MluI לתוך צינור microcentrifuge. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
3. לטהר את ההגבלה לעכל על ידי הוספת נפח של 1 חיץ מחייב לאנזים ההגבלה לעכל. מערבבים חיץ מחייב וDNA מתעכל על ידי vortexing. בקצרה צנטריפוגות לאסוף הדגימה בחלק התחתון של הצינור.
4. הכנס DNA מחייב עמודה לתוך צינור איסוף 2 מ"ל, והעברה מתעכל DNA / מחייבת פתרון חיץ לעמודה.
5. צנטריפוגה ל10,000 XG דקות 1. לאחר צנטריפוגה, להשליך תסנין מצינור איסוף ולהחזיר את הטור לצינור האיסוף.
6. הוסף 700 μl של חיץ לשטוף SPW ו צנטריפוגות ב XG 10,000 דקות 1.
7. תסנין בטל מצינור איסוף, להחזיר את הטור לצינור האיסוף וחזור SPW שלב לשטוף וצנטריפוגה.
8. תסנין בטל, טור חזרה לצינור איסוף, ו צנטריפוגות העמודה הריקה במשך 3 דקות ב 10,000 XG כדי להסיר אתנול השיורי.
9. בארון בטיחות ביולוגי, לזרוק colצינור lection ועמודה מקום בצינור microcentrifuge סטרילי.
10. לelute DNA, להוסיף 25 μl של מים סטריליים לעמודה ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב 10,000 XG דקות 1.
11. הוסף עוד 25 μl של מים סטריליים במכסת מנוע בטיחות ביולוגית לעמודה ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 2 דקות.
12. צנטריפוגה ב 10,000 מהירות XG דקות 1.
13. בקבינט בטיחות ביולוגי להעביר נפח שלם של DNA לצינור microcentrifuge סטרילי חדש. הערה: פעולה זו מונעת זיהום מהמכסה הפתוחה במהלך צנטריפוגה.
14. הוסף את DNA סטרילי, המטוהר, היא לינארית (10 מיקרוגרם) ל400 μl של cytomix פילטר מעוקר.
15. ספירת תאים כאמור בסעיף 6 ולקצור 5 ⁷ -10 ⁸ תאים x10 על ידי צנטריפוגה ב800 XG במשך 15 דקות ב RT.
16. יוצקים את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 450 μl של DNA + cytomix באמצעות פיפטה סרולוגית 1 מ"ל.
17. העברת תמיסה המכילה ce LLS, DNA, וcytomix לקובט קובט הפער והמקום סטרילי 4 מ"מ בתא electroporation.
18. בחר "דעיכה מעריכית" ולהזין באופן ידני את ההגדרות הבאות: מתח: 1.5 ק, קיבוליות: 25 MF, התנגדות: Ω, וקובט: 4 מ"מ. דופק לחץ. ברגע שהדופק הוא מלא, להסיר את קובט מתא electroporation ולחזור לארון הבטיחות הביולוגי.
19. לתוך בקבוק סטרילי חדש, פיפטה 10 מ"ל של SDM79. להעביר את התאים הפכו לבקבוק עם 10 מ"ל של SDM79.
20. דגירה ללא בחירת תרופה ל24 שעות ב27 ° C, 5% CO _2. לאחר 24 שעות, להוסיף G418 (15 מיקרוגרם / מ"ל), hygromycin (50 מיקרוגרם / מ"ל), וblasticidin (10 מיקרוגרם / מ"ל). Pass 1 מ"ל של תאים הפכו עם תרופה ל9 מ"ל של SDM79 עם סמים.
21. לנתח תאים יומיים כמפורט בסעיפים 6 ו -7 כאשר תאי ניאון, והגיע לצפיפות תאים של 1 x 10 ⁷ / מ"ל, להפוך stabilates לאחסון לטווח ארוך (3.1-3.3).

ve_title "> 3. ביצוע Stabilates

1. כדי להפוך הקפאת תקשורת, מוסיף נפח שווה של גליצרול 100% לcytomix ומסנן לעקר.
2. הוסף 200 μl של תקשורת הקפאה ל800 μl של תאים (1 x 10 ⁷⁾ בcryovial, מערבב בעדינות על ידי היפוך ומקום בין שני מדפי קלקר ולהקפיא ב -80 מעלות צלזיוס.
3. ברגע קפוא (~ שעה 24), תאי העברה לחנקן נוזלי. הערה: חשוב לעבור תאים לתוך LN ₂ לאחר 24 שעות, כאחסון ארוך יותר ב -80 ° C גורם לירידה בכדאיויות תא.

.4 מניות הפשרה קפואה

1. הסר בקבוקון קפוא מ-80 ° C והפשרה על RT כ 10 דקות.
2. 9 מ"ל פיפטה של ​​SDM79 עם סמים לתוך בקבוק סטרילי חדש. הוספת תאים מופשרים לבקבוק הזה. עובר תאים 01:10 על ידי הוספת 1 ​​מ"ל של תרבות זו עד 9 מ"ל של SDM79 בבקבוק חדש (ריכוז סופי של 1 x 10 ⁵ / מ"ל).
3. לפני התאים להגיע לצפיפות של 10 ⁷ / מ"ל, להתחיל להגדיר cytometerומבחני דילול.

.5 הגדרת Cytometer

1. הפעל את הזרימה cytometer ולפתוח תכנית CFlow פלוס. הערה: לפני הפעלת כל דגימות, יש backflushed fluidics ושטף על פי צעדים 5.2-5.7.
2. החלף את הצינור של המים nanopure בי הלגימה מאוחסנת עם צינור ריק.
3. בחר בלחצן "backflush".
4. ברגע שbackflush הוא מלא, להסיר צינור microcentrifuge מלגימה וזורק.
5. הנח צינור microcentrifuge חדש המכיל 1 מ"ל של המים nanopure חדשים בלגימה.
6. בחר גם חדש בתכנית CFlow. תחת "מגבלות הפעלה" להגדיר זמן למשך 2 דקות. תחת "fluidics" בחר באפשרות "מהיר" ועל "הפעל".
7. ברגע שמגבלת הזמן 2 דק 'היא מלאה, לחץ על לחצן "מחיקת נתונים לדוגמא".

.6 ספירת תאים באמצעות Cytometer הזרימה

1. להחליף מים עם את המדגם כדי לספור. הגדר "גבולות לרוץ "ל30 שניות," fluidics "ל" מהיר "ולאחר מכן בחרו באפשרות" הפעלה ".
2. לאחר מגבלת זמן 30 שניות היא מלאה, CFlow בתוספת תספק את האירועים / μl תחת "הפעלה האחרונה." ספירה חוזרת לכל תרבות ותרבות. הערה: לפני תאים להגיע 1 x 10 ⁷ תאים / מ"ל, להמשיך עם assay דילול. יש להפסיק את התאים לאחר assay דילול אחד הושלם. תאים בתרבית לתקופות ארוכות יותר לאבד את היכולת שלהם להגיב לתנאי סביבה.

.7 הקרינה מדידה באמצעות Cytometer הזרימה

1. כדי להעריך הקרינה, להגדיר "גבולות הפעלה" ל10,000 אירועים, ו" fluidics "ל" איטי". בחר באפשרות "סף הגדר". תחת "סף ראשוני", בחר "לצמיתות לחסל אירועים ב"," FSC-H "(בתיבה נפתחת) והזן פחות מ 30,000. לחץ על "החל", ואז "קרוב".
2. בחר220; "כפתור באחד חלונות העלילה החדשים ובחר באפשרות" היסטוגרמה FSC-"מרשימה הנפתחת, בחר" FL1-". הערה: הקרינה אמצעי FL1-באורך גל 530 ננומטר.
3. בחר "הפעלה" וחזור על פעולה עבור כל התרבויות.
4. הפעל ניקוי פתרון דרך קו fluidics למשך 2 דקות ומים למשך 2 דקות.

.8 מבחני דילול

1. עובר תאים לצפיפות של 1 x 10 ⁵ תאים / מ"ל ב 3 מ"ל של SDM79 בבקבוק ² תרבות 25 סנטימטר ולמדוד בתפרחת מייד לאחר מעבר ולאחר מכן בשעה 3 ו24 שעות.

ניתוח .9 נתונים

1. בחר באפשרות "נתח" לשונית בCFlow פלוס.
2. לחץ על לחצן "היסטוגרמה" תחת "הפוך עלילה חדשה." בחר "FSC-" ורשימה נפתחת יופיע. ערוץ בחר "FL1-."
3. סמן גם לנתח. בחר כפתור "שער", ולצייר שער באופן ידנילאוכלוסייה של עניין.
4. זרימת פלוס תספק "רוזן" תא בתוך השער הזה ו"% ממגרש זה ".

תוצאות

במערכת זו, שינוי גלוקוז תלוי בglycosome הרכב נצפה. כאשר תאים גדלים בתקשורת המכילה גלוקוז, שתי אוכלוסיות הם נצפו; בהיר אחד ועמום אחד (איור 2 א). תאים עמומים נמל glycosomes לא בוגר, אשר אינו מיובאים PTS2eYFP תוך תאים בהירים נמל תערובת של glycosomes הבוגר והבשל ^12. כאשר גלוקוז נ?...

Discussion

Glycosomes הם אברונים חיוניים, דינמיים, טפיל ספציפי. התהליכים המסדירים את קיום חיים, תחזוקה, השגשוג והשיפוץ של אברונים אלה צפויים לכלול יעדי תרופה שניתן לנצל למטרות טיפוליות. למרות פוטנציאל גבוה השפע של מטרות תרופה כזו, תחום glycosome biogenesis מפגר אחרי המחקר של תהליכים דומים באו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation