Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Resumo

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Resumo

Trypanosoma brucei é um parasita que causa cinetoplastida tripanossomíase humana Africano (HAT), ou doença do sono, e uma doença debilitante, nagana, em bovinos ^1. Os suplentes do parasita entre na corrente sanguínea do hospedeiro mamífero eo vetor mosca tsé-tsé. A composição de muitas organelas celulares muda em resposta a essas condições extracelulares diferentes ^2-5.

Glicossomos peroxissomas são altamente especializados, em que muitas das enzimas envolvidas na glicólise estão compartimentados. Mudanças na composição glicossomo de uma forma de desenvolvimento e regulamentada ambientalmente ^4-11. Atualmente, as técnicas mais comuns usadas para estudar glicossomo dinâmicas são microscopia eletrônica e de fluorescência; técnicas que são caros, tempo e mão de obra intensiva, e não é facilmente adaptada para análises de elevado rendimento.

Para superar essas limitações, um sistema repórter fluorescente glicossomo emo que aumentou a proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento de peroxissoma (PTS2), que dirige a proteína de fusão para glicossomos ^12, foi estabelecido. Após a importação da proteína de fusão PTS2eYFP, glicossomos se tornar fluorescente. Degradação organelo e reciclagem resulta na perda de fluorescência que pode ser medido por citometria de fluxo. Um grande número de células (5000 células / seg) podem ser analisados ​​em tempo real, sem grande preparação de amostras, tais como a fixação e montagem. Este método oferece uma maneira rápida de detectar mudanças na composição de organelas em resposta às variações das condições ambientais.

Introdução

Trypanosoma brucei causa a doença do sono Africano em seres humanos e uma doença debilitante, nagana, em bovinos. As drogas utilizadas no tratamento das referidas doenças são antiquado e extremamente tóxico, as vacinas não estão disponíveis, e o potencial para o desenvolvimento de resistência às drogas necessita da busca de novos alvos de medicamentos ^1.

Durante seu ciclo de vida, T. brucei, alterna entre um inseto vetor e hospedeiro mamífero; dois hosts que se apresentam muito diferentes ambientes em que o parasita deve sobreviver. Uma série de alterações metabólicas e morfológicas ocorrer como o parasita está exposta a diferentes condições ambientais. Algumas das mudanças mais dramáticas são observadas em microcorpos específicas do parasita único delimitado por membrana, denominado glicossomos ^13.

Os níveis de glicose são relativamente elevados (~ 5 mm) na corrente sanguínea e parasitas na corrente sanguínea (BSF) gerar ATP exclusivamente através wh glicólisemetabolismo mitocondrial ile é reprimida ^14. Ao contrário de outros eucariotas, em que a glicólise ocorre no citoplasma, T. brucei compartimenta a maioria das enzimas glicolíticas em glicossomos ^14,15. Os parasitas são absorvidos pela mosca tsé-tsé durante a farinha de sangue e experimentar uma queda em glicose, que cai para níveis indetectáveis ​​dentro de 15 min de ser ingerido pela mosca. O metabolismo de inseto, forma procíclicos (PCF), parasitas é mais flexível e glicose, bem como aminoácidos, tais como prolina, pode ser usado na síntese de ATP ^16-18. Estudos proteômicos comparativos revelam mudanças de ciclo de vida dependentes em glicosomal e proteínas mitocondriais com proteínas glicolíticas aumentou em parasitas na corrente sanguínea e proteínas mitocondriais envolvidos no ciclo TCA e cadeia respiratória ^13,19. Enquanto muitos estudos têm-se centrado sobre as diferenças entre BSF e glicossomos PCF, pouco se sabe sobre as mudanças no glicossomos PCF que ocorrem em resposta aos envmudanças ironmental.

No intestino posterior da mosca, os níveis de glicose estão baixos com aumentos transitórios durante uma alimentação ^20. Na maioria dos estudos in vitro, parasitas PCF são cultivadas em meios contendo glicose. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que mudanças no metabolismo PCF significativamente em resposta à glicose disponibilidade ^17. Na ausência da glucose, a absorção de prolina e prolina aumento da actividade de desidrogenase ^18. Esta mudança no metabolismo mitocondrial é provavelmente acompanhada por uma alteração na morfologia e composição glicossomo, no entanto, isto não foi avaliado directamente.

Electron e microscopia de fluorescência são técnicas comuns usadas para estudar a dinâmica glicossomo em T. brucei ^2,21-24. Estes protocolos são o tempo e trabalho intensivo, caro e difícil de adaptar-se a estudos em tempo real e os protocolos de alto rendimento. Para superar esta limitação, um sistema repórter fluorescente organelo-used para estudar organelos em sistemas de mamífero e de levedura foi modificada para utilização em T. brucei ^12.

Sistemas repórter fluorescente-organelas têm sido amplamente utilizados em eucariotos superiores, tais como fungos, plantas e células de mamíferos ^25-27. Em tais sistemas, uma proteína fluorescente é fundido com uma sequência de aminoácidos que tem como alvo a proteína de organelos específicos. A degradação ou a síntese das proteínas-alvo é medida por meio de fluorescência e as mudanças na composição do organelo são reflectidas pelas alterações na fluorescência celular.

Quando a grelha de leitura aberta de maior proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento peroxissomal tipo II (PTS2) ^12, a proteína é importado para PTS2eYFP, glicossomos maduros importação-competente e fluorescência podem ser monitorizadas por meio de citometria de fluxo. As variações na composição glicossomo são refletidas por mudanças na fluorescência celular. Este sistema pode auxiliar no resolVing os mecanismos que regulam as mudanças induzidas pelo ambiente em glicossomo composição.

Este manuscrito descreve a geração de um sistema repórter em glicossomo PCF parasitas em conjunção com citometria de fluxo para controlar a dinâmica glicossomo em tempo real em parasitas vivos e fornece um exemplo de como ele foi usado para seguir alterações na composição glicossomo em resposta a diferentes ambientes. Em resumo, glicossomo composição é influenciada pela concentração de glucose extracelular e a passagem de culturas em fase logarítmica em meio fresco provoca mudanças na composição glicossomo. Este sistema pode ser modificado para estudar o comportamento dinâmico de outros organelos nos tripanossomas e outros parasitas.

Protocolo

1.-Geral Trypanosoma Pecuária

1. Pesar sólidos para a preparação dos meios SDM79 (Tabela 1).
2. Armazenar a 4 ° C em 50 mL cónico ou um saco plástico. NOTA: Os reagentes são estáveis ​​durante pelo menos 6 meses.
3. Descongelar soro fetal bovino (FBS) em um banho de água a 37 ° C, e misturar periodicamente por inversão. NOTA: FBS é recebida do fornecedor, como uma solução estéril. Filtro de esterilização FBS reduz a sua capacidade para suportar o crescimento do parasita.
4. Uma vez que toda a garrafa é descongelada, calor inactivar soro durante 30 minutos num banho de água a 56 ° C, a mistura periodicamente para minimizar a precipitação de componentes do soro.
5. Descongelar a penicilina / estreptomicina (pen / strep), hemina (2 mg / ml em NaOH a 50 mM), e solução basal águia vitamina meio à temperatura ambiente.
6. Para uma proveta graduada de 1000 ml, adicionar 20,2 g de sólidos SDM79 (Tabela 1) para os componentes líquidos (Tabela 2) e misture bem com uma placa de agitação.
7. Ajustar o pH a 7,35, e perfazer o volume de 850 ml com água.
8. Filtrar esterilizar mídia ligando uma mangueira de vácuo para o fundo de uma garrafa de filtro. Aplicar vácuo até que a solução é filtrada.
9. Remover top filtro no gabinete de biossegurança e adicione 150 ml de inactivado pelo calor FBS. Remover cobertura plástica de tampa estéril e garrafa mídia selo.
10. Prepare mídia SDM80 da mesma maneira como SDM79 com as seguintes excepções; não adicione açúcar ou glucosamina e usar MEM sem glutamina. Em lugar de 150 ml de FBS inactivado pelo calor, adicionar 135 ml de dialisado, FBS inactivado pelo calor, e 15 mL de FBS inactivado pelo calor.
11. Cultura parasitas PCF em cada 25 ^cm2 frasco com 10 ml de meio apropriado a 27 ° C e 5% de CO _2. NOTA: As células devem ser contadas diariamente utilizando um hemocitômetro ou um citômetro de fluxo (ver secção 6) e culturas devem ser mantidas em densidades entre 1 x 10 ⁵ e 5 x 10 ⁶ células / ml.

2 Transfection de PCF Parasitas com a construção repórter fluorescente

NOTA: Para seguir glicossomo dinâmica, uma proteína repórter, contendo a sequência de direccionamento de peroxissomas (PTS2) de aldolase fundido reforçado a proteína fluorescente amarela é expresso nos parasitas. A sequência que codifica a proteína de fusão foi clonado no pXS2bla ^12, que contém o promotor procyclin e as regiões intergénicas de tubulina, que a recombinação homóloga no genoma directa e o gene de resistência à blasticidina para selecção. Linhas celulares de pró-cíclicos, contendo os genes que codificam a polimerase de T7 e tetraciclina repressor (PF29-13) são transformadas com a construção de direccionamento, pXS2: PTS2eYFP.

1. Prepare cytomix misturando os componentes listados na Tabela 3. Filtre esterilizar e armazenar a RT.
2. DNA de plasmídeo linearizado com Mlu I, pipetando 10 mL de ADN (1 mg / mL), tampão de enzima de restrição de 5 ul, 33 ul de água, e 2 μ; L de enzima Mlu I para um tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
3. Purifica-se a digestão de restrição por adição de um volume de tampão de ligação com a enzima de restrição digest. Misturar tampão de ligação e DNA digerido com vórtex. Resumidamente, centrifugar para recolher a amostra no fundo do tubo.
4. Inserir uma coluna de ADN de ligação para um tubo de recolha de 2 ml, e a transferência de ADN digerido / ligante solução tampão à coluna.
5. Centrifugar por 10.000 xg por 1 min. Após a centrifugação, descartar filtrado do tubo de coleta e retornar a coluna para o tubo de coleta.
6. Adicionar 700 ul de tampão de lavagem SPW e centrifugar a 10000 xg durante 1 min.
7. Filtrado Descarte de tubo de coleta, retornar a coluna de tubo de coleta e repetir SPW etapa de lavagem e centrifugação.
8. Descartar filtrado, coluna de retorno ao tubo de recolha, e centrifugar coluna vazio durante 3 minutos a 10000 xg para remover o etanol residual.
9. Em uma cabine de segurança biológica, jogue fora collection tubo e lugar da coluna em um tubo de microcentrífuga estéril.
10. Para eluir o ADN, adicionar 25 ul de água estéril para coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min. Centrifuga-se a 10000 xg durante 1 min.
11. Adicionar mais 25 ul de água estéril na capa de biossegurança coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min.
12. Centrifugar a 10.000 velocidade xg por 1 min.
13. Numa câmara de biossegurança transferir todo o volume de ADN para um novo tubo de microcentrifuga estéril. Nota: Esta etapa evita a contaminação da tampa aberta durante a centrifugação.
14. Adicionar o ADN purificada estéril,, linearizado (10 ng) a 400 ul de cytomix esterilizada por filtração.
15. Contagem de células, como descrito na seção 6 e colher 5 x10 ⁷ a 10 ⁸ células por centrifugação a 800 xg por 15 minutos em temperatura ambiente.
16. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 450 ul de ADN + cytomix usando uma pipeta de 1 ml serológico.
17. Solução de transferência contendo ce lls, ADN, e cytomix para uma cuvete estéril 4 milímetros lacuna e lugar da cuvete na câmara de electroporação.
18. Selecione "decaimento exponencial" e digitar manualmente as seguintes configurações: Tensão: 1,5 kV, capacitância: 25 mF, Resistance: Ω, e Cuvette: 4 mm. Pressione pulso. Uma vez que o impulso está completa, remover cuvete da câmara de electroporação e retornar para o armário de biossegurança.
19. Para um novo frasco estéril, pipeta 10 ml de SDM79. Transferência das células transformadas para o balão com 10 ml de SDM79.
20. Incubar SEM selecção de drogas durante 24 horas a 27 ° C, 5% de CO _2. Após 24 horas, adicionar G418 (15 mg / mL), higromicina (50 ug / ml), e blasticidina (10 ug / ml). Passar 1 ml de células transformadas com droga em 9 ml de SDM79 com droga.
21. Analise as células diariamente conforme descrito nas seções 6 e 7 Quando as células são fluorescentes, e chegaram a uma densidade celular de 1 x 10 ⁷ / ml, fazer stabilates para armazenamento de longo prazo (3,1-3,3).

ve_title "> 3. Fazer Stabilates

1. Para fazer com que meios de congelação, adicionar um volume igual de glicerol a 100% e para cytomix filtro de esterilização.
2. Adicionar 200 ul de meio de congelação a 800 ul de células (1 x 10 ⁷⁾ em um frasco de congelação, misturar suavemente por inversão e lugar entre duas prateleiras de esferovite e congelar a -80 ° C.
3. Uma vez congelado (~ 24 horas), as células de transferência para nitrogênio líquido. NOTA: É importante mover em células LN _2, após 24 h, como um armazenamento mais longo à temperatura de -80 ° C, leva a uma diminuição da viabilidade celular.

4. Stocks descongelamento congelados

1. Remover o frasco congelado de -80 ° C e descongelamento à temperatura ambiente durante cerca de 10 min.
2. Pipetar 9 ml de SDM79 com droga para um novo frasco estéril. Adicionar células descongeladas para este balão. Passa células 1:10, adicionando 1 ml desta cultura a 9 ml de SDM79 em um novo frasco (concentração final de 1 x 10 ⁵ / ml).
3. Antes de as células atingirem uma densidade de 10 ⁷ / ml, começam citómetro definire ensaios de diluição.

5. Setup Cytometer

1. Ligue o citômetro de fluxo e abrir o programa cflow Plus. NOTA: Antes de executar quaisquer amostras, os fluidos devem ser backflushed e enxaguado acordo com os passos 5,2-5,7.
2. Substitua o tubo de água nanopura em que o gole é armazenado com um tubo vazio.
3. Selecione o botão "fluxo reverso".
4. Depois de retrolavagem é completa, remova o tubo de microcentrífuga de gole e descarte.
5. Colocar um novo tubo de microcentrifuga contendo 1 ml de água nova nanopura na sorvo.
6. Selecione um novo poço no programa cflow. Em "Limites Run" definir o tempo de 2 min. Em "Fluidics", selecione "rápido" e "Run".
7. Uma vez que o limite de tempo de 2 min é completa, clique no botão "Apagar dados de exemplo".

6. contagem celular usando citômetro de fluxo

1. Substituir a água com a amostra a ser contadas. Defina "Limites Executar "para 30 segundos," Fluidics "para" rápida "e selecione" Executar ".
2. Após o prazo de 30 seg é completa, cflow mais irá fornecer os eventos / l em "Last Run". Contagem Repita para cada cultura. NOTA: Antes de células chegar a 1 x 10 ⁷ células / ml, prossiga com ensaio de diluição. As células devem ser interrompido após um ensaio de diluição for concluída. Células cultivadas por períodos mais longos perdem a capacidade de responder às condições ambientais.

7 Fluorescência de medição usando citômetro de fluxo

1. Para avaliar a fluorescência, definir "limites Run" para 10 mil eventos e "Fluidos" para "lento". Selecione "Definir limite". Em "Threshold Primária", selecione "permanentemente eliminar eventos do", "FSC-H" (na caixa drop-down) e entre menos de 30.000. Clique em "Aplicar" e depois em "fechar".
2. Selecione o220; "botão em uma das novas janelas de plotagem e selecione" Histograma FSC-A "A partir da lista drop-down, selecione" FL1-A ". NOTA: medidas FL1-A fluorescência no comprimento de onda de 530 nm.
3. Selecione "Run" e repita para todas as culturas.
4. Executar a solução de limpeza através da linha de fluidos durante 2 min e água durante 2 min.

8. Diluição Ensaios

1. Passar as células a uma densidade de 1 x 10 ⁵ células / ml em 3 ml de SDM79 num balão de cultura de ² 25 cm e medir a fluorescência imediatamente após a passagem e, em seguida, em 3 horas e 24 horas.

Análise dos dados do 9

1. Selecione "Analisar" guia sobre cflow Plus.
2. Clique no botão "Histograma" em "Fazer uma nova trama." Selecionar "FSC-A" e uma lista drop-down aparecerá. Selecione o canal "FL1-A."
3. Realce um bem para analisar. Selecione o botão "Gate", e desenhar manualmente uma portapara a população de interesse.
4. Fluxo Plus fornecerá celular "Contagem" dentro desse portão e "% dessa trama".

Resultados

Neste sistema, uma alteração dependente de glucose em glicossomo composição foi observado. Quando as células são cultivadas em meios contendo glucose, duas populações são observados; um brilhante e uma fraca (Figura 2A). Células Dim abrigar glicossomos imaturas, que não tenham importado a PTS2eYFP enquanto as células vivas abrigam uma mistura de maduros e imaturos glicossomos ^12. Quando a glicose está presente na mídia, mislocalization de glicossomo proteínas é letal ^15,2...

Discussão

Glicossomos são, dinâmico, organelas essenciais específicos do parasita. Os processos que regulam a biogênese, manutenção, proliferação e remodelação dessas organelas provavelmente incluem alvos de medicamentos que poderiam ser exploradas para fins terapêuticos. Apesar do elevado potencial de abundância de tais alvos de drogas, o campo de glicossomo biogênese ficou para trás o estudo de processos similares em outros organismos, predominantemente, devido à falta de um sistema tratável, de alto rendimento ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation