Использование флуоресцентных белков для мониторинга Glycosome Динамика в африканском трипаносомы

Резюме

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Аннотация

Trypanosoma brucei является kinetoplastid Паразит, вызывающий африканским трипаносомозом человека (HAT), или сонная болезнь, и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота ^1. Паразит чередует кровоток хозяина млекопитающих и мухи вектора лету. Состав многих клеточных органелл изменяет в ответ на эти различные внеклеточных условиях ^2-5.

Glycosomes являются узкоспециализированными пероксисомы, в котором многие из ферментов, участвующих в гликолиза являются разобщенным. Glycosome состав изменяется в развития и экологически регулируемым образом ^4-11. В настоящее время наиболее общие методы, используемые для изучения glycosome динамику являются электрон и флуоресцентной микроскопии; методы, которые стоят дорого, времени и труда, а не легко адаптировать к высокой пропускной анализов.

Чтобы преодолеть эти ограничения, репортер систему люминесцентная-glycosome вкоторой повышена желтый флуоресцентный белок (EYFP) слита с последовательностью ориентации пероксисом (PTS2), который направляет слитый белок по glycosomes ^12, было установлено. При импорте слитого белка PTS2eYFP, glycosomes стать люминесцентные. Деградации органелл и результаты переработки в потере флуоресценции, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии. Большое количество клеток (5000 клеток / сек) могут быть проанализированы в реальном времени без обширного пробоподготовки, например, фиксации и монтажа. Этот метод предлагает быстрый способ обнаружения изменений в органелл состава в ответ на колебания условий окружающей среды.

Введение

Trypanosoma brucei вызывает африканскую сонную болезнь у человека и изнуряющая болезнь, Нагана, у крупного рогатого скота. Препараты, применяемые при лечении этих заболеваний являются устарелыми и чрезвычайно токсичны, вакцины отсутствуют, и потенциал для развития лекарственной устойчивости к необходимости поиска новых лекарственных препаратов ^1.

Во время его жизненного цикла, Т. brucei, чередует вектор насекомых и млекопитающему; два компьютера, которые представляют очень разные условия, в которых паразит должен выжить. Ряд метаболических и морфологических изменений произойти паразит подвергается различным условиям окружающей среды. Некоторые из самых драматических изменений наблюдаются в одной мембраной ограничена паразитов конкретных микротел, называется glycosomes ^13.

Уровни глюкозы являются относительно высокими (~ 5 мм) в крови и кровотока паразиты (BSF) генерации АТФ исключительно через гликолиза WHИль митохондриальная метаболизм репрессированных ^14. В отличие от других эукариот, в котором гликолиза происходит в цитоплазме, T. brucei compartmentalizes большинство ферментов гликолиза в glycosomes ^14,15. Паразиты будут взяты мухой цеце во время bloodmeal и испытать падение глюкозы, которая падает до неопределяемых уровней в течение 15 мин, чтобы быть заглатывании лету. Метаболизм насекомых, проциклической форма (PCF), паразиты является более гибким и глюкозы, а также аминокислоты, такие как пролин, могут быть использованы в синтезе АТФ ^16-18. Сравнительные протеомные исследования показывают жизненного цикла зависимые изменения в glycosomal и митохондриальные белки с гликолиза белков повышенные в кровоток паразитов и митохондриальные белки, участвующие в цикле ТСА и дыхательной цепи ^13,19. Хотя многие исследования были сосредоточены на различиях между ЧФ и ФКП glycosomes, мало известно об изменениях в ФКП glycosomes, которые происходят в ответ на окрironmental изменения.

В кишке лету, уровень глюкозы низкий с временными увеличивается во время кормления ^20. В большинстве в пробирке исследования, ПКФ паразиты выращивают в среде, содержащей глюкозу. Тем не менее, недавние исследования показали, что изменения ФКП метаболизм значительно в ответ на глюкозу доступность ^17. В отсутствие глюкозы, поглощение пролина и пролина увеличение активности дегидрогеназы ^18. Это изменение метаболизма митохондрий, вероятно, сопровождается изменением состава и морфологии glycosome, однако, это не было непосредственно оценивать.

Электрон и флуоресцентной микроскопии являются общие методы используются для изучения динамики glycosome в Т. brucei ^2,21-24. Эти протоколы времени и труда, дорого, и трудно адаптироваться в режиме реального времени исследований и протоколов с высокой пропускной. Чтобы преодолеть это ограничение, репортер система люминесцентная-органеллы USED для изучения органелл в млекопитающих и дрожжей систем была изменена для использования в T. brucei ^12.

Репортер системы Люминесцентная-органелл широко используются в высших эукариот, таких как дрожжи, растений и клеток млекопитающих ^25-27. В таких системах, флуоресцентный белок слит с аминокислотной последовательностью, которая направлена ​​белка в определенных органелл. Разложение или синтез целевых белков измеряется с помощью флуоресценции и изменения в составе органелл, отраженных от изменения флуоресценции клеток.

Когда открытая рамка считывания повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) сливают с Тип II пероксисомальной последовательности целевых ориентиров (PtS2) ^12, белок PTS2eYFP импортируется в зрелых, импортных-компетентный glycosomes и флуоресценции можно контролировать с помощью проточной цитометрии. Вариации в glycosome композиции, отраженных от изменений в клеточной флуоресценции. Эта система может помочь в резолВинг механизмы, которые регулируют экологически индуцированных изменений в glycosome состава.

Эта рукопись описывает генерацию системы glycosome репортера в ФКП паразитов в сочетании с проточной цитометрии для мониторинга динамики glycosome в режиме реального времени в живых паразитов и приводит пример, как он был использован, чтобы следить за изменениями в glycosome состава в ответ на различных средах. Таким образом, glycosome состав зависит от внеклеточных концентраций глюкозы и прохождения лог-фазовых культур в свежую среду вызывает изменения во glycosome состава. Эта система может быть изменен, чтобы изучить динамическое поведение других органеллах в трипаносом и других паразитов.

протокол

1 Общие трипаносом Husbandry

1. Взвесьте твердые для SDM79 подготовки медиа (Таблица 1).
2. Хранить при 4 ° С в 50 мл коническую или Ziploc мешок. ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты стабильны в течение не менее 6 месяцев.
3. Оттепели фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 37 ° C водяной бане, и перемешивают периодически инверсии. Примечание: ФБС получен от поставщика в виде стерильного раствора. Фильтр стерилизации FBS снижает его способность поддерживать рост паразита.
4. После того, как весь бутылки оттаивают, тепло инактивированную сыворотку в течение 30 мин в 56 ° C водяной бане, смешивание периодически, чтобы свести к минимуму осаждение компонентов сыворотки.
5. Оттепели раствор пенициллина / стрептомицина (ручка / стрептококк), гемин (2 мг / мл в 50 мМ NaOH), и основная среда Eagle витамина раствору при комнатной температуре.
6. К 1000 мл мерный цилиндр, добавить 20,2 г SDM79 твердых веществ (Таблица 1) жидких компонентов (таблица 2) и хорошо перемешать на мешалке.
7. Отрегулируйте рН до 7,35, и принести объем до 850 мл водой.
8. Фильтр стерилизации носитель путем присоединения вакуумный шланг к нижней части бутылки фильтра. Применение вакуума до тех пор, пока раствор не фильтруется.
9. Удалить фильтра верх в кабинете биологической безопасности и добавить 150 мл тепла инактивированной FBS. Удалить пластиковую крышку от стерильной крышкой и уплотнение СМИ бутылки.
10. Подготовьте SDM80 СМИ таким же образом, как SDM79 со следующими исключениями; не добавить глюкозу или глюкозамин и использовать MEM без глутамина. В месте 150 мл инактивированной нагреванием FBS, добавьте 135 мл диализовали, инактивированной нагреванием FBS, и 15 мл инактивированной нагреванием FBS.
11. Культура ПКФ паразиты в 25 см ² колбы с 10 мл соответствующей среды на 27 ° С и 5% СО _2. ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны учитываться в день с помощью гемоцитометра или проточного цитометра (см раздел 6) и культуры должны быть сохранены при плотностях между 1 х 10 ⁵ и 5 х 10 ⁶ клеток / мл.

2 Трansfection из ФКП Паразиты с люминесцентной Reporter Construct

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения glycosome динамику, репортер белок, содержащий пероксисомальной последовательность прицеливания (PtS2) альдолазы, слитого с повышенной желтого флуоресцентного белка выражается в паразитов. Последовательность, кодирующая слитый белок, клонируют в pXS2bla ^12, который содержит промотор procyclin и тубулина межгенные области, которые направляют гомологичной рекомбинации в геном и ген устойчивости к бластицидин для выбора. Проциклической клеточные линии, несущие гены, кодирующие Т7-полимеразы и тетрациклинового репрессорного (PF29-13) трансформируют прицеливания конструкции, pXS2: PTS2eYFP.

1. Подготовьте cytomix путем смешивания компонентов, перечисленных в таблице 3. Фильтр стерилизуют и хранят при комнатной температуре.
2. Линеаризации плазмиды ДНК с помощью пипетки MluI 10 мкл ДНК (1 мкг / мкл), 5 мкл ограничительного фермента буфера, 33 мкл воды и 2 μ; Л MluI фермента в микроцентрифужную пробирку. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
3. Очищают ограничение переварить, добавив 1 объем связывания буфер для рестриктазой дайджеста. Смешайте буфера для связывания и переваренной ДНК встряхиванием. Кратко центрифуги для сбора образца в нижней части трубки.
4. Вставьте ДНК привязку столбца в 2 мл пробирку, и передача переваривается ДНК / связывания буферный раствор к колонке.
5. Центрифуга для 10000 мкг в течение 1 мин. После центрифугирования, отбросить фильтрат из пробирки и вернуть колонку в пробирку.
6. Добавить 700 мкл SPW буфера и центрифуге при 10000 мкг в течение 1 мин.
7. Отменить фильтрат из пробирки, вернуть колонку в пробирку и повторить SPW шаг стирки и центрифугирования.
8. Откажитесь фильтрата, вернитесь столбце, чтобы пробирку и центрифуги пустой столбец в течение 3 мин при 10000 х г для удаления остаточного этанола.
9. В биобезопасности кабинета, выбросить цвлекция трубки и место колонка в стерильной трубки микроцентрифужных.
10. Для элюции ДНК, добавить 25 мкл стерильной воды в колонну и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Центрифуга при 10000 мкг в течение 1 мин.
11. Добавить еще 25 мкл стерильной воды в биобезопасности капотом к колонке и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 мин.
12. Центрифуга при 10000 скорости XG в течение 1 мин.
13. В кабинете биобезопасности передать весь объем ДНК в новую стерильную пробирку микроцентрифуги. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предотвращает загрязнение от открытой крышкой во время центрифугирования.
14. Добавить стерильной, очищают, линеаризованной ДНК (10 мкг) в 400 мкл стерилизованным фильтрацией cytomix.
15. Граф клеток, как описано в разделе 6 и урожай 5 x10 ⁷ -10 ⁸ клеток путем центрифугирования при 800 мкг в течение 15 минут при комнатной температуре.
16. Слейте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 450 мкл ДНК + cytomix использованием 1 мл серологические пипетки.
17. Передача раствор, содержащий се заполняет, ДНК, и cytomix в стерильную 4 мм зазор кюветы и кюветы место в камере электропорации.
18. Выберите "экспоненциальный спад" и вручную ввести следующие параметры: Напряжение: 1,5 кВ, Емкость: 25 MF, сопротивление: Ω и кювет: 4 мм. Пресс импульса. После того, как пульс полный, удалить кювету с электропорации камеры и вернуться к биобезопасности кабинета.
19. В новый стерильную колбу, пипетки 10 мл SDM79. Передача трансформированных клеток в колбу с 10 мл SDM79.
20. Выдержите БЕЗ выбора препарата в течение 24 ч при 27 ° С, 5% СО _2. Через 24 ч добавляют G418 (15 мкг / мл), гигромицин (50 мкг / мл), и бластицидин (10 мкг / мл). Pass 1 мл трансформированных клеток с препаратом в 9 мл SDM79 с препарата.
21. Анализ клеток ежедневно, как описано в разделах 6 и 7, когда клетки флуоресцентной, и достигли плотности клеток 1 х 10 ⁷ / мл, сделать stabilates для долговременного хранения (3.1-3.3).

ve_title "> 3. Создание Stabilates

1. Для того, чтобы замораживания средств массовой информации, добавляют равный объем 100% глицерина, чтобы cytomix и фильтра стерилизации.
2. Добавить 200 мкл морозильной СМИ 800 мкл клеток (1 х 10 ⁷⁾ в криопробирку, аккуратно перемешать переворачиванием и место между двумя пенопластовые стойки и заморозить при температуре -80 ° C.
3. После того, как замороженные (~ 24 ч), Передача клетки жидкого азота. Примечание: Важно, чтобы переместить клетки в LN ₂ после 24 часов, а более длительного хранения при -80 ° С приводит к снижению жизнеспособности клеток.

4. Размораживание замороженных запасов

1. Удалить замороженный флакон от -80 ° С до оттепели при комнатной температуре в течение примерно 10 мин.
2. Внесите 9 мл SDM79 с препарата в новую стерильную колбу. Добавить оттаивали клетки в этой колбе. Pass клеткам 1:10 добавлением 1 мл этой культуры в 9 мл SDM79 в новую колбу (конечной концентрации 1 × 10 ⁵ / мл).
3. До того, как клетки достигают плотность 10 ⁷ / мл, начинают цитометра установлени разведение анализы.

5 Цитометр Setup

1. Включите проточной цитометрии и открыть программу Cflow Plus. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед тем как запустить образцы, ГИДРОСИСТЕМЫ следует самоочистку обратным потоком и промыть в соответствии с шагами 5.2-5.7.
2. Заменить трубку NanoPure воды, в которой хранится SIP с пустой трубы.
3. Выберите кнопку «обратной промывки".
4. После обратной промывки удалим микроцентрифужную пробирку с глотка и выбросьте.
5. Установите новую микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл новой NanoPure воды на глоток.
6. Выберите новую скважину в программе Cflow. Под «Пределы Run" установить время в течение 2 мин. Под "ГИДРОСИСТЕМЫ" выберите "быстро" и "Run".
7. После того, как срок 2 мин будет завершена, нажмите кнопку "Delete Sample Data".

6 подсчета клеток с помощью цитометра

1. Замените воду с образцом для подсчета. Установите "Запуск Limits "до 30 сек," Fluidics "в" скорую ", а затем выберите" Выполнить ".
2. По истечении срока, 30 сек завершена, Cflow плюс обеспечит события / мкл под "Last Run". Повторите счета для каждой культуры. ПРИМЕЧАНИЕ: Перед клетки достигают 1 х 10 ⁷ клеток / мл, продолжить разбавления анализа. Клетки должны быть прекращены после одного разведения анализ завершен. Клетки, культивированные в течение более длительных периодов теряют способность реагировать на условия окружающей среды.

7 измерения флуоресценции с помощью цитометра

1. Для оценки флуоресценции, установить «Выполнение Limits" в 10000 событий, и "FLUIDICS" в "медленные". Выберите "Установить порог". "Первичного Порога", выберите "Постоянно устранить события на", "FSC-H" (в меню), и введите менее 30000. Нажмите "Применить", затем "закрыть".
2. Выберите220; "кнопку в одном из новых сюжетных окон и выберите" Гистограмма FSC-A "из выпадающего списка выберите" FL1-A ". ПРИМЕЧАНИЕ: меры FL1-A флуоресценции в волны 530 нм.
3. Выберите "Выполнить" и повторите для всех культур.
4. Запуск моющего раствора через линию гидросистемы в течение 2 мин и воды в течение 2 мин.

8. разбавления Анализы

1. Pass клеток до плотности 1 × 10 ⁵ клеток / мл в 3 мл SDM79 в 25 см ² культуральной колбы и измерить цветение сразу же после прохода и затем в 3 часа и 24 часов.

Анализ 9. данных

1. Выберите "Анализ" вкладку на Cflow Plus.
2. Нажмите появится кнопка "Гистограмма" в разделе "Создайте новый сюжет." Select "FSC-A" и выпадающего списка. Выберите канал "FL1-."
3. Выделите хорошо проанализировать. Выберите кнопку "Выход", и вручную нарисовать воротадля населения интерес.
4. Flow Plus обеспечит клеток "Count" в пределах этих ворот и "% этого участка".

Результаты

В этой системе, наблюдалось изменение уровня глюкозы в зависимости от glycosome в композиции. Когда клетки выращивают в глюкозы, содержащего СМИ, наблюдаются две популяции; одна яркая и одна тусклый (2А). Dim клетки укрывает незрелые glycosomes, которые не импортировали PTS2eYFP а яркие клетки...

Обсуждение

Glycosomes являются важными, динамические, паразит-специфический органеллы. Процессы, которые регулируют биогенеза, техническое обслуживание, пролиферацию и ремоделирование этих органелл, вероятно, включать лекарственных целей, которые могли бы быть использованы в терапевтических целях....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A10781	SDM79 Ingredient
L-Alanine	Avocado Research Chemicals Ltd	A15804	SDM79 Ingredient
L-Arginine	CalBiochem	1820	SDM79 Ingredient
p-Aminobenzoic acid	ICN Biomedicals	102569	SDM79 Ingredient
Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)	Sigma	B6891	SDM79 Ingredient
Biotin	Fisher	BP232-1	SDM79 Ingredient
Calcium chloride	VWR	BDH0224	Cytomix
EDTA	Fisher	S311-100	Cytomix ingredient
EZNA Gel Extraction kit	Omega Biotek	D2500-01	DNA purifiation
Research grade Serum	Fisher	03-600-511	SDM79 Ingredient
Folic acid	ICN Biomedicals	101725	SDM79 Ingredient
Glucosamine HCl	ICN Biomedicals	194671	SDM79 Ingredient
Glucose	GIBCO	15023-021	SDM79 Ingredient
L-Glutamine	CalBiochem	3520	SDM79 Ingredient
Glycerol	Acros Organics	Ac15892-0010	Freezing media
Graces insect cell media powder	GIBCO	11300-043	SDM79 Ingredient
Hemin	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Guanosine	Avocado Research Chemicals Ltd	A11328	SDM79 Ingredient
HEPES	MP Biomedicals	194025	SDM79 Ingredient
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500	Cytomix ingredient
L-Methionine	Fisher	BP388-100	SDM79 Ingredient
MEM Amino Acids (50x)	Cellgro	25-030-CI	SDM79 Ingredient
NEAA Mixture (100x)	Lonza	13-114E	SDM79 Ingredient
Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine	Cellgro	10-010-CM	SDM79 Ingredient
MOPS	Fisher	BP308-500	SDM79 Ingredient
Sodium biocarbonate	Fisher	S233-500	SDM79 Ingredient
Penicillin-streptomycin Solution	Cellgro	30-002-CI	SDM79 Ingredient
L-Phenylalanine	ICN Biomedicals	102623	SDM79 Ingredient
Potassium chloride	Fisher	P217-500	Cytomix ingredient
Potassium phosphate dibasic anhydrous	Fisheer	P290-212	Cytomix ingredient
L-Proline	Fisher	BP392-100	SDM79 Ingredient
L-Serine	Acros Organics	56-45-1	SDM79 Ingredient
Pyruvic acid, sodium salt	Acros Organics	113-24-6	SDM79 Ingredient
L-Taurine	TCI America	A0295	SDM79 Ingredient
L-Threonine	Acros Organics	72-19-5	SDM79 Ingredient
L-Tyrosine	ICN Biomedicals	103183	SDM79 Ingredient
E.Z.N.A. Cycle Pure kit	Omega Biotek	D6492-02	DNA purification
Binding buffer	Omega Biotek	PDR041	DNA purification
SPW wash buffer	Omega Biotek	PDR045	DNA purification
Gene Pulser Xcell	Biorad	165-2660	Trypanosome transformation
4 mm Electroporation cuvettes	VWR		Trypanosome transformation