JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

Abstract

ניתוח ברזולוציה גבוהה של המורפולוגיה והתפקוד של תאי עצב ביונקים לעתים קרובות דורש genotyping של בעלי חיים בודדים ואחרי הניתוח של תרבויות העיקריות של תאי עצב. אנו מתארים מערכת של נהלים ל: תיוג עכברי יילוד להיות genotyped, genotyping המהיר, והקמת תרבויות בצפיפות נמוכה של תאי עצב במוח מעכברים אלו. עכברים בודדים מסומנים על ידי קעקוע, שמאפשר זיהוי לטווח ארוך שנמשך לבגרות. Genotyping על ידי הפרוטוקול המתואר הוא מהיר ויעיל, ומאפשר להפקה אוטומטית של חומצות גרעין עם אמינות טובה. זה שימושי בנסיבות שבו זמן מספיק לgenotyping הקונבנציונלי אינו זמין, למשל, בעכברים הסובלים מהקטלניות בילוד. תרבויות עצביות עיקריות נוצרות בצפיפות נמוכה, המאפשרת ניסויי הדמיה ברזולוציה מרחבית גבוהה. שיטת תרבות זו דורשת ההכנה של שכבות מזין גליה לפני ציפוי עצבי. Protocol מיושם במלואו למודל עכבר של דיסטוניה DYT1 הפרעת תנועה (העכברים לדפוק בΔE-torsinA), ותרבויות עצביות מוכנות מן ההיפוקמפוס, קליפת המוח וסטריאטום של עכברים אלו. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על עכברים עם מוטציה גנטית אחרת, כמו גם לבעלי חיים ממינים אחרים. יתר על כן, רכיבים בודדים של הפרוטוקול יכולים לשמש למשנה פרויקטים בודדים. כך פרוטוקול זה יהיה יישומים רחבים, לא רק במדעי המוח, אלא גם בתחומים אחרים של מדעים ביולוגיים ורפואיים.

Introduction

מודלים של מכרסמים של מחלות גנטיות הוכיחו שימושיים בהקמת הפונקציות הפיזיולוגיות של חלבונים וחומצות גרעין נורמלים, כמו גם את השלכות pathophysiological של פגמים באלה. דוגמאות כוללות עכברים חסרים לחלבונים מעורבים בתפקודים תאיים מפתח, כמו גם מודלים של עכברים של הפרעות כגון מחלת אלצהיימר. עם זאת, מניפולציות גנטיות מסוימות יכולות להוביל לקטלני בילוד זמן קצר או כמה ימים לאחר לידה. במקרים אלה, תרביות תאים עיקריות הן כלי חשוב, כי ניתן להשיג תאי חיים מהגורים העובריים או ילוד לפני המוות, הם יכולים להישמר במשך לפחות כמה שבועות במבחנה, ובמשך הזמן הזה התפתחות עצבית מוקדם יכולה להיות מלווה ב ניסויים ביוכימיים, פונקציונליים וצורניים. לתרבויות העיקריות, זה יכול להיות מועיל לצלחת הנוירונים בצפיפות נמוכה; זה עושה את זה אפשר לדמיין את somata הבודד, דנדריטים, פירי axonal וtermi עצבאלכסונים ברזולוציה מרחבית גבוהה. עם זאת, ההישרדות וההתמיינות של תאי עצב בצפיפות נמוכה בדרך כלל דורש כי הם מצופים בשכבת מזין גליה, שיתוף תרבותי עם תאי גלייה בהעדר המגע פיזי עימם, או בתרבית בינונית המותנה בגליה 1.

הקמת תרבויות עצביות בצפיפות נמוכה בשכבות מזין גליה יכולה להיות תלויה במהיר ואמין genotyping מראש - תוך כמה שעות בניגוד לכמה ימים. מהירות היא חשובה במיוחד כאשר גנוטיפ העצבי צריכה להיות מתאים לזה של שכבת מזין גליה מוכנה מראש. כדוגמא מעשית יותר, ייתכן שיהיה צורך להחליט איזה גורים שגנוטיפ להשתמש בתרבויות יצירה, כדי לייעל את היעילות של ניסוי.

כאן אנו מדגימים את הפרוטוקול עובד שהיה בשימוש כבר genotyping עכבר מהיר, פשוט ואמין בפרסומים קודמים 2-6. זנבות עכבר ומשמשות ערכה זמינה מסחרי. פרוטוקול זה כולל מיצוי בשלב יחיד של חומצות גרעין מהרקמות, ולא דורש צעד טיהור גרעין חומצה ולא שימוש במאגר סיום ("להפסיק פתרון '). האמינות של שיטת genotyping זה בא לידי ביטוי בהצגת התוצאות של סדרה של בדיקות, כאשר הבדלים הם הציגו ביחס לסכום התחלתי של הדגימות, גילם של בעלי החיים ואת אורכו של amplicons PCR. ערכה זו מציעה את היתרונות של מיצוי ואמינות אוטומטיים.

למען להיות מקיף, השימוש בקעקוע לזיהוי לטווח ארוך של עכברי genotyped הוא הוכיח גם. קעקוע מושגת על ידי החלת דיו קעקוע לדרמיס של העור (מתחת לאפידרמיס) 7. הליך מתואר לקעקוע כפות הרגלי של עכברים ילודים או יום 1 ישן, אם כי ניתן ליישם קעקועים לחלקים אחרים של הגוף, כגון זנבות ורגליים, ועניםals בכל הגילים. בנוסף, הליכים יהיו הפגינו לציפוי ונוירונים culturing עכבר בצפיפות נמוכה, המבוססים על הכנה מותאמת סוגים שונים של שכבות מזין גליה 2,8 של.

אנו משתמשים במודל גנטי עכבר של דיסטוניה DYT1 הפרעת נוירולוגית בירושה - הפרעת תנועה אוטוזומלית דומיננטית הנגרמת על ידי מוטציה בגן TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. החלבון המקודד, torsinA, שייך ל" ATPases הקשורים לפעילויות מגוונות סלולריות "משפחה של חלבונים (+ AAA), שחבריה בדרך כלל לבצע פעולות כמו מלווה-, סיוע ב: חלבון התגלגלות, פירוק חלבון מורכב, סחר בקרום, ואיחוי שלפוחית 10-13. תוצאות המוטציה במחיקה במסגרת של קודון לחומצה גלוטמית, ויכולות להוביל לתופעה של 'התחלה המוקדמת של כללי דיסטוניה המבודדת' 14,15. עם זאת, בדרךמנגנוני ophysiological אחראים להפרעה זו יישארו הבין היטב. במודל של עכברי נוק-ב, אלל מוטנטי הוא Tor1a tm2Wtd, ציינו להלן כTor1a ΔE. עכברי מטופלים אנושיים ברי-קיימא וגנטי לחקות עם דיסטוניה DYT1 הטרוזיגוטיים ΔE-torsinA בנוק-, ואילו הומוזיגוטים לדפוק בעכברים למות לאחר הלידה 16,17, עם זמן האחזור למוות לאחר לידה מושפעת מרקע גנטי 18. המוות המוקדם של עכברים לדפוק בהומוזיגוטים מחייב ששני genotyping של בעלי חיים ואת הקמתה של תרבויות עצביות הושלמו במהירות. כדוגמא נוספת של גנוטיפ, Tfap2a (גורם שעתוק AP-2α, הפעלה משפר מחייב 2α חלבון) ישמשו. החלבון מקודד על ידי הגן הזה הוא חשוב בויסות תהליכים תאיים רבים, כגון ריבוי, בידול, הישרדות ואפופטוזיס 19.

Protocol

הערה: נהלי כל החיה שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת איווה.

זיהוי 1. לטווח ארוך של עכברים באמצעות קעקוע רפידות Paw

  1. לשתק כפה עם כרית כף הרגל (plantar המשטח) מול הנסיין. החזק את כף הרגל עם האגודל ואצבע המורה. היזהר שלא לצבוט את הכף.
    הערה: הקיבוע יציב חשוב לוודא כי פיגמנט הקעקוע ממוקם לתוך הדרמיס של כרית כף הרגל, ובכך הוא קבע 7.
  2. ספוגית כרית כף הרגל עם אתנול 70% על ספוג גזה או ספוגית.
  3. החלת שמן עור למוליך כותנה שקצה, ולחץ בעדינות את הקצה נגד פני השטח של כמה פעמים כרית כף רגל. השתמש רק כמות קטנה של שמן לעור; כאשר קיימים בכמויות גדולות, זה ימנע פיגמנט הקעקוע מלהגיע העור.
  4. טובלים את קצות מחטי הקעקוע לתוך דיו הקעקוע רק לפנילקעקוע. השתמש נקייה, ספטית ומחטים קעקוע חדות, כדי להקטין את הכאב ואת האפשרות של זיהום, וגם כדי להגביר את יעילות הקעקוע.
  5. בעוד משטח כרית כף הרגל מכוסה בעור השמן, לחץ על הטיפים מחט קעקוע בצורה אנכית וקל על העור במרכז כרית כף הרגל, ולהזריק את הדיו מספר פעמים. ראה טבלה של חומרים / ציוד לקבלת מידע על מערכת קעקוע חשמלית.
  6. תרסיס אתנול 70% על ספוג גזה, לחץ בעדינות עליו מפני הכפה כדי להסיר קעקוע פיגמנט נוסף על פני העור, ולבדוק את האיכות של קעקוע. בדוק שאמצע כרית כף רגל יש כתם כהה, עגול שונים מפיגמנטציה של עור רגילה. אם הקעקוע הוא לא אפל או גדול מספיק כדי להקל על צפייה, חזור על שלבי קעקוע לפני.

2. עכברים Genotyping יילוד באמצעות ערכת PCR Genotyping מהירה

  1. לחטא את הקצה הדיסטלי של זנב עכבר עם 70% אתנול, לחתוך 5 מ"מ או פחות של הזנבלהטות ולהעביר אותו לצינור של רצועת 8-צינור מהסוג המשמש לPCR. השתמש בסכין גילוח אינו בשימוש לכל גור, כדי למנוע זיהום צולב בין דגימות. לחלופין, להשתמש במספריים, אבל במקרה הזה, בזהירות וביסודיות להסיר את הרקמה שנותרה על הלהבים באמצעות אתנול 70%. בדוק לדימום. אם דימום מתרחש, להפעיל לחץ על החלק החתוך של הזנב עם ספוג גזה עד דימום הפסק.
  2. הוסף 200 μl של הפקת DNA פתרון לכל צינור PCR המכיל את הדגימה. ראה טבלה של חומרים / ציוד להרכב שלה ומידע על הערכה.
  3. הנח את רצועת הצינור לתוך Cycler תרמית PCR, ולהתחיל את מיצוי DNA באמצעות התכנית הבאה: מחזור 1 ב 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ומחזיק ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: זוהי אותה Cycler תרמית PCR ששמשה מאוחר יותר לPCR.
  4. לאחר מיצוי DNA נגמר, להסיר את רצועת הצינור מCycler התרמיתnd להפוך 5 פעמים.
  5. העברה 4 μl של הפתרון (תמצית ה- DNA) של כל דגימה לצינור של רצועת 8-צינור, ומערבבים עם אינו בשימוש: 10 μl של 2X PCR מוכן Mix II, 2 μl מעורב קדימה ולהפוך פריימרים (מומלץ ב 0.5 מיקרומטר; ראו טבלה של חומרים / ציוד לרצפים), ו -4 μl של H-חופשי nuclease 2 O, עבור כל דגימה. בקצרה ספין (לדוגמא, 3 שניות) באמצעות צנטריפוגות בטבלה עליונה. שמור את הצינורות על קרח בכל העת למעט בעת הטיפול.
  6. לבצע רכיבה תרמית. ראה שולחן של חומרים / ציוד לתכנית התרמית.
  7. לזהות את מוצרי DNA מוגברים. טען את הפתרון הכולל תגובה מ( μl 20) PCR ישירות לתוך באר של ג'ל agarose. טען את סמני משקל המולקולריים לתוך באר נפרד. החל שדה חשמלי.
  8. לרכוש תמונות הקרינה של הלהקות באור אולטרה סגול.

3. יסודי תרבות של עכבר המוח Neuronים על שכבת מזין גליה

הערה: ההליכים לנתיחה המוח והתא דיסוציאציה (3.1) משותפים לכל הנהלים שלאחר מכן. הנהלים לתרבויות גליה עכבר (3.2), תרבויות גליה חולדה (3.3), ותרבויות עכבר עצביות (3.4) מתוארים בנפרד לאחר מכן.

  1. מוח Dissection והסלולרי Dissocaiation
    1. להקריב את גור עכבר או עכברוש אחד על ידי עריפת ראש, במהירות להסיר את המוח, ולמקם אותו לתוך הפתרון "הנקס (ראה טבלה 1 לרכב) + 20% בסרום שור עוברי (FBS) בצלחת 35 מ"מ (כל הזמן על קרח).
    2. חותך את המוח דרך קו האמצע לשתי ההמיספרות. הסר את האזור של עניין (למשל, קליפת המוח, סטריאטום וההיפוקמפוס) מכל חצי הכדור של המוח. הסר את קרומי המוח וכלי דם גדולים מהמשטח. חותך את האזור במוח ל4-10 פרוסות דקות באמצעות סכין כירורגית.
    3. יש לשטוף את פרוסות המוח בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, פעם שנינות"הפתרון + 20% FBS, 3 פעמים ולאחר מכן עם הנקס 'h הנקס פתרון (כלומר, ללא סרום) (כל 4 ° C). כדי לשטוף, להוסיף פתרון מיליליטר 5-10, בואו מוח פרוסות להתיישב בחלק התחתון של הצינור, לשאוב את הפתרון מהחלק העליון, ולהוסיף פתרון טרי. לסיים את הליך השטיפה על ידי aspirating הפתרון.
    4. סנן 2 מיליליטר של פתרון העיכול המכיל טריפסין (ראה טבלה 1 לרכב) באמצעות מזרק 3 מיליליטר ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לתוך הצינור המכיל את פרוסות המוח. בואו trypsinization להמשיך במשך 13 דקות ב RT.
    5. לנטרל את פתרון טריפסין הראשון על ידי aspirating ביותר שלו ולאחר מכן על ידי הוספת 7-10 מיליליטר של התמיסה 'הנקס + 20% FBS (4 ° C).
    6. יש לשטוף את פרוסות המוח, פעמיים עם הנקס 'FBS + 20% הפתרון, ולאחר מכן שלוש פעמים עם הנקס' פתרון (כלומר ללא סרום) (כל 4 ° C). לסיים את הליך השטיפה על ידי aspirating solutיון.
    7. סנן 2 מיליליטר של פתרון דיסוציאציה (ראה טבלה 1 לרכב) באמצעות מזרק 3 מיליליטר ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לצינור עם פרוסות המוח.
    8. מכאני לנתק את התאים בעדינות על ידי triturating 10-20 פעמים, עד שפיסות רקמה גלויות תיעלם. השתמש ב, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה ולהימנע מבועות במהלך טחינה דקה.
    9. חכה 3 דקות לחתיכות קטנות להתיישב.
    10. העבר את רוב הפתרון (~ 1.5 מיליליטר, והותרתי חלק מפתרון בתחתית) לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגה המכיל פתרון FBS + 20% 3 מיליליטר הפתרון "הנקס (4 מעלות צלזיוס), באמצעות פקוק כותנה, Fire- פיפטה פסטר המלוטשת. לא להעביר את כל הפתרון, כי ההכללה של משקעים בתחתית בדרך כלל תוצאות הידרדרות של התרבות.
    11. צנטריפוגה למשך 13 דקות ב ~ 185 גר '(~ 1,100 סל"ד) בשעה 4 ° C.
    12. לשאוב supernatant בעדינות,להוסיף 1 מיליליטר של ציפוי בינוני (37 ° C) לגלולה, וresuspend זה בעדינות על ידי pipetting מספר פעמים באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה מראש חימם.
      הערה: שלושה סוגים שונים של ציפוי תקשורת המשמשים למטרות תרבות שונות: ציפוי בינוני-1 לתאי גליה עכבר, ציפוי בינוני 2 לנוירונים עכבר, וציפוי בינוני-3 לתאי עצב חולדה ותאי גליה (ראה טבלה 1 ליצירות) .
    13. להוציא 10 μl של ההשעיה התא, לערבב אותו עם 10 μl של פתרון trypan הכחול 0.4%, ולמדוד את הצפיפות של תאי חיים, או באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי.
  2. תרבויות עכבר גליה
    1. שטוף את coverslips כדי לעזור להקים תרבויות בריאים של תאי עכבר.
      1. לטבול את coverslips זכוכית (עגול, קוטר 12 מ"מ) ב- 70% חומצה חנקתית בצלחת פטרי מזכוכית. להגן מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום, ומניח אותו על שייקר O / N מסלולית.
      2. יש לשטוף את coversli הזכוכיתלפחות שלוש פעמים ps בצלחת פטרי עם מים מזוקקים. לטבול אותם במים מזוקקים. מניחים את הצלחת על N / O ייקר מסלולית.
      3. יבש coverslips על נייר סינון 150 מ"מ Whatman בארון הבטיחות הביולוגי.
      4. החיטוי coverslips.
      5. מניחים את coverslips לתוך צלחת תרבות 24 גם.
    2. עכברים שזה עתה נולד לייבל וגנוטיפ לפי שלבי 1 ו -2.
    3. השג את תאי המוח מגורי העכבר, על פי שלב 3.1.
      הערה: השימוש בקליפת המוח אופייני להכנת שכבת מזין גליה עכבר. עם זאת, אזורים אחרים במוח, כגון ההיפוקמפוס וסטריאטום, יפעלו לאחר התאמה נכונה של צפיפות תאים עקב מספרים ותשואות של תאים מאזורים שונים.
    4. להוסיף ~ 4 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-1 להשעית התא הסופית (~ 1 מיליליטר). לתקשורת ותרבות התחממות מראש, הנח את הפתרון בחממת התרבות (5% O CO 2 -95% 2, 37 ° C) O / N, ללאפשר ערכי הטמפרטורה ו- pH לייצב.
    5. מעביר את ההשעיה התא לבקבוק תרבות T25 ללא ציפוי, באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה. מניחים את הבקבוק בחממת התרבות.
    6. ביום 1 במבחנה (DIV), לשטוף את התאים בתרבית בבקבוק T25 פעמיים עם ציפוי בינוני-1 (4 ° C). מניחים את הבקבוק בחזרה לתוך החממה. לבצע שטיפה על ידי aspirating הבינוני בתוך הבקבוק עם טפטפת פסטר לחלוטין, והוסיף ~ 5 מיליליטר של מדיום חדש והטה את הבקבוק מספר פעמים בתנועות סיבוביות.
    7. ב6-9 DIV, (כלומר, יום אחד לפני trypsinization וציפוי על coverslips, בצעדי 3.2.8-3.2.13), מקומו של חומר הציפוי 100 μl עם חלבוני מטריצה ​​תאיים (ראה טבלה של חומרים / ציוד להערות על חומר הציפוי) על coverslips הזכוכית בצלחת תרבות, והנח את המנה התרבות בחממת התרבות.
    8. ב7-10 DIV, כאשר התאים 20-4מחוברות 0% (מרחבית רציפה), trypsinize.
      1. יש לשטוף את הבקבוק פעם אחת, על ידי aspirating כל הפתרון בתוך הבקבוק וההוספה ~ 13 מיליליטר של התמיסה "הנקס (4 ° C), בעדינות להטות את הבקבוק מספר פעמים בתנועות סיבוביות, ולשאוב את הפתרון לחלוטין.
      2. הוסף 40 μl של פתרון DNase (ריכוז סופי, 750 יחידות / מיליליטר) ל -4 מיליליטר פתרון טריפסין-EDTA, להעביר את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר, ולהוסיף את התסנין ישירות לתאי הבקבוק.
      3. בואו trypsinization להמשיך במשך 13 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה.
      4. לנטרל את פתרון טריפסין על ידי הוספת 2 מיליליטר של 100% FBS (4 ° C) לבקבוק.
      5. להעביר את תאי trypsinized לצינור 15 מיליליטר צנטריפוגה באמצעות 5 לפיפטה 10 מ"ל, להוסיף ~ 4 מיליליטר של התמיסה 'הנקס + 20% FBS (4 ° C), צנטריפוגות ב ~ 185 גר' ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 13 דקות , ולשאוב supernatant.
    9. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של טרום-warmeבינוני-1 ציפוי ד.
    10. למדוד את הצפיפות של התאים בהתאם לצעד 3.1.13.
    11. לשאוב את חומר הציפוי לחלוטין מcoverslips הזכוכית, וצלחת ~ 50 μl של תאי הגלית resuspended על coverslips.
      הערה: תאים אלה יקימו שכבת מזין גליה.
    12. מניחים את צלחת התרבות עם coverslips בחממה.
    13. 20-60 דקות מאוחר יותר, להוסיף 1 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-1 זה טוב, ומניח את הצלחת בחזרה בחממה. שים לב: בעוד בינוני הציפוי הוא הוסיף, זה יהיה מועיל להשתמש פיפטה נוספת לחץ כלפי מטה בפריפריה של coverslip (שבו אין תאים מצופים), כך שcoverslip לא יצוף במדיום.
    14. יום 1 DIV של שכבת גליה המזין (כלומר, על coverslip הזכוכית), להחליף את המדיום עם 1 מיליליטר של ציפוי מראש חימם בינוני-1, על ידי aspirating כל הפתרון בבאר ולאחר מכן למלא אותו במדיום חדש.
    15. ב2-3 DIV של שכבת מזין גליה כאשר cells הם 80-100% ומחוברות, להוסיף מעכב mitotic (10 μl מתערובת של 5-fluoro-2'-deoxyuridine + uridine; ריכוזים סופיים של 81.2 ו204.8 מיקרומטר, בהתאמה) זה טוב, לעכב שכפול הדנ"א, ולכן ל לדכא התפשטות גליה תאים.
    16. ב7-9 DIV, כאשר התאים% ומחוברות 90-100 (1-2 שעות לפני ציפוי הנוירונים בשכבת מזין גליה), להחליף את התרבות בינונית עם ציפוי מראש חימם בינוני-2 (37 ° C).
      הערה: נוירונים יהיו מצופים באותו היום, תוך שימוש בשלב 3.4.
  3. תרבויות עכברוש גליה
    1. מעיל בקבוק תרבות T25 עם אותו חומר הציפוי.
      הערה: זו היא הכרחית להסרת מאוחר יותר של תאים שאינם חסיד בשלב 3.3.5.
      1. להוסיף 2.0 מיליליטר של חומר הציפוי לבקבוק, ומניח את הבקבוק בחממת התרבות.
      2. לאחר 2-3 שעות, לשאוב את חומר הציפוי לחלוטין, כך שהרצפה של הבקבוק הופכת יבשה.
    2. השג את התאיםמגורי החולדה, על פי שלב 3.1.
      הערה: אזור CA3-CA1 של ההיפוקמפוס משמשת להכנת שכבת מזין גליה חולדה. עם זאת, אזורים אחרים במוח, כגון קליפת המוח וסטריאטום המוחי, יעבדו לאחר ההתאמה להבדלים בצפיפות תאים עקב מספרים ותשואות של תאים מאזורים שונים.
    3. להוסיף ~ 4 מיליליטר של טרום חמם ציפוי בינוני-3 להשעית התא הסופית (~ 1 מיליליטר).
    4. מעביר את ההשעיה התא לתוך בקבוק תרבות T25 המצופה, באמצעות, פיפטה פסטר אש מלוטשת פקוק כותנה. מניחים את הבקבוק בחממת התרבות (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. ב2-3 DIV, כאשר תאים הם 20-40% ומחוברות, להסיר שאינם חסיד או חלש תאים חסיד, על ידי סגירת המכסה בחוזקה, לוחץ את הבקבוק במרץ ~ 10 פעמים, aspirating הפתרון, והוסיף 4-5 מיליליטר של ציפוי בינוניים-3 (ב 4 מעלות צלזיוס). חזור על תהליך זה פעם אחת. לבחון את התאים בתרבית על רצפת הבקבוק השלם (כגון,באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד) כדי לאשר כי אלו המופיעים עצביים (כלומר, אלה שעבורם השפה החיצונית של גוף התא מופיעה שלב בהיר) יוסרו לחלוטין. חזור על התהליך כמה שצריך כדי להסיר תאים אלה, ולאחר מכן להחזיר את הבקבוק לחממה.
      הערה: כוח ואת המספר הכולל של 'יקים' הנדרשים עשויים להיות שונה בין הנסיינים בודדים. הדבר החשוב הוא לא לשמור על המספר הכולל של יקים למספר קבוע, אבל כדי לוודא שתאים כמו נוירון בוטלו.
    6. ב6-8 DIV, כאשר תאים הם 90-100% ומחוברות, מעבר תאי גלייה ידי trypsinizing כמו בשלב 3.2.8.
    7. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), להוסיף 10 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), להעביר את תאי trypsinized לבקבוק T75 מצופה un, והתרבות ב החממה.
      הערה: תאי גליה עכברוש יהיה passaged פעמיים; בניגוד לתאי גליה עכבר arדואר passaged רק פעם אחת כי הם הופכים להיות לא בריאים לאחר מעברים מרובים. תאי גליה עכברוש יהיה passaged בצלוחיות T75 שאינם מצופים בכל חומר ציפוי. הציפוי מאפשר לתאי גליה העכברוש לגדול מהר מדי ויניבו הרבה תאי ריסי (תאי ependymal משוערים), שידרדרו את מצב התרבות העצבי מאוחר יותר.
    8. ב17-19 DIV של תרבות גליה בבקבוק (כלומר, 11 ימים לאחר passaging ויום אחד לפני trypsinization וציפוי על coverslips על ידי צעדים 3.3.9-3.3.14), מקומו של חומר הציפוי 100 μl על coverslips זכוכית רחוץ ( עגול, קוטר 12 מ"מ) בצלחת תרבות, והנח את המנה התרבות בחממת התרבות.
      הערה: לתרבויות גליה חולדה, הבדל לא היה שם לב בתוצאות התרבות עם או בלי לשטוף את coverslips.
    9. ב18-20 DIV של תרבות גליה בבקבוק (כלומר, 12 ימים לאחר passaging), להכין את שכבת מזין גליה ידי trypsinizing התאים בתרבית, על פי step 3.2.8.
    10. במהלך צנטריפוגה, לשאוב חומר הציפוי לחלוטין מcoverslips הזכוכית.
    11. לאחר צנטריפוגה, resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C), ולמדוד את צפיפות התאים, על פי שלב 3.1.13.
    12. התאם את צפיפות גליה עד 10 4 תאים / מיליליטר בשידור חי, וצלחת של ההשעיה תא גליה 100 μl על coverslips הזכוכית המצופה.
      הערה: תאים אלה יקימו שכבת מזין גליה.
    13. מניחים את צלחת התרבות עם coverslips לתוך החממה ל20-60 דקות.
    14. הוסף 1 מיליליטר של ציפוי בינוני-3 (4 ° C) זה טוב, ומניח את הצלחת בחזרה בחממה.
    15. ב-3-4 DIV של שכבת מזין גליה, כאשר התאים על coverslip הם 40-80% ומחוברות, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום הגידול מראש התחמם (ראה טבלה 1 לרכב) המכיל ציטוזין β-D-arabinofuranoside ( ARAÇ, ריכוז סופי של 4 מיקרומטר) כדי לעצור את התפשטות גליה תאים. נוירון צלחתים ב7-9 DIV של שכבת מזין גליה כאשר התאים 60-80% ומחוברות, באמצעות צעד 3.4.
  4. תרבויות עכבר עצביים
    1. עכברים שזה עתה נולד לייבל וגנוטיפ לפי שלבי 1 ו -2.
    2. השתמש בגורי העכבר לשלב 3.1.
    3. התאם את הצפיפות של השעיה לחיות תאים ל~ 2.0 x 10 5 מיליליטר תאים / באמצעות ציפוי בינוני 2 לציפוי בתאי גליה עכבר, או באמצעות מראש חימם ציפוי בינוני-3 לציפוי בתאי גליה חולדה.
    4. צלחת התאים בשכבת מזין גליה, על ידי הוספה בעדינות את ההשעיה התא הבינוני התרבות של כל אחד. הערה: הנפח של ההשעיה התא שיש להוסיף שייקבע על ידי מספר היעד של תאים בתרבות היטב. לדוגמא, צלחת ~ 60 μl של השעיה תא להשיג 12,000 תאים / טובה.
    5. שים לב שלא חלו שינויי פתרון נחוצים לאחר נוירונים הם מצופים. להיות זהיר, כדי למנוע אידוי של הפתרון מהבארות במהלך התרבות, על ידי humidifying o בתוךf תרבות החממה.

תוצאות

כדוגמא ליישום של פרוטוקול זה, תוצאות נציג מוצגות לתיוג עכברים על ידי קעקוע, genotyping אמין תחת תנאי ניסוי שונים, והקמת תרבויות עצביות עיקריות בשכבות מזין גליה.

קִעקוּעַ

יילוד גורים תויג?...

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן כולל נהלים לקעקוע לתייג / לזהות עכברים, לgenotyping עכברים מטיפי זנב, ולתאי עצב במוח עכבר culturing בצפיפות נמוכה. בסיבוב ניסויים באמצעות 6-8 גורים אחד, נהלים אלה בדרך כלל דורשים ~ 0.5 שעות, ~ 4 שעות ו~ 2 שעות, בהתאמה, על סך של 6-7 שעות. זה עושה את זה מעשי לניסוי אחד כד?...

Disclosures

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Acknowledgements

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGSee comments section of uridine for more information.
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 mlBD falcon353136
Conical Tube, polypropylene, 15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Distilled waterGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUStock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)Sigma-AldrichH3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagentSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitric AcidVWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 prepared in the labSource: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾” Fisher13-678-6AUse this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9” Fisher13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Serological pipet, 2 mlBD falcon357507
Serological pipet, 5 ml BD falcon357543
Serological pipet, 10 mlBD falcon357551
Serological pipet, 25 mlBD falcon357525
Serological pipet, 50 ml BD falcon357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basisSigma-Aldrich480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XISigma-AldrichT1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktailMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO–9This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GTBIO–RAD170–4405Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUOur PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, CountessGIBCO-InvitrogenC10310This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water JacketNUAIRENU-4850
Horizontal Clean BenchNUAIRENU-201-330This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

References

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. , 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M., Banker, G., Goslin, K. . Ch. 18. Culturing Nerve Cells. , 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience95AP2PCRtorsinA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved