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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo le procedure per l'etichettatura e la genotipizzazione topi appena nati e di generare colture neuronali primarie da loro. La genotipizzazione è rapido, efficiente ed affidabile, e consente l'estrazione automatica acidonucleico. Ciò è particolarmente utile per i mouse neonatale letali e le loro culture, che richiedono la preventiva realizzazione di genotipizzazione.

Abstract

Analisi ad alta risoluzione della morfologia e funzione dei neuroni di mammifero richiede spesso la genotipizzazione dei singoli animali seguita dall'analisi di colture primarie di neuroni. Descriviamo una serie di procedure per: etichettatura topi appena nati per essere sottoposti a genotipizzazione, rapida genotipizzazione, e stabilire le culture a bassa densità di neuroni del cervello di questi topi. Topi individuali sono etichettati da tatuaggio, che permette l'identificazione a lungo termine della durata in età adulta. La genotipizzazione del protocollo descritto è veloce ed efficiente, e consente l'estrazione automatica di acidi nucleici con buona affidabilità. Ciò è utile in circostanze in cui il tempo sufficiente per la genotipizzazione convenzionale non è disponibile, per esempio, in topi che soffrono di letalità neonatale. Colture neuronali primarie sono generati a bassa densità, che permette esperimenti di imaging ad alta risoluzione spaziale. Questo metodo di coltura richiede la preparazione di strati di alimentazione gliali prima placcatura neuronale. Il pROTOCOLLO è applicata nella sua interezza ad un modello murino della distonia disturbo del movimento DYT1 (AE-torsinA topi knock-in), e colture neuronali sono preparati dal ippocampo, corteccia cerebrale e striato di questi topi. Questo protocollo può essere applicato a topi con altre mutazioni genetiche, nonché di altre specie animali. Inoltre, i singoli componenti del protocollo possono essere utilizzati per isolati sotto-progetti. Così questo protocollo avrà applicazioni larghe, non solo nel campo delle neuroscienze, ma anche in altri settori delle scienze biologiche e mediche.

Introduzione

Modelli di roditori di malattie genetiche sono dimostrati utili per stabilire le funzioni fisiologiche di proteine ​​normali e acidi nucleici, così come le conseguenze fisiopatologiche di difetti di questi. Gli esempi includono topi deficienti per proteine ​​coinvolte in funzioni cellulari chiave, così come i modelli murini di malattie come il morbo di Alzheimer. Tuttavia, alcune manipolazioni genetiche possono portare a letalità neonatale poco o pochi giorni dopo la nascita. In questi casi, colture primarie sono uno strumento importante perché le cellule vive sono disponibili presso i cuccioli embrionali o neonatali prima della morte, possono essere mantenute per almeno un paio di settimane in vitro, e in questo periodo precoce dello sviluppo neuronale può essere seguito da esperimenti biochimici, funzionali e morfologiche. Per le colture primarie, può essere utile al piatto i neuroni a bassa densità; ciò rende possibile visualizzare il somata individuale, dendriti, alberi assonale e nervo Termisegnali ad alta risoluzione spaziale. Tuttavia, la sopravvivenza e la differenziazione dei neuroni a bassa densità richiede tipicamente che sono piastrate su uno strato alimentatore gliali, co-coltura con cellule gliali in assenza di contatto fisico con loro, o coltivati ​​in terreno condizionato dalla glia 1.

La creazione di colture neuronali bassa densità su strati di alimentazione gliali può dipendere genotipizzazione veloce e affidabile anticipo - entro poche ore a differenza di alcuni giorni. La velocità è particolarmente importante quando il genotipo neuronale deve essere abbinato a quello di uno strato alimentatore gliali preparato. Come esempio più pratico, può essere necessario decidere quali cuccioli di genotipo che da utilizzare nelle culture generano, per ottimizzare l'efficienza di un esperimento.

Qui mostriamo il protocollo di lavoro che è stato usato per un veloce, semplificato e affidabile genotipizzazione del mouse in precedenti pubblicazioni 2-6. Mouse e codeun kit disponibile in commercio vengono utilizzati. Questo protocollo comprende un'unica fase di estrazione degli acidi nucleici dal tessuto, e non richiede né una purificazione passo-acido nucleico, né l'uso di un tampone di terminazione ('fermata soluzione'). L'affidabilità di questo metodo genotipizzazione è illustrato presentando i risultati di una serie di prove in cui le differenze sono introdotte rispetto alla quantità iniziale di campioni, l'età degli animali e la lunghezza degli ampliconi PCR. Questo kit offre i vantaggi di estrazione e affidabilità automatizzato.

Per motivi di essere completa, l'uso di tatuaggi per l'identificazione a lungo termine dei topi genotipizzati è anche dimostrato. Il tatuaggio viene ottenuto applicando inchiostro tatuaggio al derma della pelle (sotto l'epidermide) 7. Una procedura è descritta per tatuaggi i cuscinetti delle zampe di topi neonati o di 1 giorno, anche se tatuaggi possono essere applicati ad altre parti del corpo, come code e dei piedi, e Animals di tutte le età. Inoltre, sarà dimostrato procedure per la placcatura e coltivando neuroni di topo a bassa densità, basato sulla preparazione ottimale di diversi tipi di strati di alimentazione gliali 2,8.

Usiamo un modello genetico del mouse della malattia neurologica ereditaria DYT1 distonia - una malattia autosomica dominante movimento causata da una mutazione nel gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. La proteina codificata, torsinA, appartiene alle "ATPases associati alle diverse attività cellulari" (AAA +) famiglia di proteine, i cui membri generalmente eseguire funzioni chaperone-like, che assiste in: proteine ​​unfolding, proteina-complesso smontaggio, il traffico di membrana, e la fusione delle vescicole 10-13. I risultati mutazione in un in-frame delezione di un codone dell'acido glutammico, e possono portare alla manifestazione di 'insorgenza precoce generalizzata isolato distonia' 14,15. Tuttavia, il percorsomeccanismi ophysiological responsabili di questo disturbo rimangono poco conosciuti. In un modello di topo knock-in, l'allele mutante è TOR1A tm2Wtd, citato qui di seguito come TOR1A AE. Eterozigoti AE-torsinA knock-nei topi sono pazienti umani vitali e geneticamente mimici con DYT1 distonia, mentre omozigote knock-in topi muoiono dopo la nascita 16,17, con la latenza di morte post-natale colpiti da background genetico 18. La morte precoce di omozigoti topi knock-in richiede che sia la genotipizzazione degli animali e la creazione di colture neuronali sono concluse rapidamente. Come altro esempio di genotipizzazione, Tfap2a (fattore di trascrizione AP-2α, attivando legame con le proteine ​​2α enhancer) sarà utilizzato. La proteina codificata da questo gene è importante nella regolazione più processi cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione, la sopravvivenza e apoptosi 19.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Iowa.

Identificazione 1. a lungo termine di topi mediante tatuaggio dei cuscinetti delle zampe

  1. Immobilizzare una zampa con il pad della zampa (superficie plantare) rivolta verso lo sperimentatore. Tenere la zampa con il pollice e il dito indice. Fare attenzione a non schiacciare la zampa.
    NOTA: l'immobilizzazione Stable è importante garantire che il pigmento tatuaggio è posizionato nel derma del pad zampa, e quindi è permanente 7.
  2. Tampone il pad zampa con il 70% di etanolo su una garza o un tampone.
  3. Applicare l'olio della pelle ad un applicatore con punta di cotone, e premere delicatamente la punta contro la superficie del pad zampa più volte. Utilizzare solo una piccola quantità di olio di pelle; quando presente in grande quantità, impedisce il pigmento tatuaggio di raggiungere la pelle.
  4. Immergere le punte degli aghi per tatuaggio nell'inchiostro tatuaggio appena primaal tatuaggio. Utilizzare pulita, asettica e aghi tatuaggi appuntiti, per diminuire il dolore e la possibilità di infezione, e anche per aumentare l'efficienza tatuaggi.
  5. Mentre la superficie pad zampa è coperto con l'olio della pelle, premere punte degli aghi tatuaggio verticale e leggermente contro la pelle nel centro del pad zampa, e iniettare l'inchiostro più volte. Vedere tabella dei materiali / Attrezzature per informazioni sul sistema tatuaggio elettrico.
  6. Spray 70% di etanolo in una garza, premere delicatamente contro la zampa per rimuovere il pigmento tatuaggio in più sulla superficie della pelle, e controllare la qualità del tatuaggio. Controllare che la metà del pad zampa ha una, macchia rotonda scura che si differenzia dal normale pigmentazione della pelle. Se il tatuaggio non è scuro o abbastanza grande per una facile visualizzazione, ripetere i passaggi precedenti tatuaggi.

2. Mice genotipizzazione Newborn Utilizzando una veloce Kit PCR Genotipizzazione

  1. Disinfettare l'estremità distale di una coda di topo con il 70% di etanolo, tagliare 5 mm o meno della codapunta e trasferirlo ad un tubo di una striscia 8 tubo del tipo usato per la PCR. Utilizzare una lama di rasoio un-utilizzato per ogni cucciolo di evitare la contaminazione incrociata tra i campioni. In alternativa, utilizzare un paio di forbici, ma in questo caso, con attenzione e rimuovere completamente il tessuto rimanente sulle lame utilizzando 70% di etanolo. Verificare la presenza di sanguinamento. Se si verifica sanguinamento, applicare pressione alla porzione di taglio della coda con una garza fino sanguinamento si è fermato.
  2. Aggiungere 200 ml di DNA Extraction Solution ad ogni provetta PCR contenente un esemplare. Vedere tabella dei materiali / Attrezzature per la sua composizione e le informazioni sul kit.
  3. Posizionare la striscia tubo in un termociclatore PCR, e inizia l'estrazione del DNA utilizzando il seguente programma: 1 ciclo a 55 ° C per 10 min, 1 ciclo a 95 ° C per 10 min, e mantenimento a 4 ° C.
    NOTA: Questo è lo stesso termociclatore PCR che viene poi utilizzato per la PCR.
  4. Dopo l'estrazione del DNA, rimuovere la striscia tubo dal cycler una termicand capovolgere 5 volte.
  5. Trasferire 4 ml di soluzione (estratto di DNA) di ciascun campione di una non-utilizzato tube di una striscia a 8-tube, e mescolare con: 10 ml di 2X PCR Ready Mix II, 2 ml di misto in avanti e indietro primer (consigliato a 0,5 m; vedi tabella dei materiali / attrezzature per le sequenze), e 4 ml di priva di nucleasi H 2 O, per ogni campione. Spin brevemente (ad esempio, 3 sec) utilizzando una centrifuga da tavolo. Tenere le provette su ghiaccio in ogni momento tranne durante la manipolazione.
  6. Effettuare cicli termici. Vedere Tabella dei materiali / attrezzature per il programma termico.
  7. Rileva i prodotti di DNA amplificati. Caricare la soluzione totale reazione della PCR (20 microlitri) direttamente in un pozzetto di un gel di agarosio. Caricare i marcatori di peso molecolare in un pozzo separato. Applicare un campo elettrico.
  8. Acquisire le immagini di fluorescenza di bande sotto la luce ultravioletta.

3. Cultura primario di topo cervello Neurons su Glial Feeder livello

NOTA: Le procedure per la dissezione del cervello e la dissociazione delle cellule (3.1) sono comuni a tutte le procedure successive. Le procedure per le culture del mouse gliali (3.2), culture di ratto gliali (3.3), e colture neuronali di topo (3.4) sono descritti separatamente in seguito.

  1. Cervello Dissection e Cellular Dissocaiation
    1. Sacrifica un mouse o piccoli dei ratti per decapitazione, rimuovere rapidamente il cervello, e metterlo nella soluzione Hanks '(vedi Tabella 1 per la composizione) + 20% di siero fetale bovino (FBS) in un piatto 35 mm (tenuti in ghiaccio).
    2. Tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi. Rimuovere la regione di interesse (ad esempio, corteccia cerebrale, striato e nell'ippocampo) da ciascun emisfero del cervello. Rimuovere le meningi e dei grandi vasi sanguigni dalla superficie. Tagliare la regione del cervello in 4-10 fette sottili con una lama chirurgica.
    3. Sciacquare le fettine di cervello in un tubo di centrifugazione 15 ml, una volta wit'soluzione + 20% FBS, poi 3 volte con il Hanks' h Hanks soluzione (cioè, senza siero) (tutti a 4 ° C). Per lavare, aggiungere la soluzione 5-10 ml, lasciare che il cervello fette depositano sul fondo della provetta, aspirare la soluzione dall'alto, e aggiungere una soluzione fresca. Terminare la procedura di lavaggio aspirando la soluzione.
    4. Filtrare 2 ml della soluzione di digestione-tripsina contenente (vedi Tabella 1 per la composizione) usando una siringa 3 ml e un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente nel tubo contenente le fette di cervello. Lasciate che la tripsinizzazione proseguire per 13 minuti a temperatura ambiente.
    5. Neutralizzare la soluzione tripsina prima aspirando la maggior parte di esso e poi aggiungendo 7-10 ml di soluzione di Hanks '+ 20% FBS (4 ° C).
    6. Risciacquare le fette di cervello, due volte con Hanks 'soluzione + 20% FBS, e quindi tre volte con il Hanks' soluzione (ovvero senza siero) (tutti a 4 ° C). Terminare la procedura di lavaggio aspirando il solution.
    7. Filtrare 2 ml della soluzione di dissociazione (vedi Tabella 1 per la composizione) usando una siringa 3 ml e un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente al tubo con le fette di cervello.
    8. Meccanicamente dissociare le cellule triturando delicatamente 10-20 volte, fino pezzi di tessuto visibili scompaiono. Utilizzare un cotton-collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur e evitare di fare bolle durante la triturazione.
    9. Attendere 3 minuti per i piccoli pezzi di stabilirsi.
    10. Trasferire la maggior parte della soluzione (~ 1,5 ml, lasciando qualche soluzione in basso) ad un tubo 15 ml centrifugazione contenente soluzione FBS 3 ml di soluzione Hanks '+ 20% (4 ° C), utilizzando il cotone collegato, antincendio lucidato pipetta Pasteur. Non trasferire tutta la soluzione per l'inserimento di sedimenti sul fondo si traduce tipicamente in un deterioramento della cultura.
    11. Centrifugare per 13 min a ~ 185 g (~ 1.100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirare il surnatante con delicatezza,aggiungere 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio (37 ° C) al pellet e risospendere esso pipettando delicatamente più volte utilizzando il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur.
      NOTA: Tre diversi tipi di placcatura media sono utilizzati per scopi culturali diversi: placcatura medio-1 per le cellule gliali del mouse, placcatura medio-2 per i neuroni di topo, e placcatura medio-3 per i neuroni di ratto e cellule gliali (vedi Tabella 1 per composizioni) .
    13. Estrarre 10 ml di sospensione cellulare, mescolare con 10 ml di 0,4% trypan soluzione blu, e misurare la densità di cellule vive, utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
  2. Culture del mouse gliali
    1. Lavare i coprioggetti per aiutare a stabilire colture sane di cellule di topo.
      1. Immergere vetrini (tondo, diametro 12 mm) nel 70% di acido nitrico in una capsula di Petri di vetro. Proteggere dalla luce utilizzando un foglio di alluminio, e posizionarlo su un orbitale shaker O / N.
      2. Sciacquare il coversli vetrops nella capsula Petri almeno tre volte con acqua distillata. Immergerle in acqua distillata. Porre la capsula in un orbitale shaker O / N.
      3. Asciugare i coprioggetti su un Whatman 150 millimetri carta da filtro nella cappa di sicurezza biologica.
      4. Autoclave i coprioggetti.
      5. Posizionare i coprioggetti in 24 ben piatto cultura.
    2. Label e genotipo topi neonati secondo i punti 1 e 2.
    3. Ottenere le cellule cerebrali dai cuccioli di topo, secondo step 3.1.
      NOTA: L'uso della corteccia cerebrale è tipico per preparare lo strato alimentatore gliali mouse. Tuttavia, altre regioni del cervello, come l'ippocampo e striato, lavoreranno dopo una corretta regolazione della densità delle cellule a causa di diversi numeri e dei rendimenti delle cellule provenienti da diverse regioni.
    4. Aggiungere ~ 4 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1 alla sospensione cellulare finale (~ 1 ml). Per pre-riscaldamento coltura, posizionare la soluzione nell'incubatrice coltura (5% CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, perconsentono i valori di temperatura e di pH per stabilizzare.
    5. Trasferire la sospensione cellulare a un pallone di coltura T25 non patinata, con il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur. Porre il pallone nell'incubatrice cultura.
    6. A 1 giorno vitro (DIV), lavare le cellule in coltura nel pallone T25 due volte con placcatura medio-1 (4 ° C). Porre il pallone nuovamente dentro l'incubatrice. Eseguire risciacquo aspirando il mezzo all'interno del pallone completamente con una pipetta Pasteur, aggiungendo ~ 5 ml di mezzo fresco e inclinando leggermente il pallone più volte in un movimento vorticoso.
    7. A 6-9 DIV, (vale a dire, un giorno prima tripsinizzazione e placcatura su vetrini, in fasi 3.2.8-3.2.13), posto a 100 ml di materiale di rivestimento con proteine ​​della matrice extracellulare (vedi Tabella dei materiali / Attrezzature per commenti su il materiale di rivestimento) sui vetrini in un piatto cultura, e posizionare il piatto cultura nell'incubatrice cultura.
    8. A 7-10 DIV, quando le cellule sono 20-40% confluenti (spazialmente continuo), li trypsinize.
      1. Risciacquare il pallone volta, aspirando tutta la soluzione nel matraccio e aggiungendo ~ 13 ml di soluzione di Hanks '(4 ° C), inclinare leggermente il pallone più volte in un moto vorticoso, e aspirare completamente la soluzione.
      2. Aggiungere 40 ml di soluzione di DNasi (concentrazione finale, 750 unità / ml) a 4 ml soluzione tripsina-EDTA, passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron, e aggiungere il filtrato direttamente alle cellule nel matraccio.
      3. Sia la tripsinizzazione procedere per 13 min a 37 ° C in incubatore.
      4. Neutralizzare la soluzione tripsina aggiungendo 2 ml di 100% FBS (4 ° C) al pallone.
      5. Trasferire le cellule trypsinized ad un tubo 15 ml centrifugazione utilizzando un 5- 10 ml pipetta, aggiungere ~ 4 ml di soluzione di Hanks '+ 20% FBS (4 ° C), centrifugare a ~ 185 ge 4 ° C per 13 min , e aspirare il surnatante.
    9. Risospendere il pellet in 1 ml di pre-warmed placcatura medio-1.
    10. Misurare la densità delle cellule secondo la fase 3.1.13.
    11. Aspirare il materiale di rivestimento completamente dalle vetrini, e piastra ~ 50 ml di cellule gliali risospese su vetrini.
      NOTA: Queste cellule stabiliranno strato alimentatore gliali.
    12. Posizionare il piatto cultura con coprioggetto nell'incubatrice.
    13. 20-60 minuti più tardi, aggiungere 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1 ad ogni bene, e mettere il piatto posteriore nell'incubatrice. Nota: Mentre viene aggiunto il mezzo di placcatura, sarà utile utilizzare un'altra pipetta per premere verso il basso la periferia del vetrino (dove non ci sono cellule piastrate), in modo che il coprioggetto non galleggiare nel mezzo.
    14. A 1 DIV dello strato alimentatore gliali (cioè sul vetrino di vetro), sostituire il mezzo con 1 ml di pre-riscaldato placcatura medio-1, aspirando tutta la soluzione in un pozzo e poi riempire con terreno fresco.
    15. A 2-3 DIV dello strato alimentatore gliali quando il cells sono 80-100% confluenti, aggiungere inibitore mitotico (10 ml di una miscela di 5-fluoro-2'-deossiuridina + uridina; concentrazioni finali di 81,2 e 204,8 mM, rispettivamente) in ciascun pozzetto, per inibire la replicazione del DNA e quindi sopprimere la proliferazione cellule gliali.
    16. A 7-9 DIV, quando le cellule sono 90-100% confluenti (1-2 hr prima placcatura neuroni sullo strato alimentatore gliali), sostituire il terreno di coltura con pre-riscaldato placcatura medio-2 (37 ° C).
      NOTA: I neuroni saranno placcato lo stesso giorno, con passo 3.4.
  3. Culture Rat gliali
    1. Coat un pallone di coltura T25 con lo stesso materiale di rivestimento.
      NOTA: Questo è necessario per la successiva rimozione delle cellule non aderenti al punto 3.3.5.
      1. Aggiungere ml 2,0 del materiale di rivestimento nel pallone, e mettere il pallone in incubatrice cultura.
      2. Dopo 2-3 ore, aspirare il materiale di rivestimento completamente, in modo che il pavimento del pallone diventa secca.
    2. Ottenere le celluledai cuccioli di ratto, in base al punto 3.1.
      NOTA: La regione CA3-CA1 dell'ippocampo viene usato per preparare lo strato alimentatore gliali di ratto. Tuttavia, altre regioni del cervello, come la corteccia cerebrale e striato, lavoreranno dopo aggiustamento per differenze di densità cellulari dovuti a diversi numeri e rese di cellule provenienti da diverse regioni.
    3. Aggiungere ~ 4 ml di pre-riscaldato placcatura medio 3 alla sospensione cellulare finale (~ 1 ml).
    4. Trasferire la sospensione cellulare nel pallone cultura T25 rivestito, utilizzando il cotone collegato, incendio lucidato pipetta Pasteur. Porre il pallone in incubatrice cultura (5% di CO 2 -95% O 2, 37 ° C).
    5. A 2-3 DIV, quando le cellule sono 20-40% confluenti, rimuovere non aderente o debolmente cellule aderenti, chiudendo il coperchio a tenuta, agitando vigorosamente ~ 10 volte, aspirando la soluzione, e aggiungendo 4-5 ml di placcatura medio-3 (a 4 ° C). Ripetere questa procedura una volta. Esaminare le cellule coltivate in tutto l'intero piano pallone (ad esempio,con microscopio a contrasto di fase) per confermare che quelle che sembrano neuronale (cioè, quelli per cui il bordo esterno del corpo cellulare appare fase luminoso) vengono completamente rimosso. Ripetere la procedura con la frequenza necessaria per eliminare queste cellule, e quindi riportare il pallone al incubatrice.
      NOTA: La forza e il numero totale di "shakes" necessarie possono differire tra i singoli sperimentatori. La cosa importante è non mantenere il numero totale di frullati ad un numero fisso, ma per confermare che le cellule neuronali-simili sono eliminati.
    6. A 6-8 DIV, quando le cellule sono 90-100% confluenti, il passaggio delle cellule gliali di loro trypsinizing come al punto 3.2.8.
    7. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), aggiungere 10 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), trasferire le cellule trypsinized a un pallone T75 un-rivestito, e cultura l'incubatore.
      NOTA: le cellule gliali di ratto saranno diversi passaggi due volte; in contrasto con le cellule gliali del mouse are diversi passaggi solo una volta perché diventano malsano dopo più passaggi. Cellule Rat gliali saranno diversi passaggi in fiasche T75 non rivestiti con qualsiasi materiale di rivestimento. Il rivestimento permette alle cellule di ratto gliali a crescere troppo in fretta e producono molte cellule ciliate (putativi cellule ependimali), che deteriorano la condizione cultura neuronale tardi.
    8. A 17-19 DIV della cultura gliali in una beuta (cioè, 11 giorni dopo passaging e un giorno prima tripsinizzazione e placcatura su coprioggetto da gradini 3.3.9-3.3.14), posizionare 100 ml di materiale di rivestimento su vetrini lavate ( tondo, diametro 12 mm) in un piatto di cultura, e posizionare il piatto cultura nell'incubatrice cultura.
      NOTA: Per le culture gliali di ratto, la differenza non è stata notata nei risultati della coltura, con o senza lavare i coprioggetti.
    9. A 18-20 DIV della cultura gliali in un pallone (cioè 12 giorni dopo passaging), preparare lo strato alimentatore gliali dalle trypsinizing cellule coltivate, secondo step 3.2.8.
    10. Durante la centrifugazione, aspirare il materiale di rivestimento completamente dalle vetrini.
    11. Dopo centrifugazione, risospendere il pellet in 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C), e misurare la densità cellulare, secondo la fase 3.1.13.
    12. Regolare la densità gliali a 10 4 vivo cellule / ml, e piastra 100 microlitri della sospensione cellulare gliale sui vetrini rivestiti.
      NOTA: Queste cellule stabiliranno strato alimentatore gliali.
    13. Posizionare il piatto cultura con lamelle in incubatore per 20-60 min.
    14. Aggiungere 1 ml di placcatura medio-3 (4 ° C) per ciascun bene, e mettere il piatto posteriore nell'incubatrice.
    15. A 3-4 DIV dello strato alimentatore gliali, quando le cellule sul vetrino sono 40-80% confluenti, aggiungere 1 ml di mezzo di crescita pre-riscaldato (vedi Tabella 1 per la composizione) che contiene citosina β-D-arabinofuranoside ( AraC, concentrazione finale di 4 micron) per arrestare la proliferazione gliale cellule. Piastra neurones a 7-9 DIV dello strato alimentatore gliali quando le cellule sono 60-80% confluenti, usando passo 3.4.
  4. Culture del mouse neuronali
    1. Label e genotipo topi neonati secondo i punti 1 e 2.
    2. Utilizzare i cuccioli di topo per passo 3.1.
    3. Regolare la densità della sospensione live-cell a ~ 2,0 x 10 5 cellule / ml utilizzando preriscaldata placcatura medio-2 per la placcatura sulle cellule gliali del mouse, o mediante placcatura medio-3 per la placcatura sulle cellule gliali di ratto.
    4. Piastra le cellule sullo strato alimentatore gliali, aggiungendo delicatamente la sospensione cellulare al mezzo di coltura di ogni pozzetto. Nota: Il volume della sospensione cellulare da aggiungere sarà determinato dal numero di celle di destinazione in una cultura ben. Ad esempio, piastra ~ 60 ml di sospensione cellulare per raggiungere 12.000 cellule / pozzetto.
    5. Si noti che nessuna modifica soluzione sono necessari dopo che i neuroni sono placcati. Fare attenzione per evitare l'evaporazione della soluzione dai pozzetti nel corso della coltura, da umidificazione o all'internof incubatore cultura.

Risultati

Come esempio di applicazione di questo protocollo, risultati rappresentativi sono mostrati per etichettare topi tatuaggi, genotipizzazione affidabile in varie condizioni sperimentali, e stabilendo colture neuronali primarie su strati di alimentazione gliali.

Tatuaggio

Cuccioli appena nati sono stati etichettati sui cuscinetti delle zampe utilizzando un sistema tatuaggi ('Newborn' in Figura 1). Le etichette sono rimasti ch...

Discussione

Il protocollo presentato qui comprende procedure per tatuaggi per etichettare / individuare i topi, per la genotipizzazione topi da punte di coda, e per la coltura neuroni del cervello del mouse a bassa densità. In un giro di esperimenti usando 6-8 cuccioli, queste procedure richiedono tipicamente ~ 0,5 ore, ~ 4 ore e ~ 2 ore, rispettivamente, per un totale di 6-7 ore. Questo rende pratico per un singolo sperimentatore per completare tutte le procedure necessarie dal momento della nascita i cuccioli 'del fasciame d...

Divulgazioni

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Riconoscimenti

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGSee comments section of uridine for more information.
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 mlBD falcon353136
Conical Tube, polypropylene, 15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Distilled waterGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUStock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)Sigma-AldrichH3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagentSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitric AcidVWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 prepared in the labSource: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾” Fisher13-678-6AUse this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9” Fisher13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Serological pipet, 2 mlBD falcon357507
Serological pipet, 5 ml BD falcon357543
Serological pipet, 10 mlBD falcon357551
Serological pipet, 25 mlBD falcon357525
Serological pipet, 50 ml BD falcon357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basisSigma-Aldrich480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XISigma-AldrichT1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktailMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO–9This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GTBIO–RAD170–4405Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUOur PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, CountessGIBCO-InvitrogenC10310This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water JacketNUAIRENU-4850
Horizontal Clean BenchNUAIRENU-201-330This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

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