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Resumo

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

Resumo

A análise de alta resolução da morfologia e função de neurónios de mamífero, muitas vezes requer a genotipagem de cada animal seguindo-se a análise de culturas primárias de neurónios. Nós descrevemos um conjunto de procedimentos para: rotulando camundongos recém-nascidos para ser genotipados, genotipagem rápida, e estabelecendo culturas de baixa densidade de neurônios do cérebro desses ratos. Ratinhos individuais são marcadas por tatuagem, o que permite a identificação de longo prazo duradoura na idade adulta. A genotipagem por o protocolo descrito é rápido e eficaz, e permite a extracção automática de ácido nucleico com uma boa fiabilidade. Isso é útil em circunstâncias em que o tempo suficiente para a genotipagem convencional não está disponível, por exemplo, em ratos que sofrem de letalidade neonatal. Culturas neuronais primárias são gerados em baixa densidade, que permite experimentos com imagens em alta resolução espacial. Este método de cultura requer a preparação de camadas alimentadoras gliais antes de plaqueamento neuronal. O protocolo é aplicado em sua totalidade para um modelo do rato da distonia distúrbio do movimento DYT1 (AE-torsinA knock-nos ratos), e as culturas neuronais são preparados a partir do hipocampo, córtex cerebral e estriado destes ratos. Este protocolo pode ser aplicado aos ratos com outras mutações genéticas, bem como de outras espécies animais. Além disso, os componentes individuais do protocolo pode ser utilizado para sub-projectos isolados. Assim, este protocolo terá amplas aplicações, não só no campo da neurociência, mas também em outros campos das ciências biológicas e médicas.

Introdução

Modelos de roedores de doenças genéticas provaram útil para estabelecer as funções fisiológicas normais de proteínas e ácidos nucleicos, bem como as consequências de fisiopatológicos defeitos nestes. Exemplos incluem ratos deficientes para proteínas envolvidas em funções celulares essenciais, bem como modelos de rato de desordens tais como doença de Alzheimer. No entanto, certas manipulações genéticas podem levar a letalidade neonatal pouco ou alguns dias após o nascimento. Nestes casos, as culturas de células primárias são um instrumento importante porque as células vivas podem ser obtidos a partir dos filhotes embrionários ou neonatais antes da morte, que podem ser mantidos durante pelo menos algumas semanas in vitro, e durante este tempo o desenvolvimento neuronal precoce pode ser seguido pela experiências bioquímicas, funcionais e morfológicas. Para as culturas primárias, ela pode ser benéfica para os neurónios em placa de baixa densidade; isso faz com que seja possível visualizar a somata indivíduo, dendrites, eixos axonal e termi nervonais em alta resolução espacial. No entanto, a sobrevivência e diferenciação de neurónios a baixa densidade, tipicamente requer que eles são plaqueadas numa camada alimentadora de células gliais, a co-cultura com células gliais, na ausência de contacto físico com eles, ou cultivadas em meio condicionado por células gliais 1.

O estabelecimento de culturas neuronais de baixa densidade em camadas alimentadoras gliais pode ser dependente de genotipagem rápida e fiável de antemão - dentro de algumas horas, em contraste com alguns dias. A velocidade é especialmente importante quando o genótipo neuronal precisa de ser compensada com o de uma camada alimentadora glial preparado de antemão. Como um exemplo mais prático, pode ser necessário decidir qual das crias que genótipo de usar na geração de culturas, para optimizar a eficiência de uma experiência.

Aqui demonstramos o protocolo de trabalho que tenha sido utilizado para rápido, simplificado e fiável genotipagem rato em publicações anteriores 2-6. Rabos de rato eum kit disponível comercialmente são usados. Este protocolo inclui a extracção de passo único de ácidos nucleicos a partir do tecido, e não exige nem um passo de purificação de ácido nucleico que nem o uso de um tampão de terminação ('solução parar'). A fiabilidade deste método de genotipagem é ilustrada, apresentando os resultados de uma série de testes em que são introduzidas diferenças no que diz respeito à quantidade de partida das amostras, a idade dos animais e do comprimento dos produtos de amplificação de PCR. Este kit oferece as vantagens de extracção e fiabilidade automatizado.

Por causa de ser abrangente, a utilização de tatuagem para identificação de longo prazo dos ratinhos cujo genótipo é também demonstrada. A tatuagem é conseguido pela aplicação de tinta para tatuagem a derme da pele (epiderme sob as) 7. Um procedimento é descrito para tatuar as almofadas das patas de ratos recém-nascidos ou 1 dias de idade, embora tatuagens pode ser aplicado a outras partes do corpo, tais como as caudas e os dedos do pé, e a Animals de todas as idades. Além disso, os procedimentos será demonstrada para o plaqueamento e a cultura de neurónios de rato, a uma densidade baixa, com base na preparação optimizado de diferentes tipos de camadas alimentadoras gliais 2,8.

Nós usamos um modelo genético do rato da desordem neurológica DYT1 distonia herdada - uma desordem de movimento autossômica dominante, causada por uma mutação no gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. A proteína codificada, torsinA, pertence aos "ATPases associadas a diversas atividades celulares" (AAA +) família de proteínas, cujos membros geralmente desempenham funções semelhantes a chaperonas, auxiliando em: proteínas que se desdobram, desmontagem proteína do complexo, o tráfico de membrana e fusão das vesículas 10-13. Os resultados de mutação em uma deleção em enquadramento de um codão para ácido glutâmico, e pode conduzir a manifestação de "início precoce generalizada isolado distonia '14,15. No entanto, o caminhomecanismos ophysiological responsáveis ​​por esta desordem permanecem pouco compreendidos. Em um modelo de rato knock-in, o alelo mutante é Tor1a tm2Wtd, mencionados a seguir como Tor1a AE. Heterozygous AE-torsinA knock-nos ratos são pacientes humanos viáveis ​​e geneticamente mímica com DYT1 distonia, enquanto homozigoto knock-in ratos morrerem após o nascimento 16,17, com a latência para a morte pós-natal afetados por fundo genético 18. A morte prematura de homozigose camundongos knock-in exige que tanto a genotipagem dos animais eo estabelecimento de culturas neuronais são concluídas rapidamente. Como outro exemplo de genotipagem, Tfap2a (fator de transcrição AP-2α, ativando obrigatório 2α proteína potenciador) será usado. A proteína codificada por este gene é importante na regulação de vários processos celulares, tais como a proliferação, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose 19.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos com animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Iowa animal Institucional.

1. Identificação de longo prazo de ratos usando Tatuar as almofadas das patas

  1. Imobilizar a pata com (superfície plantar) a almofada da pata de frente para o experimentador. Segurar a pata com o polegar e o dedo indicador. Tenha cuidado para não apertar a pata.
    NOTA: a imobilização estável é importante para garantir que o pigmento tatuagem é colocado na derme da almofada da pata, e assim é permanente 7.
  2. Limpar a almofada da pata com 70% de etanol em uma esponja ou um chumaço de gaze.
  3. Aplique óleo de pele para um aplicador com ponta de algodão, e pressione suavemente a ponta contra a superfície do pad pata várias vezes. Use apenas uma pequena quantidade de óleo da pele; quando presentes em grandes quantidades, vai impedir que o pigmento tatuagem de atingir a pele.
  4. Mergulhar as pontas das agulhas de tatuagem na tinta imediatamente antes tatuagempara tatuagem. Use limpa, asséptica e agulhas de tatuagem afiadas, para diminuir a dor e a possibilidade de infecção, e também para aumentar a eficiência de tatuagem.
  5. Enquanto a superfície da almofada da pata é coberto com o óleo da pele, pressione as pontas das agulhas de tatuagem verticalmente e levemente contra a pele no centro da almofada da pata, e injetar a tinta várias vezes. Veja a tabela de materiais / equipamentos para obter informações sobre o sistema de tatuagem elétrica.
  6. Spray de etanol a 70% em uma gaze, pressione-a contra a pata para remover o pigmento da tatuagem extra na superfície da pele, e inspecionar a qualidade da tatuagem. Verifique se o meio de almofada pata tem uma mancha escura, redonda que difere da pigmentação normal da pele. Se a tatuagem não é escuro ou grande o suficiente para facilitar a visualização, repita os passos de tatuagem anteriores.

2. Ratos Genotipagem neonatal, recorrendo a uma rápida Kit PCR Genotipagem

  1. Desinfectar a extremidade distal de uma cauda de rato com etanol a 70%, cortadas em 5 mm ou menos da caudaponta e transferi-lo para um tubo de uma tira de 8 tubo, do tipo utilizado para a PCR. Use uma lâmina de barbear usadas-un para cada cachorro para evitar a contaminação cruzada entre as amostras. Em alternativa, usar um par de tesouras, mas, neste caso, com cuidado e remover completamente o tecido remanescente sobre as lâminas utilizando etanol a 70%. Verifique se há sangramento. Se ocorrer sangramento, aplique pressão à parte corte da cauda com uma gaze até sangramento parou.
  2. Adicionar 200 uL de solução de ADN A extracção a cada tubo de PCR contendo um espécime. Veja a tabela de materiais / equipamentos para a sua composição e informações sobre o kit.
  3. Colocar a tira tubo num termociclador de PCR, e iniciar a extracção de ADN utilizando o seguinte programa: 1 ciclo a 55 ° C durante 10 minutos, 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, e mantendo a 4 ° C.
    NOTA: Este é o mesmo termociclador PCR que é usado mais tarde para PCR.
  4. Após a extração de DNA for concluído, remova a tira tubo do reciclador uma térmicand inverter 5 vezes.
  5. Transferência de 4 mL da solução (extracto de ADN) de cada amostra para um tubo de un-utilizado de uma tira de 8 tubo, e misturar-se com: 10 ul de 2X PCR Ready Mix II, 2 ul de mistura para a frente & iniciadores reverse (recomendado pelo 0,5 m; veja a tabela dos materiais / equipamentos para as sequências), e 4 l de livre de nuclease H 2 O, para cada espécime. Mexer um pouco (por exemplo, 3 segundos) usando uma centrífuga de bancada. Manter os tubos em gelo em todos os momentos, exceto quando do manuseio.
  6. Executar ciclos térmicos. Ver Tabela de materiais / equipamentos para o programa térmico.
  7. Detectar os produtos de ADN amplificados. Carregar a solução de reacção total a partir do PCR (20 uL) directamente dentro de um poço de um gel de agarose. Carregar os marcadores de peso molecular em um poço separado. Aplicar um campo eléctrico.
  8. Adquirir imagens de fluorescência das bandas com luz ultravioleta.

3. cultura primária de cérebro do rato Neurons em glial Feeder Camada

NOTA: Os procedimentos para a dissecação do cérebro e de dissociação de células (3,1) são comuns a todos os procedimentos subsequentes. Os procedimentos para as culturas do mouse gliais (3.2), culturas gliais de rato (3,3), e do rato culturas neuronais (3.4) são descritos separadamente mais tarde.

  1. Cérebro Dissection e Celular Dissocaiation
    1. Sacrificar um rato ou ratazana filhote por decapitação, remove-se rapidamente o cérebro, e colocá-lo em solução de Hanks (ver Tabela 1 para a composição) + 20% de soro fetal bovino (FBS) numa placa de 35 mm (mantido em gelo).
    2. Corte o cérebro através da linha média em dois hemisférios. Remover a região de interesse (por exemplo, do córtex cerebral, corpo estriado e hipocampo) de cada hemisfério do cérebro. Retire as meninges e os principais vasos sanguíneos a partir da superfície. Corte a região do cérebro em 10/04 fatias finas usando uma lâmina cirúrgica.
    3. Enxaguar as fatias de cérebro num tubo de centrifugação de 15 ml, uma vez wit'solução de + 20% de FBS, em seguida, 3 vezes, com o Hanks h Hanks solução (isto é, sem soro) (todos a 4 ° C). Para enxaguar, adicionar 5-10 ml de solução, deixe o cérebro fatias assentar no fundo do tubo, aspirar a solução a partir do topo, e adicionar uma solução fresca. Finalize o procedimento de lavagem por aspiração da solução.
    4. Filtro de 2 ml da solução de digestão contendo tripsina (ver Tabela 1 para a composição) usando uma seringa de 3 ml e um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente no tubo que contém as fatias de cérebro. Deixe a tripsinização prosseguir durante 13 min à temperatura ambiente.
    5. Neutraliza-se a solução de tripsina primeiro aspirando a maior parte dela e, em seguida, pela adição de 7-10 ml de solução de Hanks '+ FBS a 20% (4 ° C).
    6. Enxaguar as fatias de cérebro, duas vezes com Hanks solução de + 20% de FBS, e depois três vezes com o Hanks solução (ou seja sem soro) (todos a 4 ° C). Finalize o procedimento de lavagem, aspirando a solutde iões.
    7. Filtro de 2 ml da solução de dissociação (ver Tabela 1 para a composição) usando uma seringa de 3 ml e um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente para o tubo com as fatias de cérebro.
    8. Mecanicamente dissociar as células por trituração suavemente 10-20 vezes, até que pedaços de tecido visível desaparecer. Use um, fogo-polido Pasteur pipeta conectado-algodão e evitar fazer bolhas durante a trituração.
    9. Espere 3 min para as pequenas peças para sossegar.
    10. Transferir a maioria da solução (~ 1,5 mL, deixando alguma solução na parte inferior) para um tubo de centrifugação de 15 ml, que contém 3 ml de solução de Hanks solução de FBS + 20% (4 ° C), utilizando-se conectado a-algodão, fogo pipeta Pasteur polida. Não transferir toda a solução, porque a inclusão de qualquer sedimento no fundo tipicamente resulta na deterioração da cultura.
    11. Centrifugar durante 13 minutos a ~ 185 g (~ 1100 rpm) a 4 ° C.
    12. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente,adicionar 1 ml de pré-aquecido plaqueamento médio (37 ° C) para o sedimento, e ressuspender que pipetando suavemente várias vezes usando o ligado-algodão, polido-fogo pipeta de Pasteur.
      NOTA: Três tipos diferentes de plaqueamento media são utilizados para fins de cultura diferentes: chapeamento de médio 1 para células gliais do mouse, chapeamento de meio-2 para os neurônios de rato, e plaqueamento de médio 3 para os neurônios de ratos e células gliais (ver Tabela 1 para composições) .
    13. Retire 10 ul da suspensão celular, misturá-la com 10 ml de solução de azul de tripano a 0,4%, e medir a densidade de células vivas, utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automatizado.
  2. Cultures Rato da glia
    1. Lave as lamelas para ajudar a estabelecer culturas de células de ratos saudáveis.
      1. Mergulhe lamelas de vidro (redondo, 12 mm de diâmetro) em ácido nítrico a 70% em uma placa de Petri de vidro. Proteger da luz usando papel alumínio e coloque-o em um shaker orbital O / N.
      2. Lavar o coversli vidrops na placa de Petri, pelo menos, três vezes com água destilada. Mergulhe-os em água destilada. Coloque o prato em um shaker orbital O / N.
      3. Seque as lamelas em um papel de filtro Whatman 150 milímetros na cabine de segurança biológica.
      4. Autoclave as lamelas.
      5. Coloque as lamelas em 24 poços cultura prato.
    2. Rótulo e genotípicas camundongos recém-nascidos de acordo com as etapas 1 e 2.
    3. Obter as células do cérebro dos filhotes de rato, de acordo com a etapa 3.1.
      NOTA: O uso do córtex cerebral é típico para a preparação da camada de rato alimentador glial. No entanto, outras regiões do cérebro, tais como o hipocampo e estriado, funcionará após o ajuste adequado da densidade celular devido a diferentes números e os rendimentos de células de diferentes regiões.
    4. Adicionar ~ 4 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1 para a suspensão final de células (~ 1 mL). Por meio de cultura de pré-aquecimento, coloque a solução na incubadora de cultura (5% de CO 2 e 95% de O 2, 37 ° C) S / N, apermitir que os valores de temperatura e pH para estabilizar.
    5. Transferir a suspensão celular a um balão de cultura T25 não revestido, utilizando o plugado-algodão, fogo-polido Pasteur pipeta. Colocar o balão na incubadora cultura.
    6. Fim de 1 dia in vitro (DIV), lavar as células cultivadas no frasco T25 duas vezes com meio de plaqueamento-1 (4 ° C). Colocar o balão de volta na incubadora. Realizar a lavagem por aspiração do meio dentro do frasco completamente com uma pipeta de Pasteur, a adição de ~ 5 ml de meio fresco e inclinando gentilmente o balão várias vezes em um movimento giratório.
    7. Em 6-9 DIV, (isto é, um dia antes da tripsinização e plaqueamento em lamelas, em passos 3.2.8-3.2.13), 100 ul de colocar o material de revestimento com proteínas da matriz extracelular (ver Tabela de Materiais / Equipamento para comentários sobre o material de revestimento) sobre as lamelas de vidro em um prato de cultura, e colocar a placa de cultura na incubadora de cultura.
    8. Em 7-10 DIV, quando as células são 20-40% confluentes (espacialmente contínua), trypsinize eles.
      1. Lavar o balão de uma só vez, por aspiração de toda a solução dentro do frasco e adicionando ~ 13 ml de solução de Hanks (4 ° C), incline suavemente o frasco várias vezes em um movimento giratório, e aspirar a solução completamente.
      2. Adicionar 40 ul de solução de ADNase (concentração final, 750 unidades / ml) a 4 ml de solução de tripsina-EDTA, passar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 um, e adicionar-se o filtrado directamente para as células do frasco.
      3. Deixe a tripsinização prosseguir durante 13 min a 37 ° C na incubadora.
      4. Neutraliza-se a solução de tripsina por adição de 2 ml de 100% de FBS (4 ° C) para o balão.
      5. Transferem-se as células tratadas com tripsina para um tubo de centrifugação de 15 ml usando um de 5 a 10 ml de pipeta, adicionar ~ 4 ml de solução de Hanks '+ FBS a 20% (4 ° C), centrifugar a ~ 185 g e 4 ° C durante 13 min e aspirar o sobrenadante.
    9. Ressuspender o sedimento em 1 ml de pré-warmemeio-1 d chapeamento.
    10. Medir a densidade das células de acordo com o passo 3.1.13.
    11. Aspirar o material de revestimento completamente a partir das lamelas de vidro, e a placa de ~ 50 ul de células gliais ressuspensas em lamelas.
      NOTA: Estas células irá estabelecer a camada de alimentação glial.
    12. Coloque a placa de cultura com lamelas na incubadora.
    13. 20-60 min mais tarde, adicionar 1 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1 a cada poço, e colocar o prato de volta na incubadora. Nota: Embora o meio de revestimento é adicionada, será útil para utilizar outra pipeta para pressionar para baixo da periferia da lamela (onde não existem células plaqueadas), de modo que a lamela não irá flutuar no meio.
    14. Em 1 DIV da camada alimentadora glial (ou seja, na lamela de vidro), substituir o meio com 1 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-1, aspirando-se toda a solução em um poço e depois enchendo-a com meio fresco.
    15. Em 2-3 DIV da camada alimentadora da glia, quando o cells são 80-100% confluentes, adicionar inibidor mitótico (10 ul de uma mistura de 5-fluoro-2'-desoxiuridina + uridina; concentrações finais de 81,2 e 204,8? M, respectivamente) a cada poço, para inibir a replicação do ADN e, por conseguinte, a suprimir a proliferação de células gliais.
    16. Em 7-9 DIV, quando as células são 90-100% confluentes (1-2 h antes do plaqueamento neurónios na camada alimentadora glial), substituir o meio de cultura com pré-aquecido plaqueamento meio-2 (37 ° C).
      NOTA: Os neurónios vai ser revestida no mesmo dia, utilizando o passo 3.4.
  3. Cultures Rat gliais
    1. Bata de um frasco de cultura T25 com o mesmo material de revestimento.
      NOTA: É necessário para posterior remoção das células não aderentes no passo 3.3.5.
      1. Adicionar 2.0 ml do material de revestimento para o balão, e colocar o balão no incubador de cultura.
      2. Após 2-3 h, aspirar o material de revestimento completo, de tal modo que o piso do frasco torna-se seca.
    2. Obter as célulasdas crias de rato, de acordo com o passo 3.1.
      NOTA: A região CA3-CA1 do hipocampo é usado para a preparação da camada de rato alimentador glial. No entanto, outras regiões do cérebro, tais como o córtex cerebral e corpo estriado, vai funcionar depois de se ajustar para diferenças na densidade das células, devido a diferentes números e os rendimentos de células de diferentes regiões.
    3. Adicionar ~ 4 ml de pré-aquecido plaqueamento meio-3 para a suspensão de células final (~ 1 mL).
    4. Transferir a suspensão de célula para o balão de cultura T25 revestidos, utilizando-se conectado a-algodão, polido-fogo pipeta de Pasteur. Colocar o recipiente na incubadora de cultura (5% de CO 2 e 95% de O 2, 37 ° C).
    5. Em 2-3 DIV, quando as células são 20-40% confluentes, remover não-aderente ou fracamente células aderentes, fechando a tampa firmemente, agitando vigorosamente ~ 10 vezes, aspiração da solução, e a adição de 4-5 ml de chapeamento 3-forma (a 4 ° C). Repita este procedimento uma vez. Examine as células cultivadas em todo o piso balão (por exemplo,usando microscópio de contraste de fase) para confirmar que as que aparecem neuronal (ou seja, aqueles para os quais a borda exterior do corpo da célula aparece fase brilhante) são completamente removidas. Repita o procedimento quantas vezes for necessário para eliminar essas células, e em seguida, retornar o frasco para a incubadora.
      NOTA: A força e o número total de "shakes" necessários podem variar entre experimentadores individuais. O importante é não manter o número total de shakes para um número definido, mas para confirmar que as células neuronais-like são eliminados.
    6. No 6-8 DIV, quando as células são 90-100% confluentes, a passagem das células gliais por trypsinizing-los como no passo 3.2.8.
    7. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), adicionam-se 10 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), transferência das células tratadas com tripsina para um balão T75 não revestida, e em cultura deles a incubadora.
      NOTA: as células gliais Rato será passadas duas vezes; em contraste, as células gliais de rato are passadas apenas uma vez, porque eles se tornam insalubres após várias passagens. Células gliais de rato vai ser passadas em frascos T75 que não são revestidas com qualquer material de revestimento. O revestimento permite que as células da glia de ratos a crescer muito rapidamente e produzem muitas células ciliadas (células ependimárias putativos), que irá deteriorar-se a condição de cultura neuronal mais tarde.
    8. Em 17-19 DIV de cultura num balão de glial (isto é, 11 dias após passaging e um dia antes da tripsinização e plaqueamento em lamelas de cobertura por passos 3.3.9-3.3.14), 100 ul de colocar o material de revestimento em lamelas de vidro não lavadas ( redondo, 12 mm de diâmetro) numa placa de cultura, e colocar a placa de cultura na incubadora de cultura.
      NOTA: Para as culturas da glia de ratos, a diferença não foi notado nos resultados de cultura com ou sem lavar as lamelas.
    9. Em 18-20 DIV da cultura glial no frasco (ou seja, 12 dias após passaging), prepare a camada de alimentação glial por trypsinizing as células cultivadas, de acordo com step 3.2.8.
    10. Durante a centrifugação, aspirar o material de revestimento completamente a partir das lamelas de vidro.
    11. Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C), e medir a densidade de células, de acordo com o passo 3.1.13.
    12. Ajustar a densidade de 10 4 glial vivo células / ml, e a placa 100 uL da suspensão de células glial nas lamelas de vidro revestidas.
      NOTA: Estas células irá estabelecer a camada de alimentação glial.
    13. Coloque a placa de cultura com lamelas na incubadora por 20-60 min.
    14. Adicionar 1 ml de meio de plaqueamento-3 (4 ° C) a cada poço, e colocar o prato de volta na incubadora.
    15. Em 3-4 DIV da camada alimentadora da glia, quando as células na lamela são 40-80% confluentes, adicionar 1 ml de meio de crescimento pré-aquecido (ver Tabela 1 para a composição) que contém citosina β-D-arabinofuranósido ( AraC, concentração final de 4 mM) para parar a proliferação de células gliais. Placa neurônios a 7-9 DIV da camada alimentadora da glia, quando as células são 60-80% confluente, utilizando o passo 3.4.
  4. Cultures Rato Neuronal
    1. Rótulo e genotípicas camundongos recém-nascidos de acordo com as etapas 1 e 2.
    2. Use os filhotes de rato para o passo 3.1.
    3. Ajuste a densidade da suspensão de células ao vivo para ~ 2,0 x 10 5 células / ml, utilizando pré-aquecido chapeamento meio-2 para plaqueamento em células gliais do mouse, ou usando o plaqueamento meio-3 para plaqueamento em células gliais de rato.
    4. Placa as células na camada alimentadora glial, adicionando suavemente a suspensão de células para o meio de cultura de cada poço. Nota: O volume da suspensão celular a ser adicionada é determinada pelo número de células alvo num poço de cultura. Por exemplo, a placa de ~ 60 ul de suspensão de células para atingir 12.000 células / poço.
    5. Note-se que não há solução muda são necessárias após os neurônios são banhados. Ter cuidado para evitar a evaporação da solução das cavidades ao longo do curso da cultura, por humedecimento do o interiorf incubadora de cultura.

Resultados

Como exemplo da aplicação deste protocolo, os resultados representativos são mostrados para a rotulagem de camundongos por tatuagem, genotipagem de confiança sob várias condições experimentais, e estabelecendo culturas neuronais primárias em camadas alimentadoras gliais.

Tatuagem

Crias recém-nascidas foram marcadas nas almofadas das patas utilizando um sistema de tatuagem ('recém-nascido' na Figura 1). Os rótul...

Discussão

O protocolo aqui apresentado inclui os procedimentos para a tatuagem para marcar / identificar ratos, camundongos para a genotipagem de pontas da cauda, ​​e para a cultura de neurônios do cérebro do rato em baixa densidade. Em uma rodada de experimentos usando 6-8 filhotes, estes procedimentos normalmente requerem ~ 0,5 hr, ~ 4 horas e ~ 2 horas, respectivamente, em um total de 6-7 horas. Isto torna mais prático para um único experimentador para completar todos os procedimentos necessários a partir do momento d...

Divulgações

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Agradecimentos

The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS - tattooing
Machine CleanserAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NMCR3This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying AgentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NDAR4This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black PigmentAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NBP01
Skin Prep ApplicatorAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSPA1Q-tip.
Skin Prep solutionAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS - genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution AEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution BEZ BioResearch LLCG2001-100Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacialVWRBDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology graderpiA20090-500 We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)FisherBP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µlDot Scientific IncUG104-96RS Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µlDot Scientific IncUG2020-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µlDot Scientific IncUG2812-RSUse pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml USA Scientific1402-2900Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual rpi145660Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, naturalUSA Scientific1605-0000Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS - cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MGSee comments section of uridine for more information.
B-27 supplementGIBCO-Invitrogen17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treatedBD falcon353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 mlBD falcon353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 mlBD falcon353136
Conical Tube, polypropylene, 15 mlBD falcon352095
Countess (cell number counter) chamber slidesGIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mmPyrex3160-101
Distilled waterGIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KUStock solution is prepared at 1,500 units/20 μl = 75,000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvateGIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
Hanks' Balanced SaltsSigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)Sigma-AldrichH3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagentSigma-Aldrich258148-100 ML
InsulinSigma-AldrichI5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 °C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 °C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 mlBD Biosciences355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plateBD falcon353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plateBD falcon353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquidGIBCO-Invitrogen10888-022
Nitric AcidVWRbdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21 prepared in the labSource: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾” Fisher13-678-6AUse this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9” Fisher13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
Serological pipet, 2 mlBD falcon357507
Serological pipet, 5 ml BD falcon357543
Serological pipet, 10 mlBD falcon357551
Serological pipet, 25 mlBD falcon357525
Serological pipet, 50 ml BD falcon357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basisSigma-Aldrich480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, AldrichSigma-Aldrich431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µmCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XISigma-AldrichT1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
UridineSigma-AldrichU3003-5GStock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS - immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2Merck MilliporeAB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktailMerck MilliporeNE1015
EQUIPMENT - tattooing
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.NEO–9This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, e.g. the toes, or if fine mechanical control is necessary, e.g. when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting "1" out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.
EQUIPMENT - genotyping
Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini–Sub Cell GTBIO–RAD170–4405Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDUOur PCR reactions for the Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 °C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 °C for 30 sec, annealing at 58 °C for 30 sec, extension at 72 °C for 2 min. This is followed by final extension at 72 °C for 10 min, and holding at 4 °C.
Power supply, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
EQUIPMENT - cell culture
Automated cell counter, CountessGIBCO-InvitrogenC10310This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 105 to 4 x 106 cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.
Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.
CO2 Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water JacketNUAIRENU-4850
Horizontal Clean BenchNUAIRENU-201-330This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of "Brain Dissection and Cellular Dissociation)".
Orbit LS Low Speed ShakerLabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (centrifuge)/46922 (rotor)

Referências

  1. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
  2. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  3. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  4. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. Y., Harata, N. C. Abnormal cytoplasmic calcium dynamics in central neurons of a dystonia mouse model. Neurosci. Lett. 548, 61-66 (2013).
  5. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Harata, N. C. Dystonia-associated protein torsinA is not detectable at the nerve terminals of central neurons. Neuroscience. 253C, 316-329 (2013).
  6. Iwabuchi, S., Koh, J. Y., Wang, K., Ho, K. W., Harata, N. C. Minimal change in the cytoplasmic calcium dynamics in striatal GABAergic neurons of a DYT1 dystonia knock-in mouse model. PLoS One. 8, e80793 (2013).
  7. Dahlborn, K., Bugnon, P., Nevalainen, T., Raspa, M., Verbost, P., Spangenberg, E. Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group on animal identification. Lab. Anim. 47, 2-11 (2013).
  8. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS One. 7, e48034 (2012).
  9. Ozelius, L. J., et al. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nat. Genet. 17, 40-48 (1997).
  10. Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 519-529 (2005).
  11. White, S. R., Lauring, B. AAA+ ATPases: achieving diversity of function with conserved machinery. Traffic. 8, 1657-1667 (2007).
  12. Burdette, A. J., Churchill, P. F., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. The early-onset torsion dystonia-associated protein, torsinA, displays molecular chaperone activity in vitro. Cell Stress Chaperones. 15, 605-617 (2010).
  13. Zhao, C., Brown, R. S., Chase, A. R., Eisele, M. R., Schlieker, C. Regulation of Torsin ATPases by LAP1 and LULL1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, E1545-1554 (2013).
  14. Ozelius, L. J., Lubarr, N., Bressman, S. B. Milestones in dystonia. Mov. Disord. 26, 1106-1126 (2011).
  15. Albanese, A., et al. Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update. Mov. Disord. 28, 863-873 (2013).
  16. Goodchild, R. E., Kim, C. E., Dauer, W. T. Loss of the dystonia-associated protein torsinA selectively disrupts the neuronal nuclear envelope. Neuron. 48, 923-932 (2005).
  17. Dang, M. T., et al. Generation and characterization of Dyt1 ΔGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia. Exp. Neurol. 196, 452-463 (2005).
  18. Tanabe, L. M., Martin, C., Dauer, W. T. Genetic background modulates the phenotype of a mouse model of DYT1 dystonia. PLoS One. 7, e32245 (2012).
  19. Huang, Z., Xu, H., Sandell, L. Negative regulation of chondrocyte differentiation by transcription factor AP-2α. J. Bone Miner. Res. 19, 245-255 (2004).
  20. Hall, R. D., Lindholm, E. P. Organization of motor and somatosensory neocortex in the albino rat. Brain Res. 66, 23-38 (1974).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Iwaki, S., Matsuo, A., Kast, A. Identification of newborn rats by tattooing. Lab. Anim. 23, 361-364 (1989).
  23. Wang, L. A primer on rodent identification methods. Lab. Anim. 34, 64-67 (2005).
  24. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments). Nat. Protoc. 1, 936-946 (2006).
  25. Castelhano-Carlos, M. J., Sousa, N., Ohl, F., Baumans, V. Identification methods in newborn C57BL/6 mice: a developmental and behavioural evaluation. Lab. Anim. 44, 88-103 (2010).
  26. Schaefer, D. C., Asner, I. N., Seifert, B., Burki, K., Cinelli, P. Analysis of physiological and behavioural parameters in mice after toe clipping as newborns. Lab. Anim. 44, 7-13 (2010).
  27. Doan, L., Monuki, E. S. Rapid genotyping of mouse tissue using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR. Kit. J. Vis. Exp. , e626 (2008).
  28. Chum, P. Y., Haimes, J. D., Andre, C. P., Kuusisto, P. K., Kelley, M. L. Genotyping of plant and animal samples without prior DNA purification. J. Vis. Exp. , e3844 (2012).
  29. Demeestere, I., et al. Follicle-stimulating hormone accelerates mouse oocyte development in vivo. Biol. Reprod. 87 (3), 1-11 (2012).
  30. Warner, D. R., Wells, J. P., Greene, R. M., Pisano, M. M. Gene expression changes in the secondary palate and mandible of Prdm16-/- mice. Cell Tissue Res. 351, 445-452 (2013).
  31. Higgins, D., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Ch. 3. Culturing Nerve Cells. , 37-78 (1998).
  32. Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0.5) C57Bl/6J mice. J. Neurosci. Methods. 149, 110-120 (2005).
  33. Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J. Vis. Exp. e895. (19), e895 (2008).
  34. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J. Vis. Exp. , e2373 (2011).
  35. Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J. Vis. Exp. , e2389 (2011).
  36. Beaudoin, G. M., et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7, 1741-1754 (2012).
  37. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. , e3634 (2012).
  38. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. , e3965 (2012).
  39. Tischbirek, C. H., et al. Use-dependent inhibition of synaptic transmission by the secretion of intravesicularly accumulated antipsychotic drugs. Neuron. 74, 830-844 (2012).
  40. Nakanishi, K., Nakanishi, M., Kukita, F. Dual intracellular recording of neocortical neurons in a neuron-glia co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 105-114 (1999).
  41. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  42. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 (3), 312-318 (2012).
  43. Song, H., Stevens, C. F., Gage, F. H. Astroglia induce neurogenesis from adult neural stem cells. Nature. 417, 39-44 (2002).
  44. Tang, X., et al. Astroglial cells regulate the developmental timeline of human neurons differentiated from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 11, 743-757 (2013).
  45. Ivkovic, S., Ehrlich, M. E. Expression of the striatal DARPP-32/ARPP-21 phenotype in GABAergic neurons requires neurotrophins in vivo and in vitro. J. Neurosci. 19, 5409-5419 (1999).
  46. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  47. Wang, X. F., Cynader, M. S. Effects of astrocytes on neuronal attachment and survival shown in a serum-free co-culture system. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 209-216 (1999).
  48. Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., Gotz, J., Ittner, L. M. Primary support cultures of hippocampal and substantia nigra neurons. Nat. Protoc. 4, 78-85 (2009).
  49. Shimizu, S., Abt, A., Meucci, O. Bilaminar co-culture of primary rat cortical neurons and glia. J. Vis. Exp. , e3257 (2011).
  50. Mennerick, S., Que, J., Benz, A., Zorumski, C. F. Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J. Neurophysiol. 73, 320-332 (1995).
  51. Chen, G., Harata, N. C., Tsien, R. W. Paired-pulse depression of unitary quantal amplitude at single hippocampal synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 1063-1068 (2004).
  52. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, plating, and maintenance of dorsal horn neuron cultures. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  53. Xu, H. P., Gou, L., Dong, H. W. Study glial cell heterogeneity influence on axon growth using a new coculture method. J. Vis. Exp. , e2111 (2010).
  54. Daniel, J. A., Galbraith, S., Iacovitti, L., Abdipranoto, A., Vissel, B. Functional heterogeneity at dopamine release sites. J. Neurosci. 29, 14670-14680 (2009).
  55. Calakos, N., Schoch, S., Sudhof, T. C., Malenka, R. C. Multiple roles for the active zone protein RIM1α in late stages of neurotransmitter release. Neuron. 42, 889-896 (2004).
  56. Garcia-Junco-Clemente, P., et al. Cysteine string protein-α prevents activity-dependent degeneration in GABAergic synapses. J. Neurosci. 30, 7377-7391 (2010).
  57. Hogins, J., Crawford, D. C., Zorumski, C. F., Mennerick, S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 6, e25633 (2011).
  58. Panatier, A., Vallee, J., Haber, M., Murai, K. K., Lacaille, J. C., Robitaille, R. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  59. Noble, M., Mayer-Proschel, M., Banker, G., Goslin, K. . Ch. 18. Culturing Nerve Cells. , 499-543 (1998).
  60. Ahlemeyer, B., Kehr, K., Richter, E., Hirz, M., Baumgart-Vogt, E., Herden, C. Phenotype, differentiation, and function differ in rat and mouse neocortical astrocytes cultured under the same conditions. J. Neurosci. Methods. 212, 156-164 (2013).
  61. Malgaroli, A., Tsien, R. W. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature synaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature. 357, 134-139 (1992).
  62. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11, 713-724 (1993).
  63. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  64. Yamamoto, M., Steinbusch, H. W., Jessell, T. M. Differentiated properties of identified serotonin neurons in dissociated cultures of embryonic rat brain stem. J. Cell Biol. 91, 142-152 (1981).
  65. Nakajima, Y., Masuko, S. A technique for culturing brain nuclei from postnatal rats. Neurosci. Res. 26, 195-203 (1996).
  66. Arttamangkul, S., Torrecilla, M., Kobayashi, K., Okano, H., Williams, J. T. Separation of μ-opioid receptor desensitization and internalization: endogenous receptors in primary neuronal cultures. J. Neurosci. 26, 4118-4125 (2006).
  67. O'Farrell, C. A., Martin, K. L., Hutton, M., Delatycki, M. B., Cookson, M. R., Lockhart, P. J. Mutant torsinA interacts with tyrosine hydroxylase in cultured cells. Neuroscience. 164, 1127-1137 (2009).
  68. Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
  69. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 171, 239-247 (2008).
  70. Robert, F., Hevor, T. K. Abnormal organelles in cultured astrocytes are largely enhanced by streptomycin and intensively by gentamicin. Neuroscience. 144, 191-197 (2007).
  71. Robert, F., Cloix, J. F., Hevor, T. Ultrastructural characterization of rat neurons in primary culture. Neuroscience. 200, 248-260 (2012).

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