הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Summary

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the Apc^Min/+ colorectal cancer model.

Abstract

תאי מיאלואידית הם התאים חיסוניים הנפוצים ביותר בגידולים והוכחו לקדם התקדמות גידול. טכניקות הדמיה intravital מודרניות מאפשרות התצפית של התנהגות תאית חי בתוך האיבר אבל יכולות להיות מאתגר בסוגים מסוימים של הסרטן בשל נגישות איבר וגידול כגון מעי. תצפית ישירה של גידולים במעי לא דווחה בעבר. הליך כירורגי המתואר כאן מאפשר תצפית ישירה של דינמיקת תא מיאלואידית בתוך הגידולים במעיים בעכברים חיים באמצעות עכברי כתב ניאון מהונדסים וקליעים נותבים או נוגדנים להזרקה. לצורך כך, נעשה שימוש בארבעה צבעים, רב אזור, מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו, המאפשר הדמיה רציפה ארוך טווח עם רכישת תמונה מהירה. Apc ^{מינימאלי} עכברים ^{/ +} המתפתחים אדנומות מרובות במעי הדק הם חצו עם עכברי c-FMS-EGFP לדמיין תאי מיאלואידית ועם עכברי ACTB-ECFPלדמיין תאי אפיתל במעי של מאורות. נהלים לתיוג רכיבי גידול שונים, כגון כלי דם ונויטרופילים, ואת ההליך למיצוב גידול הדמיה דרך פני השטח serosal גם מתוארים. זמן לשגות סרטים מלוקט מכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של מיאלואידית התנהגות תא באתרו בmicroenvironment המעיים.

Introduction

ראיות מכריעות עכשיו מוכיחות כי microenvironment הגידול, בהיקף של אוכלוסיות תאים הטרוגנית, הכוללים פיברובלסטים, תאי אנדותל, תאי מערכת חיסונית ודלקתיים, מטריצת חוץ תאית, וגורמים מסיסים, ממלא תפקיד מכריע בייזום ובהתפתחות של גידולים מוצקים על ידי תרומה לכמעט כל סימני ההיכר של סרטן ^1. ואכן, במהלך התקדמות גידול, יש אינטראקציות דינמיות מתמידים בין תאים סרטניים ותאי סטרומה הפכו להתפתח ליצור microenvironment חיובי לממאירות ^2. בין תאי מערכת החיסון שלהסתנן microenvironment הגידול, תאי מיאלואידית הם בשפע ³ ביותר. בהיקף של מקרופאגים גידולים הקשורים (TAM), תאים המדכאים המופקת מיאלואידית (MDSCs), תאים דנדריטים (DC) ונויטרופילים (PMNs), תאי מיאלואידית מגויסים ממח עצם ובהדרגה לחדור גידולים, משחררים ציטוקינים, גורמי גדילה ופרוטאזות ה יכול לקדםצמיחה וגידול התפשטה ^4. Crosstalk בין תאים סרטניים ותאי מיאלואידית הוא מורכב, אך דינמי. כך ההבנה של מהות יחסי הגומלין שלהם היא קריטית לקביעה מדוע תאים אלה לקדם התקדמות הסרטן במקום משתתף בתגובה חיסונית כנגד גידול, ועשויה לעזור למצוא מטרות חדשות כדי לשלוט בו.

תצפית ישירה על ידי מיקרוסקופ intravital מספקת מידע על דינמיקת תאים בתוך הרקמות של עכברים חיים ^5. ארבעת צבעים, רב אזור, מערכת confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו נועד ללמוד תאי סטרומה בתוך גידולי החלב ^6. גישה זו מאפשרת הדמיה רציפה לטווח ארוך וכוללת מספר יתרונות כגון (א) רכישת תמונות מהירות כדי למזער ממצא תנועה, (ב) הרדמה לטווח ארוך, ארבע רכישת צבע למעקב תאים מסוגים שונים (ג), תיוג ניאון (ד) רכיבים שונים של tumoral, ותצפית (ה) של שנינות microenvironments גידול שונהHin אותו העכבר כדי להימנע מעכבר ^ל7-9 השתנות עכבר. בעזרת טכנולוגיה זו, התנהגויות תאים שונות כבר דיווחו בוירוס גידול החלב מודל (MMTV) אונקוגן T אמצע polyoma מונע אמרגן (PyMT) המציג שלבים מתקדמים של יצירת גידולים. לימפוציטים מסוג T רגולטורים (Tregs, דמיין ידי transgene FOXP3 ^EGFP) להעביר באופן מועדף בסמוך לכלי דם ואילו DCS (CD11c-DTR-EGFP), פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (Fsp1 ^{+ / +} -EGFP) ותאי מיאלואידית (c-FMS -EGFP) מפגין תנועתיות גבוהה יותר בפריפריה מאשר הגידול במסת הגידול. במצב של היפוקסיה המערכתית החריפה, תאים נדדו באופן שונה: Tregs להפסיק נודדים בניגוד לתאי מיאלואידית שימשיכו לנוע ^6. בנוסף, באותו מודל העכבר, זה כבר הראה כי רגישות דוקסורוביצין שינויים בשלב גידול, הפצת סמים קשורה לתגובת סמים, ודוקסורוביציןטיפול מביא לגיוס CCR2 תלוי של תאי מיאלואידית לגידולים. לפיכך, הדמיה חיה יכולה לשמש גם כדי לקבל תובנות לתוך תגובות בסמים באתר והביולוגיה של chemoresistance ^10,11.

מוטציות גנטיות coli polyposis (APC) adenomatous בדרך הכלל מתרחשות באדנומות אנושיות מעי גס וקרצינומה ¹² ומוטציה של עותק בודד של תוצאות גן APC בpolyposis המשפחתי adenomatous (FAP), אשר מקנה סיכון גבוה ביותר לסרטן מעי גס ^13. זן העכבר Apc ^{מינימום / +} נושא מוטציה עיצור בקודון 850 של הגן APC ואופן ספונטני מתפתח אדנומות במעי מרובה בכל רחבי המעי הדק ^{14- 16.} ההדמיה intravital לטווח ארוך של המעי היא מאתגרת בגלל הפולשנות של ההליך, שכן פתיחת חלל הצפק היא הכרחית לגישה למעי. הדמיה חיה לזמן קצר studies כבר פורסם בעבר במעי בריא ^17,18, אבל תצפית ישירה לטווח הארוך של גידולים במעי לא דווחה. הליך כירורגי תוכנן ומעודן לדמיין גידולים דרך פני השטח serosal של המעי, תוך שימוש במערכת מיקרוסקופ דיסק ספינינג intravital ששימשה בעבר לגידולי שד תמונת ^6,10. במאמר זה, פרוטוקול מתואר המאפשר אחד כדי לעקוב אחר התנהגותם של תאי מיאלואידית בתוך הגידולים במעי הדק באמצעות Apc ^{מינימום / +} עכברים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל הניסויים בבעלי החיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC), קליפורניה בסן פרנסיסקו. כל ניסויי ההדמיה היו נהלים שאינם הישרדות ובעלי החיים מומתים מייד לאחר תום רכישת תמונה.

.1 דור של עכברים

הערה: APC ^{מינימאלי} עכברים ^{/ +,} נושאת מוטציה בגן APC, באופן ספונטני לפתח 50-100 אדנומות במעי הדק.

1. צלב Apc ^{מינימאלי} עכברים ^{/ +} עם קו ACTB-ECFP, המבטא ECFP תחת האמרגן אקטין, ועוד יותר עם ​​קו c-FMS-EGFP, המבטא EGFP תחת אמרגן c-FMS כדי לזהות תאי מיאלואידית. בעלי חיים הטרוזיגוטיים לACTB-ECFP וג-FMS-EGFP המשמשים לאיתור הקרינה.
2. השתמש בעכברים ב3-4 חודשים של גיל לאדנומות להבחין בבירור תמונה.

2 הכנת Materials לפני הניתוח

הערה: הפרטים של הגדרת מיקרוסקופ כבר בעבר תיארו ^6,7.

1. מיקרוסקופ
   1. הפעל את שמיכת החימום. הפעל את לייזר הארגון ל488 עירור ננומטר וננומטר של מצב המוצק 405, 561 ננומטר, ו640 לייזרי ננומטר. הפעל מיקרוסקופ, יחידת בקרת דיסק ספינינג, AOTF, יחידת בקרת לייזר, ואת הבקר המצלמה.
   2. לפתוח את תריס מיקרוסקופ, ההופך את הנורית אדומה. הפעל את תוכנת מחשב ומצלמה.
2. פלטפורמת הדמיה
   1. ודא שהוספת השלב היא נקייה. אחרת, נקי עם מים וסבון ולאחר מכן יבש.
   2. קח שני coverslips ולהשתמש מעבדה קלטת כדי לאבטח אותם בכנס. במקום להכניס על הבמה ולנקות אותו עם מגבוני אלכוהול.
   3. באמצעות מעבדה קלטת, לצרף את שמיכת החימום לצד הימני של הבמה.
   4. לוודא את התקינות של הסרעפת הגומי בחרטום ולשנות אותו אם necessary. עמדה ולתקן את חרטומו למסירת ההרדמה isoflurane לבעלי החיים על ידי שימוש בגזה ומעבדת קלטת.
3. מערכת הרדמת Isoflurane
   1. למלא את מיכל isoflurane.
   2. הפעל את הוואקום ולהתאים ל1.2 ליטר / דקה.
   3. הוסף מים מזוקקים לnebulizer ולחבר את nebulizer למערכת isoflurane.
   4. הפעל את מנתח החמצן ולחבר אותו למערכת isoflurane. הפעל את מיכל החמצן ולהבטיח כי מנתח חמצן תערוכות 100%. התאם את זרימת O ₂ ל0.2 ליטר / דקה.
   5. הפעל את טנק החנקן ולהתאים את הזרימה ב0.8 ליטר / דקה. ודא שמנתח חמצן תערוכות 21%.
4. הכנת כלים לכירורגיה ופלטפורמה
   1. 2 זוגות נקיים של מלקחיים לנתיחה ומספריים במים וסבון.
   2. הפעל מעקר את החרוז החם ולתת לו להגיע 250 ° C. לעקר את הכלים ניתוח ל30 שניות. תן להם להתקרר.
   3. הנח שתיין מעבדה על ספסל הניתוחים.
   4. השתמש מכסה קלקר כפלטפורמה כירורגית. כסה עם חתיכת מעבדה שתיינית. הכן פיסת מעבדה שתיינית שנייה לשנות לאחר גילוח העכבר.
   5. הנח את חרטומו עם השורה של הרדמה על מכסה הקלקר המכוסה, ולצרף אותו למכסה הקלקר (לא על שתיין המעבדה) עם כמה קלטת ולהשתמש בשתי מחטים בשני הצדדים של חרטומו כדי לשמור אותו במקום.
   6. להרכיב בטאדין, מגבוני אלכוהול, גזה סטרילית, דבק סופר, שקופיות מיקרוסקופ, מכונת גילוח חשמלי, ו4 חתיכות של מעבדה קלטת.

.3 הכנת זריקות

1. מתחת למכסה המנוע, להכין מזרק אינסולין (28 G x ½ ב) עם 7 μl של-6G Ly נוגדן המניה AF647 מצומדות- (Gr1) (1 מ"ג / מ"ל) לתוך של 2,000 (4 מ"ג rhodamine-dextran kDa / מ"ל ​​100 μl ) להזרקת רטרו מסלולית. הזרקת רטרו מסלולית מומלצת בApc ^{מינימום / +} עכברים מאז אנמיה שמתפתחת בבעלי החיים אלה הופכת את difficu ורידי זנבlt לזהות דרך העור.
2. הכן מזרק אינסולין שני עם 1 מ"ג / קילוגרם אטרופין בדילול מלא ל150 μl PBS לתת עורית (SC) הזרקה לפני ההדמיה לצנן תנועות נפיחה של המעי.

.4 הכנת המעי להדמיה

1. ודא ששורת ההרדמה לתא האינדוקציה היא פתוחה, והקווים לשולחן ומיקרוסקופ הניתוחיים סגורים.
2. מעבירים את החיה לחדר ההרדמה. סגור את תא ההרדמה ולהדליק את isoflurane עד 4% (עם 21% O _2).
3. כאשר סמן העכבר נושם עמוק ולאט (אחרי 5-6 דק '), להעביר אותו לשלב הניתוחי באגף שלו ומחדיר את תמיסת נוגדן Gr1 ו / או פתרון dextran רטרו orbitally.
4. פתח את שורת ההרדמה צמודה לפלטפורמה כירורגית. לסגור את הקו לתא ההרדמה ולשים את העכבר על גבה עם האף שלה בחרוט ההרדמה.
5. להפחית את isofluraneריכוז מ -4% ל 2.5%.
6. ודא שהעכבר הוא מורדם גם על ידי צובט שודד דרכיה ובדיקת רפלקס בקרנית.
7. להוסיף משחה סיכה עיניים על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
8. אבטח את הגפיים של העכבר לשלב הניתוחי על ידי הוספת מעבדה קלטת.
9. להסיר את השיער ממשטח הגחון באמצעות מכונת גילוח חשמלית. גם להסיר את השיער מהאיבר האחורי השמאלי כדי למקם את oximeter לפני הרכישה. הסר את שתיינית המעבדה משלב הניתוח ולהחליף עם אחד נקי, כדי למנוע זיהום שיער.
10. לחטא את פני השטח הגחון עם מגבוני אלכוהול ובטאדין.
11. הזרק פתרון אטרופין (מ3.2) sc באגף אחד של העכבר.
12. לעשות חתך 1 סנטימטר הגחון קו האמצע דרך העור והצפק על ידי מספריים באמצעות וזוג אחד של מלקחיים. משכו בזהירות את 3-4 סנטימטר של מעי ולזהות גידולים אחד או כמה לתמונה.
13. קח MICR זכוכיתשקופית oscope ועמדת לולאה של המעי על זה עם גידול בראש.
14. להוסיף קצת דבק סופר לכמה מקומות לאורך המעי לצרף אותו לשקופית. חכה דק אחת לדבק להתייבש. השתמש סמן כדי לצייר קו בשקופית המצביעה על הגידול על מנת להקל הלוקליזציה שלה עם confocal.

.5 מיקום העכבר על הבמה והכנה לרכישת תמונה

1. הסר מעבדה קלטת מהגפיים.
2. פתח את שורת ההרדמה לבמה מיקרוסקופ ולסגור את אחד לפלטפורמה כירורגית.
3. העבר את העכבר בזהירות לבמה מיקרוסקופ עם הצד שלה הגחון למטה ואפה בחרטומו. לאבטח את קו ההרדמה עם כמה מעבדה קלטת.
4. Re-מקם את העכבר ו / או השקופיות כדי שיהיה לי המעי במרכזו של אחד מהחלונות החליק כיסוי. בעדינות קלטת את השקופית עם מעבדה קלטת.
5. צרף את הבדיקה oximeter לאיבר השמאלי של העכבר כדיאחרי הלב שלו ורמות שיעור וריווי חמצן עורקי נשימה.
6. כסה את העכבר עם שמיכת החימום, כדי למנוע היפותרמיה.
7. להקטין את ריכוז isoflurane מ2.5% ל1-1.5% להדמיה.

.6 רכישת תמונות על ידי שימוש בתוכנת μManager

1. להגדיל את מהירות CSUX ל -2,500 סל"ד כדי לשפר את איכות התמונה בהגדרות התצורה.
2. השתמש בתפריט הנפתח המטרה לבחור 10X 0.5 NA או 20X 0.75 אובייקטיבי עדשת NA Fluar.
3. בחר ננומטר לייזר 405 מתפריט הנפתח צבע.
4. לחץ על חיים ומכוונים את הפוקוס במיקרוסקופ.
5. לחץ על Auto כדי להתאים באופן אוטומטי עוצמות פיקסל מינימום ומקסימום של תמונת התצוגה המבוססים על ערכי פיקסל הקיצוניים בתמונה. היסטוגרמה של עוצמות פיקסל של תמונת התצוגה מוצגת בגרף בחלקו התחתון של החלון הראשי.
6. התאם את חשיפת המצלמה בחלון פייפר לוח הבקרה על ידישינוי המספר של שעונים (שעון אחד הוא 33.333 אלפיות שני).
7. אם האות בהיר מדי עם החשיפה הנמוכה ביותר, להקטין את עוצמת לייזר באמצעות יחידת בקרת מיקרוסקופ.
8. בדוק את עוצמת האות ל488 ננומטר, 561 ננומטר ו640 קווי לייזר ננומטר. להתאים את עוצמת לייזר עם היחידה של הלייזר של שליטה (488 ננומטר ו561 ננומטר) או יחידת בקרת מיקרוסקופ.
9. בחלון Multi D הרכישה, סמן את תיבת נקודות זמן והקלד במספר נקודות זמן, ומרווח זמן רצוי.
10. סמן את תיבת Z-הערימות, לבחור "Z היחסי" ומגדיר את Z-התחלה ויחסית Z-קץ למיקום הנוכחי.
    הערה: לקבלת 10X או 20X אובייקטיבי, להתחיל עם 3 מטוסי Z, 8 מיקרומטר או 4 מיקרומטר בנפרד בהתאמה.
11. סמן את תיבת עמדות מרובות (XY) להדמית מספר מקומות, ולאחר מכן לחץ על רשימת עמדת עריכה, לסמן 4 עד 6 עמדות שונות.
12. סמן את תיבת הערוצים ולהוסיף ערוצים מניו ובחר לייזרי קווים מהתפריט הנפתח והמשאדואר בחשיפה לכל ערוץ (בכפולות של 33.333 אלפיות שני).
13. בדקו תמונות שמור בחלון "רכישת Multi D".
14. בחר תיקייה וכל התמונות שנרכשו תישמר באופן אוטומטי בתיקייה זו עם השם שניתנת קידומת.
    הערה: כל רכישה רציפה תישמר בתיקיית משנה נפרדת כקבצי TIFF פרטניים לכל פרוסה Z בכל צבע בכל נקודת זמן.
15. שמור את כל ההגדרות על ידי לחיצה על שמור הגדרות בחלון Multi D הרכישה.
16. לחץ לרכוש בחלון הרכישה רב ממדי להתחיל רכישה.
17. אם הבדיקה oximeter אינה משמשת או מפסיקה לעבוד היטב (כאשר הדופק אינו יציב או קשה לזהות), לבדוק את היעילות של הרדמה כל 15 דקות במהלך הליך ההדמיה על ידי צובט שודדת הדרכים ובדיקת רפלקס בקרנית. התאם את ההרדמה אם העכבר הוא מגיב לגירויים אלה.
18. לאחר רכישה, להרדים את העכבר על ידי הגדלת concent isofluraneמנה עד 5%. כאשר אין תנועות נשימה הן לגילוי, להסיר את העכבר מהבמה ולבצע נקע בצוואר הרחם.

.7 ניתוח של תמונות על ידי שימוש בתוכנת Imaris

1. המרה ל.ims קבצים (איור 1 א המשלים)
   1. פתח את תוכנת המצלמה, לחץ על קובץ ולאחר מכן אצווה ממיר.
   2. לחץ על הוסף קבצים ולבחור את הקובץ הראשון של העמדה הראשונה. חזור על פעולה עבור כל עמדה.
   3. עבור כל קובץ שהועלה, לחץ על הגדרות ולוודא שההגדרות "t" עבור הזמן, "ג" לערוצים ו" z "עבור Z-ערימות מופיעות לפי הסדר הזה.
   4. חוסך בתיקייה הרצויה. לגלוש וליצור קובץ חדש כמומר.
   5. לחץ על הגדר עבור כל והתחל.
2. התאמות (משלים איור 1)
   1. לכו אל תיקיית המרה הספציפית ולפתוח את הקובץ הראשון.
   2. בחלון התאמת תצוגה, להתאים את הרקעהפסקת אות על ידי שינוי המספר מינימאלי לכל ערוץ במידת צורך.
   3. במידת צורך, להתאים את עוצמת האות על ידי שינוי המספר מקסימאלי (המספר מקסימאלי נמוך יותר, גבוה יותר את עוצמת האות).
      הערה: התאמות של עוצמה / ניגוד האות לאפשר גולת הכותרת של התנהגות תא או תא על מנת שתהיה יותר נחמדה להדמיה. זה לא משנה את התוצאה עצמה.
   4. לחץ על ערוך מאפיינים ותמונה.
   5. לשנות את x, y, z וערכים (ל10X אובייקטיבי, x, y = 0.712, z = 8 מיקרומטר; ל20X מטרה: x, y = 0.36, z = 4 מיקרומטר).
   6. לחץ על כל מרחק שווה להתאים נקודות זמן. הוסף את תאריך ההתחלה ושעת התחלה של הרכישה. הוסף את תאריך הסיום ושעת סיום של הרכישה (1C איור משלים).
   7. לחץ על כפתור Play כדי לראות את הסרט.
   8. לחץ על עריכה ומחיקה נקודות זמן למחוק תמונות מטושטשות.
   9. כדי להצטרף ט.ו.ג. שתי רכישות נפרדותיס לתוך סרט אחד, ללכת לנקודת הזמן האחרונה של הסרט הראשון ולחץ על Edit> הוסף נקודות זמן להוסיף את הקובץ השני.
3. שמירה כסרט (1D איור משלים)
   1. לחץ על רשומה, לבחור את סיומת .mov וגורם דחיסה של 0.
   2. לחץ על Save.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות מיקרוסקופיה confocal הדיסק מסתובבת, רקמות שאינן tumoral וtumoral במעי הדק של Apc ^{מינימום / +;} ACTB-ECFP; ניתן דמיינו עכברים c-FMS-ECFP מפני שטח serosal. לאחר הדמיה, תוכנת מצלמה משמשת כדי לנתח ולהתאים את הרכישה (איור משלים 1). לאחר (iv) הזרקה תוך ורידית של dextran-rho...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במאמר זה, פרוטוקול מפורט מתואר לספינינג confocal הדמיה דיסק של דינמיקת תא מיאלואידית בגידולים במעי במשך כמה שעות בחי, צילמו מהצד serosal של המעיים.

כדי להימנע מדלקת ויש להם תנאים פיסיולוגיים אופטימליים, הדמיה של המעי צריכה להיעשות על הא?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ApcMin/+ mice	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
Nitrogen	UCSF
Oxygen	UCSF
1x PBS	UCSF cell culture facility
Saline Buffer	UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse
Atropine	LARC UCSF		Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes	Becton Dickinson	326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe	Becton Dickinson	329465
Remium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5M	24x50-1
Betadine	LARC UCSF
Heat blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch	Electron Microscopy Sciences	72310-10
Anesthesia system	Summit Anesthesia Support
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
Stage insert	Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit Anesthesia Support
Imaris	Bitplane
μManager	Vale lab, UCSF		Open-source software
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b