Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Özet

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the Apc^Min/+ colorectal cancer model.

Özet

Myeloid hücreler tümörler içinde en bol bulunan bağışıklık hücreleri ve tümör gelişimini teşvik ettiği gösterilmiştir. Modern Intravital görüntüleme teknikleri organ içindeki canlı hücresel davranış gözlem imkanı ancak bağırsak gibi nedeniyle, organ ve tümör erişilebilirlik bazı kanser türlerinde zor olabilir. Bağırsak tümörlerinin doğrudan gözlenmesi, daha önce bildirilmemiştir. Burada tarif edilen bir cerrahi prosedür transgenik fareler flüoresan raportör ve enjekte edilebilir izleyiciler ya da antikorları kullanarak, canlı farelerde bağırsak tümörler içinde miyeloid hücre dinamikleri doğrudan gözlem sağlar. Bu amaç için, hızlı bir görüntü elde etme ve uzun süreli kesintisiz görüntüleme sağlayan bir dört renkli, çok-bölgeli, mikro mercekli döner disk konfokal mikroskop kullanılır olmuştur. Çaprazlanır ince bağırsakta çok adenom geliştirmek Apc ^{Min / +} fareleri miyeloid hücreleri görselleştirmek için, c-fms-EGFP fareler ve ACTB-eCFP fareler ilekriptaların bağırsak epitel hücreleri görselleştirmek için. , Kan damarları ve nötrofil ve serozal yüzeyi boyunca tümör görüntüleme için konumlandırılması için bir prosedür olarak, farklı tümör bileşenleri etiketlenmesi için prosedürler de tarif edilmiştir. Görüntülemenin birkaç saat derlenen Time-lapse film bağırsak mikroçevresinin in situ miyeloid hücre davranış analizini sağlar.

Giriş

Tüm veriler hemen fibroblastlar, endotel hücreleri, bağışıklık ve enflamatuvar hücrelerde, hücre üstü matris ve çözünür faktörler dahil olmak üzere heterojen hücre popülasyonu, aşağıdakilerden oluşan tümör mikro, hemen hemen tüm katkıda başlatılması ve katı tümörlerin ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını ortaya koymaktadır kanser ¹ özellikleridir. Nitekim, tümör ilerlemesi esnasında, malignite ² elverişli bir mikro oluşturmak için gelişmeye dönüştürülmüş kanser hücreleri ve stromal hücreler arasında sürekli dinamik etkileşimler vardır. Tümör mikro infiltre hücreler arasında immün, miyeloid hücreleri, ^3, en bol miktarda bulunmaktadır. (TAM) tümörle ilişkili makrofaj oluşan miyeloid türevi bastırıcı hücreleri (MDSCs), dendritik hücreler (DC) ve nötrofil (PMNler), miyeloid hücreler, kemik iliğinden kişi etüde dahil edilir ve kademeli olarak sitokinler, büyüme faktörleri ve proteazlar serbest, tümör infiltre teşvik edebilirtümör büyümesi ve ⁴ yayıldı. Kanser hücreleri ve miyeloid hücreleri arasındaki karışma karmaşık ama dinamiktir. Böylece onların etkileşimlerinin doğası anlayışı bu hücrelerin yerine bir anti-tümör immün yanıtı katılan kanser ilerlemesini teşvik neden belirlemede çok önemli olduğunu ve onu kontrol etmek için yeni hedefler bulmak için yardımcı olabilir.

Intravital mikroskobu ile doğrudan gözlem canlı farelerde ⁵ dokuların içinde hücre dinamikleri hakkında bilgi sağlar. Dört renkli, çok-bölgeli, mikro mercekli döner disk konfokal sistemi meme tümörlerinin ⁶ olan stromal hücreler incelemek için dizayn edilmiştir. Bu yaklaşım uzun vadeli sürekli görüntülenmesine olanak sağlar ve bu hareket eserler en aza indirmek için, (a) hızlı görüntüleri edinme, (b) uzun süreli anestezi, (c) farklı hücre tiplerini takip dört renk satın alma, (d) floresan etiketleme gibi çeşitli avantajlar içermektedir Farklı tümör bileşenler ve farklı tümör mikroçevrelerde zeka (e) gözlemAynı fareyi hin fare değişkenliği ^7-9 fare önlemek için. Bu teknoloji ile, farklı hücre davranışlar tümör oluşumunun progresif aşamalarını gösterir meme tümör virüsü (MMTV) promoterinin yükseltici sürüşlü polioma orta T onkojen (PyMT) modeli olarak bildirilmiştir. (Foxp3 ^EGFP transgen tarafından görüntülenmiştir Tregs) kan damarları yakınında tercihli göç düzenleyici T-lenfositler DH'lerin (CD11c'nin-DTR-EGFP), karsinom ilişkili fibroblastlar (FsP1 ^{+ / +} -EGFP) ve miyeloid hücreleri (c-FMS ise -EGFP) tümör kitlesi içinde daha tümör çevresi daha yüksek hareketlilik gösterirler. Akut sistemik hipoksi durumda, hücreler farklı göç: Tregs ⁶ hareket etmeye devam miyeloid hücrelerinin aksine göç dur. Buna ek olarak, aynı fare modelinde, tümör aşaması ile bu doksorubisin duyarlılık değişiklikleri gösterilmiştir, ilaç dağıtım ilaç tepkisi ve doksorubisin ile ilgilidirTedavi tümörlere miyeloid hücrelerin CCR2 bağımlı işe yol açar. Böylece, canlı görüntüleme ayrıca yerinde ilaç yanıtları anlayışlar ve kemoterapi direncinin ^10,11 biyolojisini kazanmak için kullanılabilir.

Adenomatus poliposis koli (APC), gen mutasyonu genel olarak insan kolorektal adenomlar ve karsinomlar ¹² ve ¹³ kolon kanseri için son derece yüksek bir risk faktörüdür ailevi adenomatoz polipoz (FAP), APC gen sonuç tek bir kopyasının mutasyon meydana gelir. Fare suşu Süm ^{Min / +} Süm geni kodon 850 bir kesme mutasyonu taşıyan ve kendiliğinden bütün ince bağırsağın ^14-16 üzerindeki birden fazla bağırsak adenomu gelişir. Periton boşluğuna açma bağırsak erişim için gerekli olduğu bağırsak uzun süreli intravital görüntüleme, çünkü işlemin invaziflik zordur. Kısa vadeli canlı görüntüleme studies önceden sağlıklı bağırsak ^17,18 yayınlanmıştır ancak, bağırsak tümörleri uzun vadeli doğrudan gözlem rapor edilmemiştir. Bir cerrahi prosedür, daha önce Resim göğüs tümörlerinde ^6,10 kullanılan İntra vital mikroskopik döner disk sistemi kullanılarak tasarlanmış ve bağırsak serozal yüzeyi boyunca tümörlerin görselleştirmek için rafine edilmiştir. Bu makalede, bir protokol bir Apc ^{asgari / +} fareleri kullanarak küçük bağırsakta da ötesi tümörler içerisindeki miyeloid hücrelerinin hareketlerine de takip etmesini sağlar tarif edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Tüm hayvan deneyleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), ucsf tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak yapılmıştır. Tüm görüntüleme deneyleri hayatta olmayan prosedürler ve hayvanların görüntü elde sonunda hemen sonra ötenazi edildi.

1. Farelerin Üretimi

Not: Apc genindeki bir mutasyon taşıyan Apc ^{Min / +} fareleri, kendiliğinden ince bağırsakta 50-100 adenomlar gelişir.

1. Çapraz Apc ^Min miyeloid hücreleri tespit etmek için c-fms ihtiva promotör altında EGFP ifade c-fms ihtiva EGFP hattı ile ACTB-eCFP aktin destekçisi altında eCFP ifade hattı, ve bundan başka, birlikte ^{/ +} fareler. ACTB-eCFP ve c-fms EGFP için heterozigot olan hayvanlar, floresans tespit etmek için kullanılır.
2. Görüntü net saptanabilir adenom için 3-4 aylık yaşta fareler kullanın.

M 2. HazırlıkAmeliyattan Önce aterials

NOT: mikroskop set-up detayları daha önce hiç ^6,7 tarif var.

1. Mikroskop
   1. Isıtma battaniye açın. 488 nm'de uyarma ve katı hal 405 nm, 561 nm ve 640 nm lazer argon lazer açın. Mikroskop açın, dönen disk kontrol birimi, AOTF, lazer kontrol ünitesi ve kamera denetleyicisi.
   2. LED kırmızıya döner mikroskop deklanşöre açın. Bilgisayar ve kamera yazılımı açın.
2. Görüntüleme Platformu
   1. Sahne insert temiz olduğundan emin olun. Aksi takdirde, su ve sabun ve daha sonra kuru temiz.
   2. İki lamelleri al ve insert onları korumak için laboratuvar bandı kullanın. Sahnede parçayı yerleştirin ve alkol mendil ile temizleyin.
   3. Laboratuvar bant kullanarak, sahnenin sağ tarafına ısıtma battaniye takın.
   4. Burun konisi üzerindeki kauçuk diyaframın bütünlüğünü doğrulamak ve Mutlaka eğer bunu değiştirmekY. Konumu ve gazlı bez ve laboratuar bant kullanarak hayvana izofluran anestezi teslimat için burun konisi düzeltmek.
3. İsofluranın Anestezi Sistemi
   1. Izofluran tankı doldurun.
   2. Vakum açın ve / dk 1.2 L ayarlayın.
   3. Nebulizere damıtılmış su ekleyin ve izofluran sisteme nebulizatörü bağlayın.
   4. Oksijen analizörü açın ve izofluran sisteme bağlayın. Oksijen deposu açın ve oksijen analizörü% 100 gösterir emin olun. 0,2 l / dk için O ₂ akışını ayarlayın.
   5. Azot tankına açın ve / dk 0.8 L akışını ayarlamak. Oksijen analizörü 21% gösterdiğinden emin olun.
4. Cerrahi Alet ve Platform Hazırlanması
   1. Sabun ve su ile diseksiyon forseps ve makas temiz 2 çift.
   2. Sıcak boncuk sterilizatör açmak ve 250 ° C ye izin verin. 30 sn için cerrahi aletleri sterilize. Onları soğumasını bekleyin.
   3. Cerrahi bankta bir laboratuvar sağanak yerleştirin.
   4. Cerrahi bir platform olarak bir Strafor kapağı kullanın. Laboratuar Batmışın bir parça ile örtün. Fareyi tıraş sonra değiştirmek için laboratuar Batmışın ikinci bir parça hazırlayın.
   5. Kaplı Strafor kapağındaki anestezi hattı ile burun konisi yerleştirin ve bazı bant ile (değil laboratuar ıslatıcıya üzerine) Strafor kapağına takın ve yerinde tutmak için burun konisi her iki tarafında iki iğne kullanın.
   6. Betadine, alkol mendil, steril gazlı bez, süper yapıştırıcı, mikroskop slaytlar, elektrikli tıraş makinesi, ve laboratuvar bant 4 adet birleştirin.

Enjeksiyonlar 3. hazırlanması

1. Kapağın altında, bir insülin şırıngası hazırlanması (28 g x ½ cm) 2,000 kDa rodamin-dekstran (4 mg / ml 100 ul stok içine AF647 konjuge edilmiş Ly-6G (Gr1) antikoru (1 mg / ml), 7 ul ) retro-orbital enjeksiyon için. Bu hayvanlarda gelişen anemi kuyruk damarları difficu yapar bu yana retro-orbital enjeksiyon Süm ^{Min / +} farelerde tavsiye edilirlt deri yoluyla algılamak için.
2. Bağırsağın peristaltik hareketlerini azaltmak için görüntüleme önce 1 mg / kg deri altından (sc), 150 ul PBS içinde seyreltilmiş atropin enjeksiyonu ile bir ikinci insülin şırınga hazırlayın.

Görüntüleme için Bağırsak 4. hazırlanması

1. Indüksiyon odasına anestezi hattı açık ve cerrahi masa ve mikroskop çizgiler kapalı olduğunu doğrulayın.
2. Anestezi odasına hayvan aktarın. Anestezi odasına kapatın ve (% 21 O _2)% 4 izofluran açın.
3. Fare derinden ve yavaş yavaş (5-6 dakika sonra) nefes aldığında, onun kanadında cerrahi sahneye aktarmak ve Gr1 antikor çözüm ve / veya dekstran solüsyonu, retro-orbital enjekte.
4. Cerrahi platforma bağlı anestezi hattını açın. Anestezi odasına hattını kapatın ve anestezi koni onun burun sırtında fare koymak.
5. Izofluran azaltın% 4 den% 2.5 'e konsantrasyonu.
6. Fare de onun Kapkaççı tutup kornea refleks testi ile anestezi doğrulayın.
7. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik yağlama merhem ekleyin.
8. Laboratuvar bant ekleyerek cerrahi aşamasına fare bacaklarda sabitleyin.
9. Elektrikli tıraş makinesi ile ventral yüzeyi saç çıkarın. Ayrıca satın önce oksimetreden konumlandırmak için sol arka bacağındaki saç kaldırmak. Cerrahi aşamasından laboratuvar Sağanak çıkarın ve saç kontaminasyonu önlemek için temiz bir biri ile değiştirin.
10. Alkol mendil ve betadin ventral yüzeyi dezenfekte edin.
11. Fare bir böğrüne sc (3.2) atropin çözüm enjekte.
12. Deri yoluyla 1 cm ventral orta hat kesi ve kullanarak makas ile periton ve forseps bir çift olun. Dikkatle bağırsak 3-4 cm çekin ve görüntü bir veya birkaç tümörleri tespit.
13. Cam MICR almakOscope slayt pozisyonu ve üst kısmında bir tümör ile üzerine bağırsağın bir döngü.
14. Slayt takmak için bağırsak boyunca birkaç yerde bazı süper yapıştırıcı ekleyin. Tutkal kuruması için bir dakika bekleyin. Konfokal ile lokalizasyon kolaylaştırmak için tümöre işaret sürgü üzerinde bir çizgi çizmek için bir işaretçiye kullanın.

5. Konumlandırma Sahne üzerinde Fare ve Hazırlık Image Acquisition için

1. Bacaklarda laboratuvar bandı çıkarın.
2. Mikroskop sahneye anestezi hattını açın ve cerrahi platforma birini kapatın.
3. Aşağı ventral yüzü ve burun konisi burnunun ile mikroskop aşamasında dikkatlice fare aktarın. Bazı laboratuvar bant ile anestezi hattını sabitleyin.
4. Yeniden konumlandırmak kapak astarlı pencerelerden birinin merkezinde bağırsak olması için fare ve / veya slayt. Yavaşça laboratuvar bant ile slayt aşağı bantlayın.
5. Farenin sol bacağa için oksimetre probu takınonun kalp ve solunum hızı ve oksijen satürasyonu düzeylerini izleyin.
6. Hipotermi önlemek için ısıtma battaniye ile fareyi örtün.
7. Görüntüleme için 1-1.5% 2,5 den% izofluran konsantrasyonu azaltır.

ΜManager Yazılımı Kullanarak Görüntüleri 6. kazanılması

1. Yapılandırma Ayarlar görüntü kalitesini iyileştirmek için 2.500 rpm CSUX hızını artırın.
2. 10X 0.5 NA veya 20X 0.75 NA Fluar objektif hedefi seçmek için Amaç açılır menüsünü kullanın.
3. Renk açılır menüden lazer 405 nm seçin.
4. Live tıklayın ve mikroskop ile odağı ayarlayın.
5. Otomatik olarak görüntüdeki aşırı piksel değerlerine dayanan Ekrandaki görüntünün maksimum ve minimum piksel yoğunlukları ayarlamak için Otomatik tıklayın. Ekran görüntüsünün piksel yoğunluğunun bir histogram Ana Pencere alt kısmında grafikte sunulmuştur.
6. Tarafından Piper Denetim Masası penceresinde kamera pozu ayarlayınsaatlerin sayısını (Bir saat 33.333 msn'dir) değişiyor.
7. Sinyal düşük pozlama ile çok parlak ise, mikroskop kontrol birimini kullanarak lazer yoğunluğunu azaltmak.
8. 488 nm, 561 nm ve 640 nm lazer çizgileri için sinyal yoğunluğu kontrol edin. Lazerin kendi kontrol ünitesi (488 nm ve 561 nm) veya mikroskop kontrol ünitesi ile lazer yoğunluğunu ayarlayın.
9. Çoklu D Toplama penceresinde, Zaman noktaları kutusunu işaretleyin ve zaman noktalarının sayısını ve istenilen zaman aralığını yazın.
10. , Z-yığınlarının kutusunu işaretleyin "göreli Z" seçin ve mevcut konumda Z-start ve Z-uç göreli tanımlar.
    NOT: 10X veya 20X hedefi için ayrı sırasıyla 3 Z uçakları, 8 mm veya 4 mikron ile başlar.
11. Çeşitli yerlerde görüntüleme için birden çok pozisyonlar (XY) onay kutusunu, ardından Düzen pozisyon listesini tıklatın 4 ila 6 farklı pozisyonlar işaretleyin.
12. Kanallar kutusunu işaretleyin ve Yeni kanalları ekleyebilir ve lazer yazıcılarını açılır menü ve typ satırları seçin(33.333 msn adedi) her kanal için maruz e.
13. "Çoklu D kazanım" penceresinde Kaydet görüntüleri kontrol edin.
14. Bir klasörü seçin ve elde edilen tüm görüntüleri otomatik olarak verilen isim öneki ile bu klasöre kaydedilir.
    NOT: Her sürekli tedarik her zaman noktasında her renkte her Z dilim için ayrı tiff dosyaları olarak ayrı bir alt klasörde kaydedilir.
15. Çoklu D Toplama penceresinde Ayarları kaydet tıklayarak tüm ayarları kaydedin.
16. Edinimi başlatmak için Çok boyutlu Toplama penceresinde Al'ı tıklatın.
17. Oksimetre probu kullanılmaz ya da durması halinde (darbe sabit veya tespit etmek zor değil olduğunda), Kapkaççı tutup kornea refleksi kontrol ederek anestezi verimi görüntüleme işlemi sırasında her 15 dakikada bir kontrol edin. Fare bu uyaranlara duyarlı ise, anestezi ayarlayın.
18. Aldıktan sonra, izofluran yoğunlaşan artırarak fare euthanize% 5 oranı. Hiçbir solunum hareketleri saptanabilir olduğu, sahneden fare kaldırmak ve servikal çıkık gerçekleştirin.

Imaris Yazılımı Kullanarak Görüntüleri 7. Analiz

1. Dönüşüm Dosyaları (Ek Şekil 1A) .ims için
   1. , Kamera yazılımı açın Dosya daha sonra Batch Converter tıklayın.
   2. Tıklayın dosya ekleme ve ilk pozisyonun ilk dosyayı seçin. Her pozisyon için tekrarlayın.
   3. Yüklenen her dosya için, Ayarlar üzerine tıklayın ve Z-yığınları için Zaman Kanallarının için, "c" ve "z" için ayarlar "t" bu sırayla görünür doğrulayın.
   4. İstediğiniz klasöre kaydedin. İnsanlar ve dönüştürülmüş olarak yeni bir dosya oluşturun.
   5. Tüm için Set tıklayın ve başlayın.
2. Düzeltmeler (Ek Şekil 1B)
   1. Belirli Dönüştürülen klasörüne gidin ve ilk dosyasını açın.
   2. Ekran Ayarı penceresinde, arka plan ayarlamakGerekirse her kanal için Min numarasını değiştirerek sinyal kesme.
   3. Gerekirse, Çok sayıda (en alt Çok sayıda yüksek sinyalin yoğunluğu) değiştirerek, sinyal yoğunluğu ayarlayın.
      NOT: sinyal yoğunluğu / kontrast ayarlamaları güzel bir görselleştirme olması için bir hücre davranışı ya da bir bölmesinin vurgulamak etkinleştirin. Bu sonuç kendisi değişmez.
   4. Düzen ve Görüntü Özellikleri tıklayın.
   5. X, y, ve z değerlerini değiştirin (10X objektif, x ve y = 0,712, z = 8 mikron için, bir 20X objektif için: x ve y = 0.36, z = 4 mikron).
   6. Zaman noktalarını ayarlamak için tüm eşit mesafede tıklayın. Başlangıç ​​tarihini ekleyin ve satın alma başlangıç ​​zamanı. Bitiş tarihini ekleyin ve iktisap (Ek Şekil 1C) zaman sonuna.
   7. Film izlemek için Oynat düğmesine tıklayın.
   8. Düzenle'yi tıklatın ve bulanık görüntüleri silmek için zaman noktaları silin.
   9. İki ayrı satın almalar Toge katılmak içinther bir film içine, ilk filmin son kez noktasına gidin ve Düzenle üzerine tıklayın> ikinci bir dosya eklemek için zaman puan ekleyin.
3. Bir film olarak kaydetme (Ek Şekil 1D)
   1. , Record tıklayın .mov uzantısı ve 0 bir sıkıştırma faktörü seçin.
   2. Kaydet butonuna tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

ACTB-eCFP;; Süm ^{Min / +} küçük bağırsakta dönen disk konfokal mikroskopi, tümöral olmayan ve tümoral dokuları kullanılarak c-fms-eCFP farenin seröz yüzeyden görülebilir. Görüntüleme sonra, kamera yazılımı analiz ve satın alma (Ek Şekil 1) ayarlamak için kullanılır. Floresan 2000 kDa dekstran-rodamin intravenöz (IV) enjeksiyonu ve bir Ly-6G 647 ile konjüge edilmiş antikor, sonra, kan damarları ve PMN idi (Şekil 1) tespi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda ayrıntılı protokol bağırsak serozal taraftan görüntülenmiş bir canlı hayvanda bir kaç saat için intestinal tümörlerde miyeloid hücre dinamikleri disk confocal görüntüleme eğirme için bir işlem açıklanmaktadır.

Inflamasyonu önlemek için ve en iyi fizyolojik koşulları için, bağırsak görüntüleme, bozulmamış organ üzerinde yapılmalıdır. Işık epitel ulaşmadan önce bu tür düz kas olarak çeşitli doku katmanlarının geçmesi gerekir Ancak, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ApcMin/+ mice	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
Nitrogen	UCSF
Oxygen	UCSF
1x PBS	UCSF cell culture facility
Saline Buffer	UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse
Atropine	LARC UCSF		Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes	Becton Dickinson	326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe	Becton Dickinson	329465
Remium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5M	24x50-1
Betadine	LARC UCSF
Heat blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch	Electron Microscopy Sciences	72310-10
Anesthesia system	Summit Anesthesia Support
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
Stage insert	Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit Anesthesia Support
Imaris	Bitplane
μManager	Vale lab, UCSF		Open-source software
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b