골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Caroline Bonnans; Marja Lohela; Zena Werb

doi:10.3791/51916

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기사 소개

요약
초록
서문
프로토콜
결과
토론
공개
감사의 말
자료
참고문헌
재인쇄 및 허가

요약

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the Apc^Min/+colorectal cancer model.

초록

골수 세포는 종양 내에서 가장 풍부한 면역 세포이며 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다. 현대의 intravital 이미징 기술은 기관 내부의 살아있는 세포 행동의 관찰을 가능하게되지만, 소장으로 인한 장기 및 종양 접근성 일부 암에서 문제가 될 수 있습니다. 장내 종양의 직접적인 관찰은 이전에보고되지 않았습니다. 여기에 설명 된 수술은 형질 전환 형광 기자 마우스와 주사 추적자 또는 항체를 사용하여 살아있는 생쥐의 장내 종양 내에서 골수 세포 역학의 직접 관찰 할 수 있습니다. 이를 위해, 신속한 화상 취득 장기 연속 촬상을 허용 4 색 멀티 영역, 마이크로 렌즈 효과 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고있다. 교차 소장의 여러 선종 개발 APC ^{최소 / +} 마우스 골수 세포를 시각화하는 C-FMS-EGFP 마우스와 ACTB-ECFP 마우스와 함께지하실의 장 상피 세포를 시각화합니다. 이러한 혈관 및 호중구 및 장막 표면을 통해 이미징 종양을 위치시키기위한 절차와 다른 종양 성분을 라벨링하는 절차도 설명된다. 영상의 몇 시간에서 컴파일 시간 경과 영화는 장 미세 환경에서 현장에서 골수 세포 행동의 분석을 할 수 있습니다.

서문

절대적인 증거 해주기 섬유 아세포, 내피 세포, 면역 및 염증 세포, 세포 외 기질, 및 가용성 인자를 포함한 이종 세포 집단 이루어진 종양 미세 환경은, 거의 모든 기여함으로써 개시 및 고형 종양의 진행에 중요한 역할을한다는 것을 보여 암 ^하나의 특징. 사실상, 종양 진행 중에, 악성 ^종양이 유리한 미세 환경을 생성하도록 형질 전환 된 진화 암세포 및 간질 세포 간의 일정한 동적 상호 작용이있다. 종양 미세 환경에 침투 면역 세포 중 골수 세포는 ^세 가장 풍부하다. (TAM) 종양 관련 대 식세포로 구성된 골수 유래 억제 세포 (MDSCs), 수지상 세포 (DC) 및 호중구 (백혈구), 골수 세포는 골수에서 모집하고 점진적으로 사이토 카인, 성장 인자 및 단백질 분해 효소 방출, 종양에 침투 홍보 할 수 있습니다종양의 성장 및 ^4를 확산. 암 세포와 골수 세포 사이의 크로스 토크는 복잡하지만 동적이다. 따라서, 상호 작용의 성질에 대한 이해는 이들 세포 대신 항 종양 면역 반응에 참여하는 암의 진행을 촉진 결정하는 중요한 이유이며, 그것을 제어하기위한 새로운 타겟을 찾는 데 도움이 될 수있다.

의 intravital 현미경으로 직접 관찰은 살아있는 쥐 ^5의 조직 내에서 세포 역학에 대한 정보를 제공합니다. 이 4 색은, 다중 영역은 마이크로 렌즈 효과 회전 디스크 촛점 시스템은 유방 종양 ⁶ 내의 간질 세포를 연구하기 위해 디자인되었다. 이 방법은 장기의 연속 영상을 구현하고 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 (a) 급 이미지 획득, (b) 장기 마취, (c) 상이한 세포 유형을 따르는 네 가지 색상 취득, (D), 형광 표지 등의 여러 장점을 포함 다른 종양 구성 요소 및 다른 종양 미세 환경의 재치 (E) 관찰같은 마우스를 힌 것은 마우스 변동성 ^7-9로 마우스를 방지 할 수 있습니다. 이러한 기술을 통해 다른 세포 행동은 종양의 진보적 인 단계를 표시하는 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 중심 폴리오 중간 T 종양 유전자 (PyMT) 모델에서보고되었다. (Foxp3의 ^EGFP 형질 전환 ^유전자에 의해 시각 Tregs) 혈관에 근접 우선적으로 마이그레이션 규제 T 림프구 수지상 (의 CD11c-DTR-EGFP), 암 관련 섬유 아세포 (Fsp1 ^{+ / +-EGFP)} 및 골수 세포 (C-FMS 반면, -EGFP)은 종양 덩어리 내에보다 종양 주변부에서 높은 운동성을 나타낸다. 급성 전신 저산소증의 상태에서 세포는 다른 마이그레이션 : Tregs는 ⁶ 계속 이동 골수 세포는 대조적으로 마이그레이션 중지합니다. 또한, 동일 마우스 모델에서, 종양은 단계와 그 독소루비신 감도 변화를 도시 한 약물 분포를 약물 반응, 및 독소루비신 관련된치료는 종양 세포의 골수 CCR2 의존적 채용 리드. 따라서, 라이브 영상도 현장에서 약물 반응에 대한 통찰력과 chemoresistance ^{10, 11의} 생물학을 높일 수 있습니다.

선종 성 용종증 대장균 (APC) 유전자 돌연변이는 일반적으로 인간의 대장 선종 및 암 ^(12)과 대장 암 ^(13)에 대한 매우 높은 위험을 수여 가족 성 선종 성 용종증 (FAP)에있는 APC 유전자 결과의 단일 사본의 돌연변이에서 발생합니다. 마우스 변형 APC ^{최소 / +는} APC 유전자의 코돈 850의 절단 돌연변이를 수행하고 자발적으로 모든 소장 ^{14 ~ 16에} 걸쳐 여러 장 선종을 개발하고 있습니다. 복강을 여는 부위에 액세스하기위한 필요가 있기 때문에 소장의 장기의 intravital 이미징 때문에 절차의 침습성의 도전이다. 단기 라이브 영상 성udies는 이전에 건강한 장 ^{(17, 18)에} 간행되었지만, 장내 종양의 장기 직접 관찰은보고되지 않았습니다. 수술 이전 화상 유방 종양 ^6,10 사용의 intravital 스피닝 디스크 현미경 시스템을 사용하여 설계 및 소장의 장막면을 통해 종양 시각화 정제되었다. 이 논문에서, 프로토콜은 하나의 APC ^{최소 / +} 마우스를 사용하여 소장 종양 내 골수 세포의 행동을 수행 할 수 있다는 설명한다.

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프로토콜

주 : 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), UCSF의 승인 절차에 따라 수행 하였다. 모든 촬상 실험 비 생존 절차이었고 동물은 화상 획득의 종료 후 즉시 안락사시켰다.

마우스의 1 세대

참고 : APC 유전자에 돌연변이를 들고 APC ^{최소 / +} 마우스는, 자발적으로 소장에서 50 ~ 100 선종을 개발한다.

크로스 APC ^최소 골수 세포를 감지하는 C-FMS 프로모터에서 EGFP을 표현하는 C-FMS-EGFP 라인 ACTB-ECFP의 액틴 프로모터에서 ECFP을 표현 라인, 또한과 ^{/ +} 마우스. ACTB-ECFP 및 C-FMS-EGFP 이형 동물 형광을 감지하는 데 사용됩니다.
이미지를 명확하게 검출 선종에 연령 3 ~ 4 개월에 마우스를 사용합니다.

M의 2 준비수술 전에 aterials

참고 : 현미경 셋업의 세부 이전 된 ^6,7 설명했다.

현미경
1. 가열 담요를 켭니다. 488 nm의 여기 및 고체 405 nm의, 561 nm의 및 640 nm의 레이저에 대한 아르곤 레이저를 켭니다. 현미경의 전원을 켜고 회전 디스크 제어 장치, AOTF, 레이저 제어 장치, 카메라 컨트롤러.
2. LED가 빨간색으로 바뀌 현미경 셔터를 엽니 다. 컴퓨터와 카메라 소프트웨어를 켭니다.
이미징 플랫폼
1. 무대 인서트가 깨끗한 지 확인합니다. 그렇지 않으면, 비누와 물로 후 건조 깨끗.
2. 이 커버 슬립을 가지고 삽입물을 확보하기 위해 실험실 테이프를 사용합니다. 무대에서 삽입을 놓고 알코올 와이프로 청소.
3. 실험실 테이프를 이용하여, 상기 스테이지의 오른쪽으로 가열 블랭킷 첨부.
4. 코 콘에 고무 다이아 프램의 무결성을 확인하고 necessar하면 변경y를 입력합니다. 위치 및 거즈 랩 테이프를 사용하여 동물에 이소 플루 란 마취 전달을위한 코 콘을 수정합니다.
이소 플루 란 마취 시스템
1. 이소 플루 란 탱크를 채우십시오.
2. 진공 켜고 / 분 1.2 L로 조정합니다.
3. 분무기에 증류수를 추가하고 이소 플루 란 시스템에 분무기를 연결합니다.
4. 산소 분석기를 켜고 이소 플루 란 시스템에 연결합니다. 산소 탱크의 전원을 켜고 산소 분석기는 100 %가 표시되는지 확인합니다. / 분 0.2 L에 _O이 흐름을 조정합니다.
5. 질소 탱크를 켜고 / 분 0.8 L의 흐름을 조정합니다. 산소 분석기는 21 %가 표시되는지 확인합니다.
수술 도구 및 플랫폼의 준비
1. 비누와 물로 해부 집게와 가위의 청소 2 쌍.
2. 뜨거운 비드 살균기를 켜고는 250 ° C에 도달 할 수 있습니다. 30 초 동안 수술 도구를 소독. 이를 식혀 보자.
3. 수술 벤치에 실험실 담그는 배치.
4. 수술 플랫폼으로 스티로폼 뚜껑을 사용합니다. 실험실 술고래의 조각으로 커버. 마우스를 면도 후 변경 실험실 술고래의 두 번째 조각을 준비한다.
5. 덮여 스티로폼 뚜껑에 마취 라인 코 콘을 배치하고 일부 테이프 (안 실험실 담그는)에 스티로폼 뚜껑에 부착 장소에 보관하는 코 콘의 양쪽에 두 개의 바늘을 사용합니다.
6. betadine, 알코올 잎사귀, 멸균 거즈, 슈퍼 접착제, 현미경 슬라이드, 전기 면도기, 및 실험실 테이프 4 개를 조립합니다.

주사의 3 준비

후드에서 인슐린 주사기 준비 (28 G X ½)에 2,000 kDa의 로다 민 - 덱스 트란 (4 ㎎ / ㎖ 100 ㎕ 스톡의 AF647 - 복합 LY-6G (GR1) 항체 (1 ㎎ / ㎖)의 7 μL로 ) 복고풍 궤도 주입. 이 동물에서 개발 빈혈 꼬리 정맥 difficu를 만드는 것이므로 레트로 궤도 주사 APC ^{최소 / +} 생쥐에서 권장지금이 피부를 통해 검색 할 수 있습니다.
대장의 연동 운동을 저해 이미징 전에 1 ㎎ / ㎏ 피하 (SC)에 150 ㎕의 PBS에 희석 아트로핀 주사 초 인슐린 주사기를 준비합니다.

이미지에 대한 소장의 4 준비

유도 챔버로 마취 회선이 오픈하고, 수술 테이블과 현미경에 라인이 닫혀 있는지 확인합니다.
마취 챔버에 동물을 전송합니다. 마취 챔버를 닫고 (21 % O ₂₎ 4 %로 이소 플루 란을 켭니다.
마우스 깊이 천천히 (5-6 분 후) 통기성이 때, 그 측면에 수술 스테이지로 전송하고 GR1 항체 용액 및 / 또는 덱스 트란 용액 레트로 궤도 상을 주사.
수술 플랫폼에 연결된 마취 라인을 엽니 다. 마취 실에 줄을 닫고 마취 콘에서 코와의 뒷면에 마우스를 넣어.
이소 플루 란을 줄4 %에서 2.5 %로 농도.
마우스가 아니라 그것의 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 테스트하여 마취되어 있는지 확인합니다.
마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 눈에 안과 윤활 연고를 추가합니다.
실험실 테이프를 추가하여 수술 단계로 마우스의 사지를 고정합니다.
전기 면도기를 사용하여 복부 표면에서 머리를 제거합니다. 또한 인수하기 전에 산소 측정기의 위치를 왼쪽 뒷다리에서 머리를 제거합니다. 수술 단계에서 실험실 담그는를 제거하고 머리의 오염을 방지하기 위해 깨끗한 하나를 교체합니다.
알코올 잎사귀와 betadine와 복부 표면을 소독.
마우스의 한 측면에서 SC (3.2) 아트로핀 용액을 주입한다.
피부를 통해 1cm 복부 정중선을 절개하여 가위에 의한 복막 및 포셉 한 쌍을 확인합니다. 조심스럽게 소장의 3-4센티미터을 끌어와 이미지에 하나 또는 여러 개의 종양을 식별합니다.
유리 MICR을 가지고oscope 슬라이드와 위치를 상단에 종양 그것에 소장의 루프.
슬라이드에 부착하는 소장을 따라 몇 위치에 어떤 슈퍼 접착제를 추가합니다. 접착제가 마를 때까지 한 분을 기다립니다. 공 초점과의 현지화를 촉진하기 위해 종양을 가리키는 슬라이드에 선을 그릴 수있는 마커를 사용합니다.

(5) 위치 결정 스테이지에서 마우스 및 준비 이미지 획득을위한

사지에서 랩 테이프를 제거합니다.
현미경 단계에 마취 라인을 열고 수술 플랫폼을 닫습니다.
아래로 복부 측면과 코 콘에서 코와 현미경 단계로 조심스럽게 마우스를 전송합니다. 일부 실험실 테이프로 마취 라인을 고정합니다.
재 위치 커버 미끄러 창 중 하나의 중앙 부위를 위하여 마우스 및 / 또는 슬라이드. 조심스럽게 실험실 테이프로 슬라이드 아래로 테이프.
마우스의 왼쪽 사지에 산소 농도계 프로브를 연결합니다그 마음과 호흡과 산소 포화도 수준을 따릅니다.
저체온증을 피하기 위해 가열 블랭킷와 마우스를 포함한다.
이미징 1.5 %로 2.5 %에서 이소 플루 란 농도를 낮 춥니 다.

μManager 소프트웨어를 사용하여 이미지의 6 취득

구성 설정에 이미지 품질을 개선하기 위해 2500 rpm으로 CSUX 속도를 증가시킨다.
10X 0.5 NA 또는 20X 0.75 NA Fluar 렌즈 목표를 선택하는 목적 드롭 다운 메뉴를 사용합니다.
색상 드롭 다운 메뉴에서 레이저 405 nm의를 선택합니다.
라이브 클릭하고 현미경으로 초점을 조절합니다.
자동 화상 극단적 화소 값에 기초하여 표시 화상의 최대 및 최소 픽셀 강도를 조정하는 자동 클릭. 디스플레이 이미지의 픽셀 세기의 히스토그램은 메인 윈도우의 하단의 그래프로 표시됩니다.
에서 파이퍼 제어판 창에서 카메라 노출을 조정시계의 수를 (하나의 시계가 33.333 밀리 초입니다) 변경.
신호가 낮은 노출 너무 밝은 경우, 현미경 제어부를 이용하여, 레이저 강도를 감소시킨다.
488 nm의, 561 nm에서 640 nm의 레이저 라인에 대한 신호 강도를 확인합니다. 레이저 자체의 제어 유닛 (488 nm 내지 561 nm의) 또는 현미경 제어부와 레이저 강도를 조정한다.
멀티 D 획득 창에서, 시점 박스에 체크 및 시점의 개수 및 원하는 시간 간격을 입력하세요.
, Z-스택 상자를 선택하십시오 "상대 Z"를 선택하고 현재 위치에 Z 스타트 및 Z 엔드 기준을 정의합니다.
참고 : 10 배 또는 20 배 목표를 들어, 떨어져 각각 3 Z 평면, 8 μm의 4 μm의 시작합니다.
여러 위치 이미징의 복수 위치 (XY) 상자에 체크 표시를 한 후, 편집 위치 목록을 클릭 4-6 다른 위치를 표시합니다.
채널 상자를 선택하고 새로운에서 채널을 추가하고 레이저에게 드롭 다운 메뉴와 일반에서 라인을 선택(33.333 밀리의 배수로) 각 채널에 대한 노출에 전자.
"멀티 D 획득"창에서 이미지를 저장을 선택합니다.
폴더를 선택하고 획득 된 모든 이미지는 자동으로 주어진 이름 접두사와이 폴더에 저장됩니다.
참고 : 각 연속 수집은 각 시점에서 각 색상의 각 Z 슬라이스에 대한 개별 TIFF 파일과 같은 별도의 하위 폴더에 저장됩니다.
멀티 D 취득 창에서 설정 저장을 클릭하여 모든 설정을 저장합니다.
획득을 시작하기 위해 다차원 취득 창에 취득 클릭합니다.
산소 농도계 프로브를 사용하지 않는 또는 잘 작동하지 않는 경우 (맥박이 안정 또는 검색 할 하드가 아닌 경우), 발바닥을 곤란하게하고 각막 반사를 확인하여 마취의 효율성에게 이미징 절차를 수행하는 동안 매 15 분을 확인합니다. 마우스가 이러한 자극에 반응하는 경우 마취를 조정합니다.
인수 후, 이소 플루 란 concent를 증가시켜 마우스를 안락사5 % 배급. 더 호흡 운동이 검출 없으면, 무대에서 마우스를 제거하고 자궁 전위를 수행합니다.

Imaris 소프트웨어를 사용하여 이미지의 7 분석

변환 파일 (보충 그림 1A)를 .ims합니다
1. 카메라 소프트웨어를 열고 파일 다음 배치 변환기를 클릭합니다.
2. 클릭 파일을 추가하고 첫 번째 위치의 첫 번째 파일을 선택합니다. 각 위치에 대해 반복합니다.
3. 업로드 된 각 파일에 대해 설정을 클릭하고 Z-스택에 대한 시간 채널에 대해, "C"와 "Z"에 대한 설정 "t"는 그 순서대로 표시되는지 확인합니다.
4. 원하는 폴더에 저장합니다. 검색 및 변환으로 새 파일을 만듭니다.
5. 모든 설정을 클릭하고 시작합니다.
조정 (보충 그림 1B)
1. 특정 변환 된 폴더로 이동하여 첫번째 파일을 엽니 다.
2. 디스플레이 조정 창에서 배경을 조정필요한 경우, 각 채널에 대한 최소 수를 수정하여 신호 차단.
3. 필요한 경우, 최대 개수 (하부 최대 값이 클수록 신호의 강도)을 변경하여 상기 신호 강도를 조절한다.
  참고 : 신호 강도 / 콘트라스트 조정이 더 좋은 시각화를하기 위해 휴대 행동이나 구획의 하이라이트 수 있습니다. 이 결과 자체를 변경하지 않습니다.
4. 편집 및 이미지 속성을 클릭합니다.
5. x, y 및 z의 값을 변경 (10X 대물, X 및 Y = 0.712, Z = 8 μM를 들어, 20X 대물 렌즈의 경우 : X 및 Y = 0.36, Z = 4 μM).
6. 시점을 조정하는 모든 등거리을 클릭합니다. 시작 날짜를 추가하고 인수의 시간을 시작합니다. 종료 날짜를 추가하고 수집 (보충 그림 1C)의 종료 시간.
7. 영화를 감상하려면 재생 버튼을 클릭합니다.
8. 편집을 클릭하고 흐린 이미지를 삭제하는 시점을 삭제합니다.
9. 두 개의 분리 된 인수의 도게에 가입하려면거기는 한 영화로, 첫 번째 영화의 마지막 시점에 가서 편집 클릭> 두번째 파일을 추가하는 데 시간이 포인트를 추가합니다.
동영상으로 저장 (보충 그림 1D)
1. 녹음을 클릭 .MOV 확장과 공의 압축 요소를 선택합니다.
2. 저장을 클릭합니다.

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결과

ACTB-ECFP; APC ^{최소 / +의} 소장에서 회전 디스크 초점 현미경, 비 종양 및 종양 조직을 이용하여 C-FMS-ECFP 마우스는 장막 표면에서 시각화 될 수있다. 촬영 후, 카메라 소프트웨어 분석 및 수집 (보충 그림 1)을 조정하는 데 사용됩니다. 형광 2,000 kDa의 덱스 트란 - 로다의 정맥 주입 및 LY-6G 항체 컨쥬 게이트 647, 후 혈관과 백혈구가 각각 (도 1)을 검출 ...

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토론

본 논문에서는 상세한 프로토콜은 창자의 장막 측에서 몇 군데 살아있는 동물에서 몇 시간 동안 장내 종양에서 골수 세포 역학의 디스크 공 촛점 이미징 회전에 설명되어 있습니다.

염증을 방지하기 위해 최적의 생리 학적 조건을 가지고, 소장의 이미지는 그대로 기관에서 수행해야합니다. 광이 도달하기 전에 상피 평활근 같은 상이한 조직 층을 통과해야하기 때문에, 소장?...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

우리는 APC ^{최소 / +} 마우스의 유전자형에 대한 잉 유에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 INSERM에서 자금과 국립 보건원에서 보조금 (CA057621 및 AI053194)에 의해 지원되었다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apc^Min/+ mice	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP mice	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP mice	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
Nitrogen	UCSF
Oxygen	UCSF
1x PBS	UCSF cell culture facility
Saline Buffer	UCSF cell culture facility
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse
Atropine	LARC UCSF		Use at 1 mg/kg mouse
Alcohol wipes	Becton Dickinson	326895
28 G x 1/2 in. insulin syringe	Becton Dickinson	329465
Remium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5M	24x50-1
Betadine	LARC UCSF
Heat blanket	Gaymar Industries
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30 min before use
Cotton tipped apllicators 6-inch	Electron Microscopy Sciences	72310-10
Anesthesia system	Summit Anesthesia Support
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
Stage insert	Applied Sientific Instrumentation
Mouse Ox oximeter, software and sensors	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit Anesthesia Support
Imaris	Bitplane
μManager	Vale lab, UCSF		Open-source software
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b

참고문헌

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