רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

Summary

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Abstract

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population^1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide³. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA^4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells^5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks^5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the “pilus”⁵. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface^9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

Introduction

H. pylori infection is a significant risk factor for gastric cancer¹. However, disease outcomes vary and depend on numerous factors such as host genetics, genetic diversity of H. pylori strains, and environmental elements such as host diet¹¹. Previous reports have established that a correlation exists between H. pylori infection, iron deficiency (as measured by decreased blood ferritin and hemoglobin concentrations), and increased proinflammatory cytokine production, including IL-8 secretion, which ultimately leads to increased gastric disease progression¹². Acute H. pylori infection is also associated with hypochlorhydria which impairs the host’s ability to absorb nutrient iron, and ultimately leads to changes in iron homeostasis¹³. These clinical findings suggest that iron availability within the gastic niche could be an important factor in disease outcome. In fact, animal models of H. pylori infection have demonstrated that low dietary iron consumption exacerbates gastric disease¹⁴. The reduced iron levels in these animals necessitate that H. pylori induce an iron-acquisition response in order to obtain the iron needed for bacterial replication. H. pylori has the capacity to perturb iron trafficking within host cells to facilitate bacterial replication in a CagA-dependent fashion¹⁵. Interestingly, the cag-pathogenicity island has been shown to be regulated by the iron-responsive transcription factor Fur^16,17. Furthermore, Cag+ strains are associated with increased inflammation and gastric diseases such as cancer¹. These findings support a model whereby H. pylori alters Cag-T4SS expression in an effort to obtain iron from host cells that reside in an iron deplete environment resulting in exacerbated disease outcomes.

Two factors that increase inflammation and morbidity are Cag expression and low dietary iron intake. These facts support the hypothesis that reduced iron availability increases the production of Cag-T4SS pili at the host pathogen interface resulting in worse gastric disease^11-14. The goal of the method provided in this manuscript is to establish the role of the micronutrient iron in the regulation of the Cag-T4SS pilus biogenesis. In previous work, we utilized two approaches to observe an iron-dependent increase in Cag-T4SS expression. First, output strains from animals maintained on high and low iron diets were analyzed and revealed that low-iron diet output strains produced more Cag-T4SS pili than high-iron diet strains¹⁴. Second, growing the H. pylori 7.13 strain in vitro in iron replete conditions resulted in reduced pili formation while cells grown in the presence of an iron chelator produced significantly more pili.

We have continued to investigate the iron-dependent regulation of Cag-T4SS pili phenotype and offer the following optimized protocol and representative results performed with an additional Helicobacter pylori strain, PMSS1. The rationale behind the development of this technique was to correlate increased Cag-T4SS activity in conditions of iron-limitation with increased Cag-T4SS pilus formation. The broader implication and use of this technique will provide optimized culture conditions that result in elevated production of the Cag-T4SS pili. This assay will be useful to researchers seeking to determine the composition and architecture of the Cag-T4SS by enriching for this important bacterial surface feature. The sample preparation and visualization by field-emission gun electron microscopy has numerous advantages over alternative techniques such as light-microscopy methods to visualize the Cag-T4SS and will be appropriate to investigators interested in studying the regulation of this organelle¹⁰.

Protocol

1. ח פילורי צמיחה בתנאים שונים של זמינות ברזל ושיתוף תרבות עם תאים אנושי הקיבה אפיתל

1. בחר ה ' PMSS1 פילורי מתח למחקרים אלה כי יש לו אי פתוגניות CAG שלם ומבטא את מערכת הפרשה מסוג IV תפקוד. גם לנצל מוטציה כלוב isogenic (PMSSI Δ קייג ') כביקורת שלילית. לגדול חיידקים על צלחות TSA בתוספת 5% דם כבשים (צלחות אגר דם) למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO _2.
   הערה: הכן חומרים כימיים ולהרכיב חומרים כפי שמתואר בטבלת חומרים וציוד. ריכוזים סופיים לכל מגיב רשום בסוגריים.
2. לגרד חיידקים מהצלחת באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי ולחסן לתוך מרק ברוצלה שונה שהוכן ממרכיבים (ראה חומרים וציוד בלוח) והשלים עם כולסטרול. דגירה תרבויות הלילה בשעה 37° C באוויר חדר בתוספת 5% CO ₂ עם רועד ב200 סיבובים לדקה (סל"ד).
   הערה: כולסטרול משמש במקום של סרום שור עוברי בשל העובדה שהסרום הוא מורכב; המכיל מספר רב של מקורות ברזל תזונתי כגון heme הגורם לשונות בתוצאות.
3. ביום culturing חיידקים, זרע תאי האפיתל של הקיבה אנושי AGS (ATCC CRL-1739) על coverslips טופל poly-D- ליזין ב12 גם צלחות (כ 1 x 10 ⁵ תאים לכל טוב).
4. למחרת, לדלל תרבויות חיידקים לOD600 של 0.3 במרק ברוצלה שונה לבד או בתוספת 100 מיקרומטר FeCl _3, dipyridyl 200 מיקרומטר (chelator ברזל סינטטי), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl _3. דגירה תרבויות אלה במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס באוויר חדר בתוספת 5% CO ₂ עם הרועד בסל"ד 200.
5. חיידקי צנטריפוגה XG ב 1000 לאיסוף תאים ולהסיר supernatants לפני resuspending אניn נפח שווה של מרק ברוצלה שונה טרי בתוספת כולסטרול. מדד OD600 של התרבות (OD600 = 1.0 = 5.5 x 10 ⁸ תאים / מיליליטר) ולהוסיף חיידקים לתאי האפיתל בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 20: 1. לבצע דילולים סידוריים ותאי חיידקיים צלחת על גבי צלחות אגר דם כדי להעריך את כדאיות תא חיידק.
6. דגירה H. שיתוף תרבויות תאי האפיתל של הקיבה אנושי פילורי וAGS במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO ₂ בתנאים סטטיים לפני הביצוע במיקרוסקופ אלקטרונים סורק הכנת מדגם (SEM).

2. SEM לדוגמא הכנה לדמיין H. פילורי CAG-T4SS פילי

1. הסר H. פילורי ושיתוף תרבויות AGS מsupernatant תרבות חממה ולמזוג (למעט IL-8 ELISA). לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם 0.05 חיץ M נתרן cacodylate (pH 7.4). תקן את הדגימות ל2-4 שעות בטמפרטורת חדר בתמיסה של paraformaldehyde 2.0%, 2.5gluteraldehyde%, וחיץ cacodylate 0.05 M נתרן. לאחר קיבוע ראשוני, לשטוף דגימות שלוש פעמים עם חיץ cacodylate 0.05 M נתרן.
2. בצע קיבעון המשני באמצעות 0.1% tetroxide אוסמיום ב0.05 חיץ cacodylate M נתרן בשני 10 ברצף צעדי קיבעון דקות. לאחר קיבוע המשני, לשטוף דגימות שלוש פעמים עם חיץ cacodylate 0.05 M נתרן.
3. לאחר קיבוע ראשוני והמשני, ליבש דגימות על ידי שטיפה רציפה עם ריכוזים גוברים של אתנול לפי טבלת 1.
4. לאחר התייבשות אתנול, לבצע שלושה שוטף רציף של נוזל פחמן דו חמצני. דגימות ואז יבשות בנקודה קריטית באמצעות מכונה מייבש נקודה קריטית בטמפרטורה של 31.1 ºC ולחץ של 1073 PSI.
5. הר coverslips על ספחי מדגם האלומיניום SEM ולצייר עם קו דק של מי כסף בקצה המדגם כדי להשיג הארקה מתאימה ולהימנע מלחייב במהלך ההדמיה SEM.
6. דגימות מעיל עם 5 ננומטר שלזהב-פלדיום באמצעות מכונה מעיל גמגום להגדיל מדגם אותות משני אלקטרונים ואפקט קצה.

3. פרמטרי הדמיה לניתוחים ברזולוציה הגבוה SEM

1. צפה בדוגמאות עם אקדח מיקרוסקופ סורק אלקטרוני פליטת שדה (FEG-SEM).
2. תמונה במצב ואקום גבוה במרחק עבודה של 5-10 מ"מ.
3. הגדר את המתח המאיץ עד 5 קילו וולט.
4. הגדר את גודל מקום ל2-2.5.
5. הטה את המדגם בין 15-25 מעלות כדי להשיג ראייה טובה יותר של ממשק המאכסן לפתוגן.
6. לתעדף הדמיה חיידקים חסיד לקצוות של תאי האפיתל לצפייה הגדלה גבוהה, כתחומים של אינטראקציה המאכסן לפתוגן אלה מועשרים לחיידקים יוצרי פילים.

4. ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את הפילים Quantifications

1. לנתח H. פילי CAG-T4SS פילורי באמצעות תוכנת ImageJ לכמת מספר פילים / תא, כמו גם אחוז של תאים המציגים piliated Phenotype בהתאם להנחיות למטה.
2. קבצי מיקרוסקופ פתוחים בתוכנת ImageJ. לזהות פילים כמבנים שנוצרו בין תא החיידק והתא מארח, עם רוחב אחיד (10-13 ננומטר) ואורך (60-150 ננומטר).
   הערה: מבנה pilus קיים בזני חיידקי WT, אבל נעדרו בזני isogenic כגון זנים מוטנטים כלוב Δ, שנמל איון בגן המקודד את ATPase המרכזי שהרכבת pilus הפרשת IV סוג סמכויות.
3. כייל את כלי המדידה על ידי ציור קו עם כלי הקו הישר ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסייה "נתח". בחר "סולם הגדר" מהתפריט הנפתח והזן את הערך בר הגדלה לתוך התיבה "מרחק ידוע" שכותרתו ולהגדיר את יחידת האורך להגדרה המתאימה (ננומטר). לחץ על "אישור".
4. למדוד פילי CAG-T4SS שימוש באפשרות הקו הישר לצייר על האורך או הרוחב של pilus ולאחר מכן לחץ על "Ctrl-M" למדוד כל pilus. שים לב תיבה דו-שיח עם הערכים שנמדדו. רשום את הערכים הללו או להעתיק ולהדביק לתוך תכנית גיליון אלקטרוני.
5. השתמש באורך ורוחב פרמטרים שנקבעו בעבר ²⁴ תכונות התעלמות, שאינו מתאימות לפרופיל של CAG-T4SS. ואז לכמת את מספר הפילים המבוססים על ערכים הנמצאים בהפסקות 10-13 ננומטר רוחב ו60-150 ננומטר אורך.
6. נתח את הכימות של פילים סטטיסטיים על ידי מבחן t של סטודנט שני זנב באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה.

5. אופציונלית: הערכה של IL-8 ההפרשה במיתאם עם Pilus הפקה

1. באמצעות supernatants משלב 2.1, לבצע ELISA IL-8 לפי הוראות יצרן עם הערכה (ראה חומרים וציוד בלוח).
2. נתח את IL-8 מופרש על ידי תאי מארח ולחשב את האינדוקציה IL-8 אחוזים ביחס לWT PMSS1 גדלו במדיום לבד. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t של סטודנט שני זנב באמצעות GraphPad פריזמה כךftware.

תוצאות

בדוח זה, אנחנו הוכחנו כי יש להם תנאים משתנים זמינות ברזל היכולת לווסת את ה biogenesis pilus פילורי CAG-T4SS בממשק שהפתוגן המארח. כאשר בתרבית בינונית בלבד, ח ' פילורי מהווה ממוצע של 3 פילים / תא. כאשר ה ' פילורי הוא גדל בברזל לרוקן את תנאים (באמצעות dipyridyl chelator ה?...

Discussion

ברזל הוא יסודות קורט חיוני עבור רוב צורות חיים, כוללים חיידקים פתוגנים. במאמץ להגביל את יכולת הקיום של פלישת מיקרואורגניזמים, מארחי חוליות לעקל ברזל מזין בתהליך המכונה "חסינות תזונתית" ^18. בתגובה לכך, חיידקים פתוגנים התפתחו להשתמש בברזל כמולקולת איתות גלוב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L)	Sigma	70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L)	Sigma	70174
Yeast extract (2 g/L)	Sigma	92144
Dextrose (1 g/L)	Sigma	D9434
Sodium chloride (5 g/L)	Thermo Fisher	S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L)	Life Technologies	12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM)	Sigma	157740-100G
Dipyridyl (200 uM)	Sigma	D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X)	Life Technologies	22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L)	Life Technologies	10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	16220
Sodium cacodylate (0.05 M)	Electron Microscopy Sciences	12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	19150
Ethanol (absolute)	Sigma	E7023
Colloidal silver paint	Electron Microscopy Sciences	12630
SEM sample stubs	Electron Microscopy Sciences	75220
Coverslips	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit	R&D Systems	D8000C