Haute résolution microscopie électronique de la<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Cag sécrétion de type IV Système Pili Produit dans différentes conditions de Fer Disponibilité

Résumé

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Résumé

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population^1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide³. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA^4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells^5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks^5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the “pilus”⁵. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface^9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

Introduction

H. pylori infection is a significant risk factor for gastric cancer¹. However, disease outcomes vary and depend on numerous factors such as host genetics, genetic diversity of H. pylori strains, and environmental elements such as host diet¹¹. Previous reports have established that a correlation exists between H. pylori infection, iron deficiency (as measured by decreased blood ferritin and hemoglobin concentrations), and increased proinflammatory cytokine production, including IL-8 secretion, which ultimately leads to increased gastric disease progression¹². Acute H. pylori infection is also associated with hypochlorhydria which impairs the host’s ability to absorb nutrient iron, and ultimately leads to changes in iron homeostasis¹³. These clinical findings suggest that iron availability within the gastic niche could be an important factor in disease outcome. In fact, animal models of H. pylori infection have demonstrated that low dietary iron consumption exacerbates gastric disease¹⁴. The reduced iron levels in these animals necessitate that H. pylori induce an iron-acquisition response in order to obtain the iron needed for bacterial replication. H. pylori has the capacity to perturb iron trafficking within host cells to facilitate bacterial replication in a CagA-dependent fashion¹⁵. Interestingly, the cag-pathogenicity island has been shown to be regulated by the iron-responsive transcription factor Fur^16,17. Furthermore, Cag+ strains are associated with increased inflammation and gastric diseases such as cancer¹. These findings support a model whereby H. pylori alters Cag-T4SS expression in an effort to obtain iron from host cells that reside in an iron deplete environment resulting in exacerbated disease outcomes.

Two factors that increase inflammation and morbidity are Cag expression and low dietary iron intake. These facts support the hypothesis that reduced iron availability increases the production of Cag-T4SS pili at the host pathogen interface resulting in worse gastric disease^11-14. The goal of the method provided in this manuscript is to establish the role of the micronutrient iron in the regulation of the Cag-T4SS pilus biogenesis. In previous work, we utilized two approaches to observe an iron-dependent increase in Cag-T4SS expression. First, output strains from animals maintained on high and low iron diets were analyzed and revealed that low-iron diet output strains produced more Cag-T4SS pili than high-iron diet strains¹⁴. Second, growing the H. pylori 7.13 strain in vitro in iron replete conditions resulted in reduced pili formation while cells grown in the presence of an iron chelator produced significantly more pili.

We have continued to investigate the iron-dependent regulation of Cag-T4SS pili phenotype and offer the following optimized protocol and representative results performed with an additional Helicobacter pylori strain, PMSS1. The rationale behind the development of this technique was to correlate increased Cag-T4SS activity in conditions of iron-limitation with increased Cag-T4SS pilus formation. The broader implication and use of this technique will provide optimized culture conditions that result in elevated production of the Cag-T4SS pili. This assay will be useful to researchers seeking to determine the composition and architecture of the Cag-T4SS by enriching for this important bacterial surface feature. The sample preparation and visualization by field-emission gun electron microscopy has numerous advantages over alternative techniques such as light-microscopy methods to visualize the Cag-T4SS and will be appropriate to investigators interested in studying the regulation of this organelle¹⁰.

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Protocole

1. H. pylori croissance dans différentes conditions de Fer Disponibilité et co-culture avec des cellules humaines épithéliales gastriques

1. Sélectionnez H. pylori souche PMSS1 pour ces études car il a une île de pathogénicité cag intact et exprime un système IV de sécrétion de type fonctionnement. Utiliser également un mutant de la cage isogéniques (PMSSI Δ cage) comme contrôle négatif. Cultiver les bactéries sur des plaques de TSA complétées avec du sang de mouton à 5% (plaques de gélose au sang) pendant 24 heures à 37 ° C en présence de 5% de CO _2.
   NOTE: Préparer les réactifs et assembler des matériaux comme indiqué dans le matériel et équipement tableau. Les concentrations finales pour chaque réactif est indiquée entre parenthèses.
2. Grattez les bactéries de la plaque à l'aide d'un coton-tige stérile et inoculer dans un bouillon Brucella modifié préparé à partir de composants (voir Matériels et ustensiles de table) et complété avec le cholestérol. Incuber les cultures pendant la nuit à 37° C dans l'air ambiant supplémenté avec 5% _de CO2 avec agitation à 200 tours par minute (rpm).
   NOTE: Le cholestérol est utilisé à la place de sérum de veau fœtal en raison du fait que le sérum est complexe; contenant de nombreuses sources de nutriments tels que le fer hémique qui provoque la variabilité des résultats.
3. Le jour de la culture bactérienne, ensemencer les cellules épithéliales gastriques AGS humaines (ATCC CRL-1739) sur le poly-D-lysine lamelles traitées dans des plaques de 12 puits (environ 1 x 10 ⁵ cellules par puits).
4. Le jour suivant, les cultures bactériennes diluées à une DO600 de 0,3 dans un bouillon Brucella modifié, seul ou additionné de 100 uM de _FeCl3, 200 uM de dipyridyle (un chélateur de fer synthétique) ou 200 pM de dipyridyle plus 250 uM de _FeCl3. Incuber les cultures pendant 4 heures à 37 ° C dans l'air ambiant supplémenté avec 5% _de CO2 avec agitation à 200 tours par minute.
5. Bactéries centrifuger à 1000 xg pour recueillir des cellules et supprimer surnageants avant la remise en suspension in un volume égal de bouillon Brucella modifié frais supplémenté avec du cholestérol. La mesure de la DO600 de la culture (DO 600 = 1,0 = 5,5 x 10 ⁸ cellules / ml) et ajouter des bactéries aux cellules epitheliales en une multiplicité d'infection (MOI) de 20: 1. Réaliser des dilutions en série et des cellules bactériennes en plaque sur des plaques de gélose au sang pour évaluer la viabilité de la cellule bactérienne.
6. Incuber H. cellules épithéliales gastriques humaines pylori et AGS co-cultures de 4 heures à 37 ° C en présence de 5% CO ₂ dans des conditions statiques avant de procéder à la microscopie électronique à balayage (MEB) la préparation d'échantillons.

2. SEM de la préparation d'échantillons pour visualiser les H. pylori Cag-T4SS Pili

1. Retirer H. pylori et les co-cultures AGS à partir du surnageant incubateur et décanter la culture (sauf pour l'IL-8 ELISA). Laver doucement trois fois avec 0,05 M de tampon cacodylate de sodium (pH 7,4). Fixer les échantillons pendant 2-4 heures à la température ambiante dans une solution de 2,0% de paraformaldéhyde, 2,5% De glutaraldéhyde, et un tampon de cacodylate de sodium 0,05 M. Après fixation primaire, laver échantillons trois fois avec le tampon de cacodylate de sodium 0,05 M.
2. Effectuer fixation secondaire en utilisant du tétroxyde d'osmium à 0,1% dans du tampon cacodylate de sodium 0,05 M en deux étapes séquentielles 10 min de fixation. Après fixation secondaire, laver échantillons trois fois avec le tampon de cacodylate de sodium 0,05 M.
3. Après la fixation primaire et secondaire, déshydrater échantillons par lavage séquentiel avec des concentrations croissantes d'éthanol, selon le tableau 1.
4. Après déshydratation de l'éthanol, effectuer trois lavages successifs de dioxyde de carbone liquide. Puis échantillons secs à un point critique en utilisant un sèche-linge de point critique à une température de 31,1 ° C et une pression de 1073 psi.
5. Mont lamelles de talons sur des échantillons d'aluminium SEM et de la peinture avec une fine ligne de l'argent colloïdal au bord de l'échantillon pour atteindre la terre appropriée et éviter de charger lors de l'imagerie SEM.
6. échantillons de manteau avec 5 nm deor-palladium en utilisant une machine de revêtement par pulvérisation pour augmenter le signal d'électrons secondaires échantillon et l'effet de bord.

3. Paramètres d'imagerie pour analyses résolution SEM haut

1. Voir les échantillons avec un microscope électronique à balayage Gun à émission de champ (FEG-SEM).
2. L'image dans un mode à vide élevé à une distance de travail de 5 à 10 mm.
3. Réglez la tension d'accélération de 5 kV.
4. Régler la taille de place à 2-2,5.
5. Inclinez l'échantillon entre 15-25 degrés pour obtenir une meilleure vue de l'interface hôte-pathogène.
6. Donner la priorité à l'imagerie de bactéries adhérentes aux bords des cellules épithéliales à fort grossissement pour la visualisation, en tant que ces zones d'interaction hôte-pathogène sont enrichies en bactéries formant des pili.

4. Analyses statistiques pour évaluer Pili Quantifications

1. Analyser H. pylori pili Cag-T4SS utilisant le logiciel ImageJ pour quantifier le nombre de pili / cellule ainsi que pour cent des cellules présentant l'pili phephénotype selon les instructions ci-dessous.
2. Fichiers micrographiques ouvrir dans le logiciel ImageJ. Identifier en tant que pili de structures formées entre la cellule bactérienne et une cellule hôte, avec une largeur uniforme (10-13 nm) et la longueur (60-150 nm).
   REMARQUE: La structure de pilus est présent sur ​​les souches bactériennes WT, mais absent sur ​​des souches isogéniques tels que Δ cage souches mutantes, qui abritent une inactivation dans le gène codant pour la majeure ATPase que l'assemblage de type IV pouvoirs sécrétion de pilus.
3. Calibrer l'outil de mesure en traçant une ligne avec l'outil de ligne droite, puis en cliquant sur l'onglet "Analyser". Sélectionnez "Scale Set" dans le menu déroulant et entrez la valeur de la barre de grossissement dans la case "Distance connu" et régler l'unité de longueur sur le paramètre approprié (nm). Cliquez sur "OK".
4. Mesurer Cag-T4SS pili en utilisant l'outil de ligne droite à tirer sur la longueur ou la largeur du pili, puis appuyez sur "Ctrl-M" pour mesurer chaque pili. Observez une boîte de dialogue avec les valeurs mesurées. Notez ces valeurs ou copier et coller dans un tableur.
5. Utilisez la longueur et la largeur des paramètres précédemment établis ^24, caractéristiques de ne pas tenir compte qui ne correspondent pas au profil de Cag-T4SS. Puis quantifier le nombre de pili fondée sur des valeurs qui sont à l'intérieur des seuils 10-13 nm de largeur et 60-150 nm de longueur.
6. Analyser la quantification de pili statistiquement par le test t de Student bilatéral utilisant le logiciel GraphPad Prism.

5. Facultatif: évaluation de la sécrétion d'IL-8 en corrélation avec Pilus production

1. Utilisation de surnageants de l'étape 2.1, effectuer un IL-8 ELISA selon les instructions du fabricant avec le kit (voir Matériels et ustensiles de table).
2. Analyse de l'IL-8 sécrétée par les cellules hôtes et le calcul de la IL-8 pour cent par rapport à induction WT PMSS1 cultivées dans du milieu seul. Effectuer une analyse statistique utilisant bilatéral test t de Student en utilisant GraphPad Prism siftware.

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Résultats

Dans ce rapport, nous avons démontré que les conditions de disponibilité est variable de fer ont la capacité de moduler H. pylori Cag-T4SS pili biogenèse à l'interface hôte-pathogène. Lorsqu'elle est cultivée dans le milieu seul, H. pylori constitue un moyen de pili 3 / cellule. Lorsque H. pylori est cultivé en fer épuiser conditions (à l'aide du chélateur dipyridyle synthétique) qui sont sous-inhibitrice pour la croissance des bactéries (Figure 1), ...

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Discussion

Le fer est un oligo-élément essentiel pour la plupart des formes de vie, y compris les bactéries pathogènes. Dans un effort pour limiter la viabilité des micro-organismes envahisseurs, les hôtes vertébrés séquestrent fer éléments nutritifs dans un processus connu sous le nom "immunité nutritionnelle» ^18. En réponse à cela, les bactéries pathogènes ont évolué à utiliser le fer comme une molécule de signalisation mondiale de sentir leur environnement et de réglementer l'élaborati...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L)	Sigma	70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L)	Sigma	70174
Yeast extract (2 g/L)	Sigma	92144
Dextrose (1 g/L)	Sigma	D9434
Sodium chloride (5 g/L)	Thermo Fisher	S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L)	Life Technologies	12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM)	Sigma	157740-100G
Dipyridyl (200 uM)	Sigma	D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X)	Life Technologies	22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L)	Life Technologies	10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	16220
Sodium cacodylate (0.05 M)	Electron Microscopy Sciences	12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	19150
Ethanol (absolute)	Sigma	E7023
Colloidal silver paint	Electron Microscopy Sciences	12630
SEM sample stubs	Electron Microscopy Sciences	75220
Coverslips	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit	R&D Systems	D8000C