고해상도 전자 현미경<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em철 가용성의 다양한 조건에서 생산&gt; CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

요약

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

초록

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population^1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide³. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA^4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells^5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks^5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the “pilus”⁵. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface^9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

서문

H. pylori infection is a significant risk factor for gastric cancer¹. However, disease outcomes vary and depend on numerous factors such as host genetics, genetic diversity of H. pylori strains, and environmental elements such as host diet¹¹. Previous reports have established that a correlation exists between H. pylori infection, iron deficiency (as measured by decreased blood ferritin and hemoglobin concentrations), and increased proinflammatory cytokine production, including IL-8 secretion, which ultimately leads to increased gastric disease progression¹². Acute H. pylori infection is also associated with hypochlorhydria which impairs the host’s ability to absorb nutrient iron, and ultimately leads to changes in iron homeostasis¹³. These clinical findings suggest that iron availability within the gastic niche could be an important factor in disease outcome. In fact, animal models of H. pylori infection have demonstrated that low dietary iron consumption exacerbates gastric disease¹⁴. The reduced iron levels in these animals necessitate that H. pylori induce an iron-acquisition response in order to obtain the iron needed for bacterial replication. H. pylori has the capacity to perturb iron trafficking within host cells to facilitate bacterial replication in a CagA-dependent fashion¹⁵. Interestingly, the cag-pathogenicity island has been shown to be regulated by the iron-responsive transcription factor Fur^16,17. Furthermore, Cag+ strains are associated with increased inflammation and gastric diseases such as cancer¹. These findings support a model whereby H. pylori alters Cag-T4SS expression in an effort to obtain iron from host cells that reside in an iron deplete environment resulting in exacerbated disease outcomes.

Two factors that increase inflammation and morbidity are Cag expression and low dietary iron intake. These facts support the hypothesis that reduced iron availability increases the production of Cag-T4SS pili at the host pathogen interface resulting in worse gastric disease^11-14. The goal of the method provided in this manuscript is to establish the role of the micronutrient iron in the regulation of the Cag-T4SS pilus biogenesis. In previous work, we utilized two approaches to observe an iron-dependent increase in Cag-T4SS expression. First, output strains from animals maintained on high and low iron diets were analyzed and revealed that low-iron diet output strains produced more Cag-T4SS pili than high-iron diet strains¹⁴. Second, growing the H. pylori 7.13 strain in vitro in iron replete conditions resulted in reduced pili formation while cells grown in the presence of an iron chelator produced significantly more pili.

We have continued to investigate the iron-dependent regulation of Cag-T4SS pili phenotype and offer the following optimized protocol and representative results performed with an additional Helicobacter pylori strain, PMSS1. The rationale behind the development of this technique was to correlate increased Cag-T4SS activity in conditions of iron-limitation with increased Cag-T4SS pilus formation. The broader implication and use of this technique will provide optimized culture conditions that result in elevated production of the Cag-T4SS pili. This assay will be useful to researchers seeking to determine the composition and architecture of the Cag-T4SS by enriching for this important bacterial surface feature. The sample preparation and visualization by field-emission gun electron microscopy has numerous advantages over alternative techniques such as light-microscopy methods to visualize the Cag-T4SS and will be appropriate to investigators interested in studying the regulation of this organelle¹⁰.

프로토콜

1. H. 인간의 위 상피 세포와 철 가용성 및 공동 문화의 다양한 조건에서 균 성장

1. H.를 선택 이러한 연구에 대한 파이로리 스트레인 PMSS1 그것이 그대로 CAG 병원성 아일랜드를 가지며 작동 타입 IV 분비 시스템을 표현하기 때문이다. 또한 음성 대조군으로 동질 케이지 돌연변이 (PMSSI Δ 케이지)를 사용합니다. 5 % CO ₂ 존재하에 37 ° C에서 24 시간 동안 5 % 양 혈액 (아가 플레이트)로 보충 TSA 플레이트상에서 세균 성장.
   참고 : 시약을 준비하고 재료 및 장비 표에 요약 된 자료를 조립한다. 각 시약에 대한 최종 농도는 괄호 안에 표시됩니다.
2. 멸균 면봉을 사용하여 판에서 박테리아를 긁고 구성 요소에서 준비 수정 브루셀라 배지에 접종 (재료 및 장비 표 참조) 콜레스테롤 보충. 37에서 하룻밤 문화를 품다분 수 (rpm)에 200 회전에서 진탕 5 % CO _2로 보충 된 실내 공기를 ° C.
   NOTE : 콜레스테롤 인해 혈청이 복잡하다는 사실에 소 태아 혈청 대신에 사용된다; 이러한 결과에 변화가 발생 헴 (heme) 등의 영양소 철의 다양한 소스를 포함.
3. 세균 배양의 날, AGS 인간 위 상피 세포를 시드 (ATCC CRL-1739) 12 웰 플레이트 (웰 당 약 1 × ¹⁰⁵ 세포)의 폴리 D 라이신 처리 된 커버 슬립 상.
4. 다음 날, 수정 브루셀라 국물 혼자 또는 100 μM _50ml을, 200 μM의 피리 딜 (합성 철 킬레이트), 또는 200 μM의 피리 딜 플러스 250 μM _50ml을 보충 0.3의 OD600에 박테리아 문화를 희석. 200 rpm으로 진탕하면서 5 % CO _2로 보충 된 실내 공기에서 37 ° C에서 4 시간 동안 배양이 부화.
5. 1,000 XG에 원심 분리기 박테리아는 세포를 수집하고 난을 재 부유하기 전에 상층 액을 제거n은 신선한 수정 된 브루셀라 브로스 동량 콜레스테롤 보충. 문화 (OD600 = 1.0 = 5.5 × 10 ⁸ 세포 / ml)의 측정 OD600 감염 20 (MOI)의 다수의 상피 세포에 박테리아를 추가 : 1. 박테리아 세포 생존력을 평가하기 위해 혈액 아가 플레이트 상에 연속 희석 접시 균체를 수행한다.
6. H.을 품어 주사 전자 현미경 (SEM) 시료 전처리를 수행하기 전에 정적 인 상태에서 5 % CO ₂ 존재 하 37 ° C에서 4 시간 동안 파이로리 AGS 인간 위 상피 세포 공동 배양.

2. SEM H.을 시각화하는 샘플 준비 pylori의 CAG-T4SS 필리

1. H. 제거 균 및 인큐베이터와 캔트 배양 상층 액에서 AGS 공동 문화 (IL-8 ELISA에 대한 저장). 0.05 M 나트륨 cacodylate 완충액 (pH 7.4)으로 가볍게 세 번 씻으십시오. , 2.0 % 파라 포름 알데히드 용액에 2.5을 실온에서 2~4시간에 대한 샘플을 수정% 글루 테르 알데히드, 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼입니다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다.
2. 두 연속 10 분 정착 단계에서 0.05 M 소듐 cacodylate 버퍼에 0.1 % 사 산화 오스뮴을 이용하여 차 고정을 수행한다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다.
3. 기본 및 보조 고정 후, 표 1에 따라 에탄올의 농도가 증가함에 따라 순차적으로 세척하여 샘플을 탈수.
4. 에탄올 탈수 후 액체 이산화탄소 세 순차 세척을​​ 수행한다. 1073 PSI의 31.1 ºC의 온도 및 압력에서 임계점 건조 기계를 사용 임계점이어서 건조한 샘플.
5. 마운트는 알루미늄 SEM 샘플 스텁에 된 커버하고 적절한 접지를 달성하고 SEM 이미징 동안 충전을 방지하기 위해 샘플 가장자리에 콜로이드 실버의 얇은 선으로 페인트.
6. 코트 샘플과는 5nm샘플 2 차 전자 신호 및 에지 효과를 증가시키기 위해 스퍼터 코팅 기계를 사용하여 금 - 팔라듐.

고해상도 현미경 분석 3. 이미징 매개 변수

1. 이 필드 방출 총 스캐닝 전자 현미경 (FEG-SEM)으로보기 샘플.
2. 5~10mm의 작동 거리에서 고진공 모드에서 이미지.
3. 5 kV의에 가속 전압을 설정합니다.
4. 2-2.5에 자리 크기를 설정합니다.
5. 호스트 인터페이스 병원체의 더 나은 관점을 달성하기 위해 15 내지 25도 사이의 샘플을 기울인다.
6. 호스트 병원체 상호 작용의 이들 영역은 필리 - 형성 박테리아 농후 한, 고배율 관찰 용 상피 세포의 가장자리에 부착 된 세균을 이미징 우선 순위.

4. 통계 분석은 필리 정량화를 평가하기

1. H. 분석 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 파이로리 CAG-T4SS의 필리는 piliated 프 전시 세포의 필리 / 세포의 수뿐만 아니라 퍼센트를 정량화하기아래의 지침에 따라 표현형.
2. ImageJ에 소프트웨어의 열기 현미경 사진 파일. 균일 한 폭 (10 ~ 13 ㎚)과 길이 (60-150 나노 미터)와 박테리아 세포와 숙주 세포 사이에 형성되는 구조로 필리을 확인합니다.
   NOTE : pilus 구조 주요 ATP 아제 힘 타입 IV 분비 pilus 조립체를 코딩하는 유전자에 불활 항구 이러한 Δ 케이지 변이주로서 동질 균주에 WT 균주에 존재하지만, 존재하지 않는다.
3. "분석"탭을 클릭 한 다음 직선 도구를 사용하여 선 그리기에 의해 측정 도구를 보정합니다. 드롭 다운 메뉴에서 "설정 규모"를 선택하고 상자 표시 "알려진 거리"로 확대 바 값을 입력하고 적절한 설정 (㎚)로 길이의 단위를 설정합니다. "확인"을 클릭합니다.
4. pilus의 길이나 폭에 걸쳐 그려 직선 도구를 사용하여 CAG-T4SS의 필리를​​ 측정하고 각 pilus를 측정하기 위해 "Ctrl 키를-M"을 눌러. 측정 값과의 대화 상자를 관찰합니다. 이 값을 기록하거나 복사하여 스프레드 시트 프로그램에 붙여 넣습니다.
5. 길이를 사용하여 폭 매개 변수는 이전에 CAG-T4SS의 프로필에 맞지 않는 ²⁴ 무시 기능을 설립했다. 그런 다음 10 ~ 13 nm의 폭 및 60-150 nm의 길이 컷오프 내에있는 값에 기초 필리의 수를 정량화.
6. 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 두 개의 꼬리 학생의 T 시험에 의해 통계적으로 필리의 정량을 분석 할 수 있습니다.

5. 선택 사항 : IL-8 분비의 평가 Pilus 생산과의 상관 관계를 분석하기

1. 2.1 단계에서 상층 액을 사용하여, 키트 제조 업체의 지침 (재료 및 장비 표 참조) 당 IL-8 ELISA를 수행합니다.
2. IL-8 숙주 세포에 의해 분비를 분석 단독 배지에서 성장 WT PMSS1에 대해 퍼센트 IL-8 유도를 계산한다. 그래서 그래프 패드 프리즘을 사용하여 두 꼬리 학생의 T 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행ftware.

결과

이 보고서에서 우리는 철의 가용성을 변화의 조건이 H.을 조절하는 능력을 가지고 있음을 증명하고있다 호스트 병원체 인터페이스에서 파이로리 CAG-T4SS의 pilus의 생합성. , H. 단독 배지에서 배양하면 파일로리 3 필리 / 셀의 평균을 형성한다. 때 H. 파일로리 철에서 성장 고갈 세균 성장 (도 1)은 하위 억제이다 (합성 킬레이트 피리 딜 사용) 조건, 박테?...

토론

철 박테리아 병원균을 포함한 삶의 대부분의 형태에 필수적인 미량 영양소이다. 미생물 침입의 가능성을 제한하기위한 노력으로, 척추 호스트는 "영양 ^{면역"(18)로} 알려진 과정에서 영양소 철을 격리시키는. 이에 응답하여, 박테리아 병원균은 주변 환경을 감지하고 철 수집 시스템, 독소 및 독소 분비 기계 ^{(19, 20)으로} 병원성 기능 정교화 조절하는 전역 신호 분자로서 철을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L)	Sigma	70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L)	Sigma	70174
Yeast extract (2 g/L)	Sigma	92144
Dextrose (1 g/L)	Sigma	D9434
Sodium chloride (5 g/L)	Thermo Fisher	S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L)	Life Technologies	12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM)	Sigma	157740-100G
Dipyridyl (200 uM)	Sigma	D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X)	Life Technologies	22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L)	Life Technologies	10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	16220
Sodium cacodylate (0.05 M)	Electron Microscopy Sciences	12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous)	Electron Microscopy Sciences	19150
Ethanol (absolute)	Sigma	E7023
Colloidal silver paint	Electron Microscopy Sciences	12630
SEM sample stubs	Electron Microscopy Sciences	75220
Coverslips	Thermo Fisher	08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit	R&D Systems	D8000C