מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Summary

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Abstract

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Introduction

Ex ovo culturing has played an important role in the study of development of the chicken^{1, 2}. This culturing method has been used to study neurological diseases, limb development, craniofacial development, and as a model to investigate malformations associated with diabetes ^{3, 4, 5}.

There are many variations to the ex ovo technique. The most common approach is to use a Styrofoam cup^6,7,8 or a glass bowl⁵. In these methods, the cup or bowl is lined with plastic wrap to cradle the embryo, a lid is placed on the cup, and the embryo is then placed in an incubator with appropriate humidity⁶. This set up however, can be technically challenging. The first challenge is the plastic wrap that is used to cradle the embryo. This wrap is difficult to work with and often does not adhere to the cup very well. To solve this problem, an elastic band is placed around the cup to hold the wrap in place. Despite this, the wrap can still slip, which is fatal to the embryo. The plastic wrap has the potential to tear or get punctured by forceps or needles that may be used during embryo manipulations and observations. Finally, this set-up is not very stable and students can easily knock the cups over. The height of the cups also makes it very difficult to place the embryo under a stereomicroscope, which has a limited objective to stage height. These challenges make it difficult for undergraduate students to work with live chick embryos in teaching labs, such as advanced developmental biology courses.

The above challenges in the ex ovo method has meant that researchers turn to the windowing method ^9,10 to view embryonic chick development. In this technique, a hole or “window” is made in the eggshell overlying the embryo. The hole can be re-sealed with tape or wax⁹ to allow for further embryonic development. Although the windowing method has some advantages, such as the ability to view embryonic development and easy maintenance, this method also has several limitations. The first is that the window needs to be fairly large in order to view the entire embryo (especially at late stages). Secondly, large windows are difficult to seal; an improper seal will lead to sterility and survivability problems. Using molten wax as a sealant adds another inconvenient and messy step to the protocol. Therefore, although the windowing method may be ideal for chick embryos at young stages (HH 11 – HH 27), viewing the entire embryo at late stages is not easily accomplished.

Here, we describe an improved and simple ex ovo culturing technique¹¹ that avoids the need for high tech equipment, is easy to handle under a stereomicroscope, gives the embryo enough support to perform microscopic manipulations, and enables researchers to view the growth of the embryo in its entirety well into the later stages of development (up to HH 40-41). With these advances in the ex ovo technique, individuals gain access to a more complete understanding of embryonic development. For instance, growth into later stages allows individuals to observe developmental processes that do not occur until this time point, such as ossification, feather development, and advanced limb and eye development. The entire embryo and extraembryonic membranes and vasculature are clearly visible. More advanced research can also be performed, such as, embryonic manipulations (i.e., implanting beadssoaked in inhibitors or inserting barriers between tissue layers), and researchers are then able to observe the effect of the manipulations in later stage embryos.

Protocol

הערה: כל הציוד מפורטים בטבלה 1.

1. אחסון עוברי העופות

1. דגירה ביצי תרנגולת של זן גאלוס גאלוס אופקי על 37 ^מעלות צלסיוס ולחות כ -40% ולהפוך ביצי פעם או פעמיים ביום. הפיכת ביצים היא חשובה כדי למנוע את העובר מהקפדה על קליפת הביצה.
2. לא להפוך את הביצה בשעה 24 לפני הקמת התרבות אחרת העובר יהיה ממוקם הגחון למסת החלמון ויהיה פגום על פתיחת הביצה בשלב 3. בנוסף, לשמור על הביצים ב 4 ^o C מעלות ללא יותר משבוע אחד לפני הדגירה לפיתוח "עצירה" אבל זה לא אידיאלי.

2. Staging עוברי עופות

1. לביים את עוברי העוף באמצעות המבורגר ושולחן בימוי המילטון ^12. השלב האידיאלי להקמת culturing לשעבר אובו הוא HH שלב 19-20 (כ 3 ימים של דגירה) BECause זה זמן קצר לאחר שהראש מסתובב על 53 hpf.
   הערה: שלב HH 19-20 מתאפיין בתכונות המורפולוגיות הבאות: somites מורחבים למרבית הזנב, אך סופו של הזנב נשאר unsegmented, ניצן הזנב מסולסל, allantois הוא קטן וכלי דם מוגבל, הרגל-הניצנים הם גדולים יותר מאשר באגף-ניצנים והעיניים הן חסרות צבע או שיש לו גוון אפרפר.

3. הסרת העובר מShell

1. לפני הסרת העובר מהפגז, לרסס את הפגז עם אתנול 70% ולאפשר לו להתייבש. אל תכבה את הביצה במהירות כמו זה יגרום ניזק לעובר.
2. נזהר שלא לשנות את הכיוון של הביצה, לפצח בזהירות את הביצה בצד התחתון (כלומר, הצד שהיה הגחון במהלך דגירה) ולשחרר את העובר לסטרילי לשקול סירה (88 x 88 x 23 מ"מ). נגב את לשקול סירות עם אתנול 70%. בדוק את העובר על מנת להבטיח כי שק החלמון אינו פגום. אם h החלמוןכשבור, לבטל את העובר, כפי שהוא לא ישרוד.
3. שים לב לעובר, כדי להבטיח שזה בר-קיימא; הלב פועם, כלי דם מופיע נורמלים, ואין חריגות ברורות נוכחים. ודא שהקצוות של הסירה לשקול יבשים.
4. בעזרת פיפטה, ירידה של 40 μl של פניצילין / סטרפטומיצין (פניצילין 5,000 יחידות, 5 סטרפטומיצין מ"ג למ"ל) על גבי אלבומין כדי למנוע זיהום.

4. הכנת תא לחות

1. הנח ערמה קטנה של kim-מגבונים ו / או כרית סופגת עשויה כותנה בחלק התחתון של מיכל פלסטיק סטרילי (12 x 12 x 6 סנטימטרים) ניגב עם אתנול 70%.
2. מוסיף מים סטריליים, מזוקקים כדי ללחלח את kim-המגבונים ו / או כותנה (כ -150 מיליליטר מים).

5. הרכבת Ex אוב התרבות

1. הנח את הסירה לשקול מכילה את העובר על גבי הריפוד הלח. לאחר מכן, מחצית מקום של צלחת פטרי רבועה סטרילי (9.5 x 9.5 סנטימטר) על גבי tהוא שוקל סירה כדי ליצור מכסה רופף.
2. מכסה את מיכל הפלסטיק עם המכסה שלה. לחץ כלפי מטה שתי פינות של המכסה, להבטיח חותם חלקי שעדיין מאפשר לזרימת אוויר טוב בתוך החדר.
3. זהירות במקום ההתקנה לתוך חממת C 37 ^o עד שלב רצוי.
4. הנח מכולות של מים בחממה כדי לעזור לשלוט בלחות, אם חממת לחות מבוקרת אינה זמינה. לעקר את כל המים בתאי לחות ובחממה ולחדש במידת הצורך במהלך תקופת הדגירה. לחות 40% היא אידיאלית.

תוצאות

לשעבר זה אוב השיטה מאפשר התצפית של עוברים משלבים המוקדמים של פיתוח (HH 19/20) לשלבים המאוחרים של התפתחות (HH 40-41) (איור 1 א ו -1 B). הגדרת התרבות בHH 19-20 מגדילה שרידות של העוברים בתרבות. לפני ראש הפיכה (לפני 53 hpf) שרידות נמוכות מאוד בתרבות ובאחרי שלב 21, ה...

Discussion

Ex אוב culturing וחלונאית לשניהם יש יתרונות ואתגרים. כאן אנו משווים את היתרונות והאתגרים של האקס קלקר כוס אוב השיטה ושיטת חלונאית לשעבר המותאם אוב השיטה שמוצגת כאן. השיטה שלנו מאפשרת מניפולציה והתבוננות קלה של עובר אפרוח בשלבים מאוחרים של התפתחות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4458	Make small aliquots to avoid freeze/thaw events
Square Petri Dish			9.5 cm x 9.5 cm
Weigh Boat	Fischer Scientific	8732113	88 x 88 x 23 mm
Ziplock container	Ziplock	N/A	12 cm x 12 cm x 6 cm