Optimisé<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Culture des embryons de poulet aux stades avancés de développement

Résumé

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Résumé

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Introduction

Ex ovo culturing has played an important role in the study of development of the chicken^{1, 2}. This culturing method has been used to study neurological diseases, limb development, craniofacial development, and as a model to investigate malformations associated with diabetes ^{3, 4, 5}.

There are many variations to the ex ovo technique. The most common approach is to use a Styrofoam cup^6,7,8 or a glass bowl⁵. In these methods, the cup or bowl is lined with plastic wrap to cradle the embryo, a lid is placed on the cup, and the embryo is then placed in an incubator with appropriate humidity⁶. This set up however, can be technically challenging. The first challenge is the plastic wrap that is used to cradle the embryo. This wrap is difficult to work with and often does not adhere to the cup very well. To solve this problem, an elastic band is placed around the cup to hold the wrap in place. Despite this, the wrap can still slip, which is fatal to the embryo. The plastic wrap has the potential to tear or get punctured by forceps or needles that may be used during embryo manipulations and observations. Finally, this set-up is not very stable and students can easily knock the cups over. The height of the cups also makes it very difficult to place the embryo under a stereomicroscope, which has a limited objective to stage height. These challenges make it difficult for undergraduate students to work with live chick embryos in teaching labs, such as advanced developmental biology courses.

The above challenges in the ex ovo method has meant that researchers turn to the windowing method ^9,10 to view embryonic chick development. In this technique, a hole or “window” is made in the eggshell overlying the embryo. The hole can be re-sealed with tape or wax⁹ to allow for further embryonic development. Although the windowing method has some advantages, such as the ability to view embryonic development and easy maintenance, this method also has several limitations. The first is that the window needs to be fairly large in order to view the entire embryo (especially at late stages). Secondly, large windows are difficult to seal; an improper seal will lead to sterility and survivability problems. Using molten wax as a sealant adds another inconvenient and messy step to the protocol. Therefore, although the windowing method may be ideal for chick embryos at young stages (HH 11 – HH 27), viewing the entire embryo at late stages is not easily accomplished.

Here, we describe an improved and simple ex ovo culturing technique¹¹ that avoids the need for high tech equipment, is easy to handle under a stereomicroscope, gives the embryo enough support to perform microscopic manipulations, and enables researchers to view the growth of the embryo in its entirety well into the later stages of development (up to HH 40-41). With these advances in the ex ovo technique, individuals gain access to a more complete understanding of embryonic development. For instance, growth into later stages allows individuals to observe developmental processes that do not occur until this time point, such as ossification, feather development, and advanced limb and eye development. The entire embryo and extraembryonic membranes and vasculature are clearly visible. More advanced research can also be performed, such as, embryonic manipulations (i.e., implanting beadssoaked in inhibitors or inserting barriers between tissue layers), and researchers are then able to observe the effect of the manipulations in later stage embryos.

Protocole

Remarque: Toutes les fournitures sont énumérées dans le tableau 1.

1. Stockage du poulet embryons

1. Incuber des œufs de poule de la souche Gallus gallus horizontalement à 37 ^o C avec environ 40% d'humidité et tourner oeufs une ou deux fois par jour. Mise oeufs est important de prévenir l'embryon d'adhérer à la coquille.
2. Ne pas tourner l'œuf dans le 24 heures avant la mise en place de la culture contraire l'embryon sera situé ventrale à la masse de jaune et sera endommagé lors de l'ouverture de l'œuf à l'étape 3. En outre, garder les œufs à 4 ^o C degrés pour pas plus d'une semaine avant l'incubation au développement "d'arrêt", mais ce ne est pas idéal.

2. Mise en scène embryons de poulet

1. Stade, les embryons de poulet en utilisant le Hamburger et Hamilton ¹² table intermédiaire. L'étape idéale pour la mise en place de la culture ex-ovo est HH stade 19-20 (autour de 3 jours d'incubation) because ce est peu de temps après que la tête tourne à 53 HPF.
   Remarque: étape HH 19-20 est caractérisé par les traits morphologiques suivantes: somites sont étendues dans la majorité de la queue, mais la fin de la queue reste non segmenté, la queue bourgeon est gondolé, l'allantoïde est petite et le système vasculaire a limité, les jambes bourgeons sont plus grandes que les ailes bourgeons et les yeux sont non pigmentée ou avoir une teinte grisâtre.

3. Retrait de l'embryon de la Shell

1. Avant de retirer l'embryon de la coquille, pulvériser la coquille avec 70% d'éthanol et laisser sécher. Ne mettez pas l'œuf rapidement car cela pourrait endommager l'embryon.
2. En faisant attention de ne pas modifier l'orientation de l'œuf, le crack attentivement l'œuf sur le côté inférieur (ce est à dire, le côté qui était ventrale pendant l'incubation) et libérer l'embryon dans une stérile pèsent bateau (88 x 88 x 23 mm). Essuyez peser bateaux avec 70% d'éthanol. Inspectez l'embryon de se assurer que le sac jaune ne est pas endommagé. Si le jaune hcomme cassé, jetez l'embryon, comme il ne survivra pas.
3. Observer l'embryon pour se assurer qu'il est viable; le cœur bat, vasculaire semble normal, et aucune anomalie évidente sont présents. Veiller à ce que les bords du bateau peser sont secs.
4. En utilisant une pipette, déposer 40 pi de pénicilline / streptomycine (5000 unités de pénicilline, la streptomycine 5 mg par ml) sur le dessus de l'albumine pour aider à prévenir l'infection.

4. Préparer la Chambre Humidité

1. Placer une petite pile de KIM-lingettes et / ou un tampon absorbant en coton dans le fond d'un récipient en plastique stérile (12 x 12 x 6 cm) essuyés avec 70% d'éthanol.
2. Ajouter l'eau distillée stérile pour humidifier les Kim-lingettes et / ou de coton (environ 150 ml d'eau).

5. Assemblage de l'Ex Ovo Culture

1. Placer le bateau peser contenant l'embryon au-dessus du rembourrage humide. Ensuite, placez la moitié d'une boîte de Pétri stérile carré (9,5 x 9,5 cm) au-dessus de til pèse bateau pour former un couvercle lâche.
2. Couvrir le récipient en plastique avec son couvercle. Appuyez deux coins du couvercle, assurant une étanchéité partielle qui permet encore pour une bonne circulation de l'air intérieur de la chambre.
3. Placez délicatement la configuration dans le 37 ^o C incubateur jusqu'au stade désiré.
4. Placer les conteneurs d'eau dans l'incubateur pour aider à contrôler l'humidité, si un incubateur à humidité contrôlée ne est pas disponible. Stériliser toute l'eau dans les chambres de l'humidité et dans l'incubateur et de reconstituer au besoin pendant la période d'incubation. 40% d'humidité optimal.

Résultats

Cette ex ovo méthode permet pour l'observation des embryons de stade précoce de développement (HH 19/20) à un stade avancé de développement (HH 40-41) (figure 1a et 1b). Mise en place de la culture à HH 19-20 augmente de survie des embryons dans la culture. Avant la rotation de la tête (avant 53 HPF) de survie est très faible dans la culture et après l'étape 21, l'embryon a tendance à coller davantage à la coquille sur l'élimination de façon moins...

Discussion

Ex ovo culture et de fenêtrage à la fois des avantages et des défis. Ici, nous comparons les avantages et les défis de la tasse de styromousse ex ovo et la méthode de fenêtrage à notre ex optimisé ovo méthode présentée ici. Notre méthode permet la manipulation et l'observation aisée de l'embryon de poulet aux derniers stades de développement et nos améliorations à l'ex ovo traditionnelle méthode ^{1, 2, 3} en font en outre très facile à ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4458	Make small aliquots to avoid freeze/thaw events
Square Petri Dish			9.5 cm x 9.5 cm
Weigh Boat	Fischer Scientific	8732113	88 x 88 x 23 mm
Ziplock container	Ziplock	N/A	12 cm x 12 cm x 6 cm