מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Summary

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Abstract

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introduction

עוברי דג הזברה (Danio rerio) היו בשימוש נרחב כמודל ללימוד פיתוח כליות ומחלת כליות פוליציסטיות. ישנם יתרונות רבים לשימוש דג הזברה כמודל חיה: את הכדאיות של חקר אינטראקציות גנטיות, את היכולת להשתמש בmorpholinos antisense (MO) למציאת חלבון, הזדמנות assay במהירות מספר גדול של עוברים, ואת הקלות של צפייה פנוטיפים איבר ב חיים זחלים ^1. כִּליַת רֵאשִׁית היא הכליה הראשונה לפתח בבעלי חוליות ופונקציונלי בדג הזברה זחל ^2. המבנה של דג הזברה כִּליַת רֵאשִׁית בהשוואה פשוט יחסית לmetanephros היונקים, הכליות שלישי ואחרונה להתפתח ביונקים. נפרון הוא יחידת העבודה של הכליות, עם כל כליה אנושית המכילה בין 500,000-1,000,000 nephrons ^3,4 וכל כליה עכבר יש כ -13,000 nephrons ^5, ולכן קשה להבחין מבנה נפרון יחיד in כליות אדם או לעכבר. יש דג הזברה רק שני nephrons, וכל נפרון דג הזברה מכיל את כל הרכיבים העיקריים נמצאים בglomerulus והצינוריות של עכברים ובני אדם ⁶ וסוגי תאים דומים מתמחים כליות. בהשוואה לדגמי חוליות אחרות כגון Xenopus, נפרון דג הזברה דומה יותר נפרון היונקים כי יש לו מערכת סגורה ^7.

בשנים האחרונות, הגנום דג הזברה כבר רצף, המאפשר היכרות הרחבה של כלים גנטיים, מוטציה משאבים נרחבים, ואוספים של קווי כתב מהונדסים בדגמי דג הזברה. כִּליַת רֵאשִׁית דג הזברה הצורות בין 12-72 לאחר שעה ההפריה (hpf) וניתן דמיינו בקלות בעוברים השקופים. חלבון הגידול של וילם WT1 הוא גורם חיוני להתפתחות כליות. קווי דג הזברה מהונדסים מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן wt1b Tg (wt1b: GFP) להראות expre GFPssion ממוקם דווקא באזורי pronephric בעוברי דג הזברה, החל מ -17 hpf ^8. Nephronophthisis (NPHP), מחלת כליות פיברוזיס אוטוזומלית רצסיבית, נגרמת על ידי מוטציות של גני NPHP ^9. NPHP4 מציאה על ידי morpholino גרם היווצרות ציסטה בTg (wt1b: GFP). דגי ¹⁰ לכן, דג מהונדס זה הוא מודל מתאים להתבוננות מבני כליות והיווצרות ציסטה במהלך התפתחות כליות. חשוב לציין, את ההשפעה של מאפננים של פיתוח כליות ניתן ללמוד באמצעות זן זה בזמן ובאופן יעיל עבודה.

העיתון שלנו מתאר את השימוש בTg (wt1b: GFP) דגים כמודל לדמיין היווצרות ציסטה בכליות לאחר אפנון הגן. אנחנו השתמשנו נגד תחושה-אתר שחבור ההתחלה וMOS להפיל את גן wnt5a בדג זברה. Wnt5a הוא גליקופרוטאין מופרש הלא קנוניה של משפחת Wnt שממלא תפקיד חשוב בהתפתחות איברים ולאחר לידה סלולרית שוניםפונקציה ^11. Wnt5a עובד דרך מסלולי Wnt הלא קנוניות, כוללים מסלול קוטבי תא מישוריים (PCP), שכבר נמצא לשחק תפקיד בחלוקת תא אוריינטציה במהלך התארכות צינורי כליות. Wnt5a מסדיר את המסלול / PCP Wnt על ​​ידי יצירה מורכבת עם קולטן כמו טירוזין קינאז (ריק), אשר transduces איתות Wnt5a נוסף על ידי יצירה מורכבת עם חלבוני VANGL קוטביות תא מישוריים 2 (Vangl2), ובכך לקדם יציבות Vangl2 ^12. פגמים במסלול PCP יכולים לגרום לחלוקת תא אקראית ולגרום להיווצרות ציסטה בכליה. אנחנו השתמשנו Tg (wt1b: GFP) קו דג הזברה להתבונן היווצרות ציסטה בכליות הבאות מציאה wnt5a. Tg (wt1b: GFP) מודל דג הזברה מאפשר הדמיה חיה ותצפית בזמן של מבנה כליות. לאחר מציאה wnt5a, היווצרות ציסטה בכליות נמצאה מתחילה ב 24 hpf; בגיל 72 hpf, ניתן היו למצוא ציסטות בglomeruli וtubules הפרוקסימלי. שיטה זו יכולה לשמש גם ליםקרין גנים אחרים שעלולים לגרום להיווצרות ציסטה בכליות.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה כל ניסויי דג הזברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית הספר לרפואת וירג'יניה מזרח.

1. הכנת Morpholino

1. עיצוב ולסנתז תרגום חסימה (AUG-) וoligonucleotides morpholino אנטי תחושת עיכוב אחוי (Splice-) (MO) לגן של עניין בהתאם להוראות יצרן (איור 1 א). אנא ראה מידע של היצרן בטבלה 1.
   הערה: MOS נשלחים כמניות lyophilized בבקבוקי זכוכית.
2. מוסיף מים סטריליים בדרגה גבוהה לבקבוקי הזכוכית מחדש להשעות MOS לריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / μl. ודא שoligonucleotide הוא נמס לגמרי. אם כמה שרידים מוצקים, לחמם את הבקבוקון המכיל את פתרון oligonucleotide המניה על 65 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 10 דקות ובקצרה מערבולת.
3. אחסן את פתרון מניות MO ב RT. אין לאחסן אותם על 4 מעלות צלזיוס או -20 °; C בגלל טמפרטורות נמוכות עלולות לגרום לoligonucleotide MO להיקשר לקיר מיכל. למדוד את הריכוז של פתרון המניות באמצעות ספקטרופוטומטר (עיין טבלת 1) בכל פעם שפתרון מניות MO חדש הוא עשה.
4. הכן את הפתרון עובד MO ביום ההזרקה על ידי דילול פתרון המניות עם מים סטריליים בדרגה גבוהה למינון הרצוי. הוסף 0.5% פנול-אדום כדי להגיע לריכוז של 0.05%. לדוגמא, כדי להפוך את הפתרון עובד 5 μl עם ריכוז של 15 ng / NL, להוסיף 3 פתרון מניות μl MO ופנול-אדום 0.5 μl 0.5% לרמה של 1.5 μl מים.
   הערה: עם ריכוז עבודה זו, כל טיפה (500 pl) של הזרקה מכילה 7.5 ננוגרם של MO ושתי טיפות מכילות 15 ng של MO.

2. הכנת מכשירי ההזרקה

1. זכוכית רכישה מראש משכה מחטים (ראה טבלת מס '1 למידע מפורט). לחלופין, למשוך את wi מחט זריקת הכוסth חולץ מחט.
2. הפעל את מדחס האוויר ולהתאים את לחץ הגדרה ל -50 psi. הפעל את המקור לנתח מיקרוסקופ אור ומשאבת הזרקת מיקרו פיקו ולהתאים את ההגדרות באופן הבא: החזק את לחץ 20 psi, להוציא לחץ 10 psi, ערך תקופה של טווח 2.5 ו -100 μsec של gating.
3. טען את זכוכית מחט מראש משכה-עם 5 μl של פתרון ההזרקה ולמקם את המחט במצב אנכי עם הקצה כלפי מטה. חכה עד שכל הפתרון מגיע קצה המחט ללא בועות אוויר נראות לעין. מניחים את בעל המחט בעמדה מתאימה בסמוך למיקרוסקופ ולהכניס את מחט הזכוכית לתוך המחזיק. כוון את זווית הזריקה ל -45 מעלות.
4. להביא את קצה המחט לעין מתחת למיקרוסקופ, גבוהה מהבמה, ולהתמקד באזור הדק ביותר של הקצה. לשבור את קצה המחט עם פינצטה נקודה עדינה.
5. הנח שליט וצינור נימים עם קוטר פנימי של צד מ"מ 0.15 על ידי צד מתחת למיקרוסקופ;להזריק את התמיסה לתוך קצה אחד של צינור הנימים לעשות עמודת נוזל. התאם את זמן השליפה להגיע לכל 17 טיפות לכל עמודת נוזל אורך 1 מ"מ, ולאחר מכן את עוצמת הקול של כל טיפה היא nl 1 (ירידה = π x רדיוס ² אורך x (/ ספירה (טיפות) נפח של טור נוזלי).
   הערה: ירידה בקוטר של 0.1 מ"מ נותנת נפח הזרקה של כ -500 pl (ירידת נפח = 4/3 x π x רדיוס ^3).

3. הכנת מופרת עוברי דג הזברה והזרקה עם Morpholinos

1. הגדר את Tg (wt1b: GFP) זוגות רבייה דג הזברה מהונדסים על פי פרוטוקולים שפורסמו לגידול דג הזברה סטנדרטי ותחזוקה. איסוף עובר אחרי שרצים טבעי, ולשמור אותם בצלחת פטרי 10 סנטימטרים מלאים במי E3 (5 מ"מ NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 מ"מ CaCl _2, 0.33 מ"מ MgSO _4). התחל הזרקת MO מייד ^13. צג מורפולוגיה עובר מתחת למיקרוסקופ ולעשות הזרקת MO בטוחה היא בחדשלב תא, או לא יאוחרו משלב ארבעה התאים.
   1. מעביר את העוברים לצלחת פטרי 10 סנטימטר עם טריז בצורה אגר שקתות. לשאוב המים E3 נוספים ולחץ בעדינות את העוברים לשקתות.
   2. מניפולציות עובר עם micropipette לדמיין עובר שלב 1-תא מתחת למיקרוסקופ לנתח. לחדור סיסית ואז החלמון להזריק טיפה אחת או שתיים של MO בחלמון (הירידה של 1 = 500 pl). מעביר את העוברים הוחדרו לצלחת פטרי 10 סנטימטר עם מים E3 ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס.
2. לאחר הזריקות, להסיר את העוברים המתים ולהקליט את מספר העוברים מוזרקים. החלף את המים E3 בצלחת בכל 24 עד 48 שעות.

4. ניסויי הפנוטיפ הצלה

1. בחר orthologue ממין אחר שיש לו מבנה זוג בסיס העיקרי שונה (בדרך כלל 3-7 חוסר התאמה זוג בסיס), והוא, לכן, עמיד לMO, להצלה. לדוגמא, בניסוי זה, בחרנועכבר בגלל רצף העכבר Wnt5a mRNA שונה מרצף דג הזברה.
2. עיצוב פריימר שנקבע עם פריימר קדימה מתחיל באתר translational ופריימר ההפוכה בסמוך לסוף אזור קידוד mRNA. הוסף רצף אמרגן T7 ב5'- סוף רצף פריימר קדימה. בניסוי זה, השתמשנו ברצפי פריימר הבאים; קדימה: 5'- TAA מיקס GAC TCA תג CTA GGA CTA TGA TGC TGC TGA TGA AGC a- 3 'ולהפוך: 5'- TCA CTT GCA GAC gta CTG gtc- 3'.
3. בצע תגובת 50 μl שרשרת פולימראז (PCR) עם סט פריימר (0.5 מיקרומטר של כל צבע יסוד) נועד לעיל ו0.1 מיקרוגרם תבנית ה- DNA המכיל את רצף עכבר Wnt5a cDNA עם תכנית ה- PCR הבאה: מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 35 מחזורים של 95 ° C (30 שניות), 58.5 ° C (30 שניות), 72 ° C (1 דקות); וצעד ​​ארכה סופי על 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות.
4. לאחר שסיימתי את tהוא מעגל, לרוץ 2 μl של מוצר ה- PCR על 1% agarose ג'ל כדי לוודא את הלהקה היא בגודל הנכון. לטהר את מוצר ה- PCR עם ערכת טיהור PCR על פי הוראות יצרן. בדוק ריכוז ה- DNA עם ספקטרופוטומטר. אחסן את מוצר ה- PCR מטוהר ב -20 ° C או להשתמש ישירות בשעתוק RNA כתרים בשלב הבא.
5. לסנתז במבחנה כתרים mRNA עם ערכת סינתזת RNA כתרים על פי הוראות היצרן. לדלל את mRNA ב -20 מים חופשיים RNase μl ולקבוע את הריכוז. Aliquot RNA ולאחסן ב -80 ° C.
6. ביום ההזרקה, להכין פתרון עבודה של mRNA עם מים סטריליים חופשיים RNase. שים לב כי 40 pg הוא בדרך כלל מינון RNA הגבוה ביותר שבי השפעות ספציפיות או רעילות של RNA אינן מתרחשות. שמור את הפתרון עובד על קרח. להזריק את העובר עם MO ולאחר מכן mRNA ההצלה, או שיתוף להזריק את שניהם יחד. לדוגמא, אם הריכוז של prepar mRNAed בשלב 4.5 הוא 0.6 מיקרוגרם / μl, להוסיף 0.67 μl של mRNA (0.4 מיקרוגרם) ל4.33 μl של מים חופשיים RNase לעשות ריכוז סופי של 0.08 מיקרוגרם / μl, אז טיפה אחת (500 pl) של כל זריקה מכילה 40 pg של mRNA. הכן MO כמתואר בשלב 3.

5. הכנת עוברים מוזרקים להדמית פלורסנט

1. לאחר דגירה על 28.5 מעלות CO / N, להוסיף 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) למים E3 כדי למנוע melanization, אשר משפיע על תצפית של מבנה כִּליַת רֵאשִׁית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, אל תוסיף PTU לפני gastrulation, כי זה משפיע על התפתחות עוברית מוקדמת.
2. ב 48 hpf, dechorionate ידני את העוברים עם פינצטה בסדר. קח תמונות של 48 ו -72 עוברים hpf תחת מיקרוסקופ לנתיחה אור.
   הערה: ניתן לצלם תמונות אלה ללא הרדמה.
3. כ 10 דקות לפני הדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להרדים את העוברים על ידי הצבת אותם לצלחת פטרי 10 סנטימטרים המכילה 160 מיקרוגרם / מיליליטר Tricaine נאגר. חכה למשך 5-10 דקות, ולאחר מכן באורח קל לגעת בדג הזברה כדי לוודא שהם לא זזים ולכן ההרדמה עובדת.
4. לאחר העוברים מורדמים, לעגן אותן ב- 3% תאית מתיל ומכוון אותם במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתח (אנא עיינו בטבלת 1).
5. שים לב למבנה כִּליַת רֵאשִׁית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אנא עיין בטבלת 1) ולצלם בהגדלה שונה (10X ו20X).

תוצאות

Wnt5a להפיל הושג על ידי החדרת תרגום חסימת MO (אוגוסט-MO) או אחוי גבול אקסון / אינטרון MO (אחוי-MO) לעוברי דג הזברה בשלב תא אחד. האוג-MO מטרות קודון ההתחלה, ולכן, מעכב שניהם הודעת wnt5a האימהית וzygotic. אחוי-MO מטרות אתר תורם אחוי השלישי ומעכב את תמליל zygotic רק של wnt5a (איור 1 א)...

Discussion

מחלת כליות פוליציסטיות (PKD) היא אחד מהגורמים העיקריים למחלת כליות סופנית בבני אדם ומאופיין בהיווצרות מתקדמת ציסטה, הרחבת כליות, ופיתוח אבובית נורמלי ^14. PKD אוטוזומלית הדומיננטי (ADPKD) הוא מחלה גנטית שבו מוטציה של שני PKD1, קידוד polycystin-1 (PC1), או PKD2, קידוד polycystin-2 (PC2), תוצא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop