Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di<em&gt; Wnt5a</em&gt; Provoca cisti in Zebrafish Reni

Riepilogo

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Abstract

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introduzione

Zebrafish (Danio rerio) gli embrioni sono stati ampiamente utilizzati come modello per lo studio dello sviluppo del rene e rene policistico. Ci sono molti vantaggi di utilizzare zebrafish come un modello animale: la fattibilità di studiare le interazioni genetiche, la capacità di utilizzare Morpholinos antisenso (MO) per le proteine ​​atterramento, l'opportunità di saggiare rapidamente un gran numero di embrioni, e la facilità di visualizzazione fenotipi organo in larve ¹ vivono. I pronephros è il primo rene a sviluppare nei vertebrati ed è funzionale in zebrafish larvale ^2. La struttura dei pronephros zebrafish è relativamente semplice rispetto alle metanefro mammiferi, la terza e ultima rene sviluppare nei mammiferi. Il nefrone è l'unità di lavoro del rene, con ogni rene umano contenente tra 500,000-1,000,000 nefroni ^3,4 e ciascun rene del mouse con circa 13.000 nefroni ^5, il che rende difficile osservare la struttura singola nefrone in reni umani o il mouse. Il pesce zebra ha solo due nefroni, e ogni nefrone zebrafish contiene tutti i principali componenti presenti nel glomerulo e tubuli di topi e gli esseri umani ⁶ e tipi di cellule renali specializzati simili. Rispetto ad altri modelli di vertebrati, come Xenopus, nefrone zebrafish assomiglia più da vicino il nefrone mammiferi perché ha un sistema chiuso ^7.

Negli ultimi anni, il genoma zebrafish è stato sequenziato, permettendo l'ampia introduzione di strumenti genetici, ampie risorse mutanti, e raccolte di linee giornalista transgeniche nei modelli di zebrafish. Pronefro zebrafish forme tra 12-72 ore dopo la fecondazione (HPF) e possono essere visualizzati facilmente negli embrioni trasparenti. Proteina tumore del Wilm WT1 è un fattore essenziale per lo sviluppo del rene. Linee di zebrafish transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore wt1b Tg (wt1b: GFP) mostrano GFP espresfissione specificamente trova nelle regioni pronephric in embrioni di zebrafish, a partire dal 17 hpf ^8. Nefronoftisi (NPHP), una malattia renale cistica autosomica recessiva, è causata da mutazioni di geni NPHP ^9. NPHP4 atterramento da morpholino causato la formazione di cisti nel Tg (wt1b: GFP). Pesce ¹⁰ Pertanto, questo pesce transgenico è un modello adatto per osservare le strutture renali e formazione di cisti durante lo sviluppo del rene. È importante sottolineare che l'influenza di modulatori di sviluppo rene può essere studiata utilizzando questo ceppo in un tempo e manodopera modo efficiente.

Il nostro documento descrive l'uso di Tg (wt1b: GFP) pesce come modello per visualizzare rene formazione di cisti dopo la modulazione del gene. Abbiamo usato inizio e splice-site anti-senso MOs per abbattere il gene Wnt5a in zebrafish. Wnt5a è una glicoproteina secreta non canonica della famiglia Wnt che svolge un ruolo importante nello sviluppo dei vari organi e postnatale cellularefunzione ^11. Wnt5a opera attraverso percorsi Wnt non canonici, tra cui il percorso di polarità planare delle cellule (PCP), che è stato trovato a svolgere un ruolo nella divisione cellulare orientato durante renale allungamento tubolare. Wnt5a regola l'/ PCP pathway Wnt formando un complesso con il recettore come tirosina chinasi (Ryk), che trasduce ulteriormente segnalazione Wnt5a formando un complesso con la proteina VANGL polarità cellulare planare 2 (Vangl2), promuovendo in tal modo la stabilità Vangl2 ^12. Difetti nella via PCP possono provocare divisione cellulare casuale e causare la formazione di cisti renale. Abbiamo usato il Tg (wt1b: GFP) Linea zebrafish per osservare la formazione di cisti renali dopo Wnt5a atterramento. Il Tg (wt1b: GFP) modello di zebrafish permette l'imaging dal vivo e l'osservazione puntuale della struttura del rene. Dopo Wnt5a atterramento, formazione di cisti renali è stato trovato con inizio alle 24 HPF; a 72 HPF, cisti potrebbero essere trovati nei glomeruli e tubuli prossimali. Questo metodo può essere utilizzato anche per sCreen altri geni che possono causare la formazione di cisti renali.

Protocollo

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti gli esperimenti di zebrafish sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso la Virginia Medical School orientale.

1. Morpholino Preparazione

1. Progettazione e sintesi di traduzione-bloccante (AUG-) e-giunzione inibizione (Splice-) antisenso morfolino (MO) oligonucleotidi per il gene di interesse secondo le istruzioni del produttore (Figura 1A). Si prega di consultare le informazioni del produttore nella tabella 1.
   NOTA: MO vengono spediti come scorte liofilizzati in bottiglie di vetro.
2. Aggiungere acqua sterile alta qualità per le bottiglie di vetro per risospendere MOs ad una concentrazione finale di 25 mg / mL. Assicurarsi che l'oligonucleotide è completamente sciolto. Se alcuni resti solidi, riscaldare il flaconcino contenente la soluzione di riserva oligonucleotide a 65 ° C per 5 a 10 minuti e vortex brevemente.
3. Conservare la soluzione di riserva MO a RT. Non riporli a -20 ° 4 ° C o; C perché le temperature più basse possono provocare l'oligonucleotide MO di legarsi alla parete del contenitore. Misurare la concentrazione della soluzione madre utilizzando uno spettrofotometro (fare riferimento alla Tabella 1) ogni volta che un nuovo MO soluzione madre è fatto.
4. Preparare la soluzione di lavoro MO il giorno dell'iniezione diluendo la soluzione madre con acqua sterile alta qualità alla dose desiderata. Aggiungere 0,5% di fenolo-rosso per raggiungere una concentrazione di 0,05%. Ad esempio, per rendere soluzione di lavoro 5 microlitri con una concentrazione di 15 ng / nL, aggiungere 3 microlitri soluzione stock MO e 0,5 microlitri 0,5% di fenolo-rosso a 1,5 ml di acqua.
   NOTA: Con questa concentrazione di lavoro, ogni goccia (500 pl) di iniezione contiene 7,5 ng di MO e due gocce contiene 15 ng di MO.

2. Preparazione del Apparato Injection

1. Vetro Acquisto aghi pre-tirato (vedi Tabella 1 per informazioni dettagliate). In alternativa, tirare l'iniezione di vetro ago with un estrattore ago.
2. Accendere il compressore d'aria e regolare l'impostazione di 50 psi pressione. Accendere la sorgente di luce microscopio da dissezione e Pico pompa micro-iniezione e regolare le impostazioni come segue: mantenere la pressione 20 psi, espellere pressione 10 psi, valore periodo di 2,5 e 100 msec gamma di gating.
3. Caricare il bicchiere ago pre-stirato con 5 ml di soluzione di iniezione e inserire l'ago in posizione verticale con la punta rivolta verso il basso. Attendere che tutta la soluzione raggiunge la punta dell'ago con bolle d'aria visibili. Posizionare il porta-aghi in una posizione appropriata vicino al microscopio e inserire l'ago di vetro nel supporto. Regolare l'angolo di iniezione a 45 gradi.
4. Portare la punta dell'ago in vista al microscopio, alta dal palco, e concentrarsi sulla regione più sottile della punta. Spezzare la punta dell'ago con una pinzetta punta fine.
5. Posizionare un righello e un tubo capillare con diametro interno di 0,15 mm di lato a fianco al microscopio;iniettare la soluzione in una estremità del tubo capillare per effettuare una colonna di liquido. Regolare il tempo di espulsione per raggiungere ogni 17 gocce per 1 mm di colonna lunghezza di liquido, poi il volume di ogni goccia è 1 NL (volume goccia = π x raggio ² x lunghezza (di colonna di liquido) / count (di gocce).
   NOTA: Una goccia di diametro 0,1 mm restituisce un volume di iniezione di circa 500 pl (volume goccia = 4/3 x π x raggio ^3).

3. Preparazione di fertilizzato Zebrafish embrioni e iniezione con Morpholinos

1. Impostare Tg (wt1b: GFP) transgenici coppie nidificanti zebrafish secondo protocolli pubblicati per la zootecnia zebrafish di serie e la manutenzione. Raccogliere gli embrioni dopo progenie naturale, e tenerli in una piastra di Petri 10 centimetri riempito con acqua E3 (5mm NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM CaCl _2, 0,33 MgSO mm _4). Inizia iniezione MO subito ^13. Monitorare dell'embrione morfologia al microscopio e assicurarsi iniezione MO è al onefase delle cellule, o al più tardi nella fase quattro celle.
   1. Trasferire gli embrioni di una capsula di Petri 10 centimetri con il cuneo a forma di agar depressioni. Aspirare l'acqua E3 supplementare e premere delicatamente gli embrioni nelle depressioni.
   2. Manipolare gli embrioni con la micropipetta di visualizzare 1-cellule di embrioni stadio sotto il microscopio da dissezione. Penetrare il corion e poi il tuorlo di iniettare una o due gocce di MO nel tuorlo (1 goccia = 500 pl). Trasferire gli embrioni iniettati di 10 cm capsula di Petri con acqua E3 e incubare a 28,5 ° C.
2. Dopo le iniezioni, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituire l'acqua E3 nel piatto ogni 24-48 ore.

4. Esperimenti fenotipo di soccorso

1. Selezionare un ortologo da un'altra specie che ha una diversa struttura di coppia di base principale (di solito 3-7 coppie di basi disallineamenti) ed è, quindi, resistenti al MO, per il soccorso. Ad esempio, in questo esperimento, abbiamo sceltoMouse perché la sequenza del mouse Wnt5a mRNA è differente dalla sequenza zebrafish.
2. Progettare un set di primer con il primer forward partenza dal sito traslazionale e il primer reverse da vicino alla fine della regione codificante mRNA. Aggiungere una sequenza promotore T7 alla 5'fine della sequenza primer forward. In questo esperimento, abbiamo utilizzato le seguenti sequenze di primer; avanti: 5'-TAA tac gac tca tag cta cta gga tga TGC TGC tga agc tga a- 3 'e retromarcia: 5'-TCA ctt gca gac gta ctg gtc- 3'.
3. Eseguire Polymerase Chain Reaction 50 microlitri (PCR) con il set di primer (0,5 mM di ciascun primer) progettati sopra e 0.1 mg DNA stampo contenente il mouse Wnt5a sequenza cDNA con il seguente programma PCR: 1 ciclo a 95 ° C per 5 min; 35 cicli di 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 minuto); e passo estensione finale a 72 ° C per 7 minuti.
4. Dopo aver terminato tegli ciclo, eseguito 2 ml di prodotto di PCR su 1% gel per assicurarsi che la banda è la dimensione giusta. Purificare il prodotto di PCR con un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Controllare concentrazione di DNA con uno spettrofotometro. Conservare il prodotto di PCR purificato a -20 ° C o utilizzare direttamente capped trascrizione dell'RNA nel passaggio successivo.
5. Sintetizzare in vitro capped mRNA con un kit di sintesi di RNA capped secondo le istruzioni del produttore. Diluire il mRNA in 20 microlitri RNasi acqua gratuita e determinare la concentrazione. Aliquota della RNA e conservare a -80 ° C.
6. Il giorno dell'iniezione, preparare una soluzione di lavoro del mRNA con RNasi acqua sterile libera. Si noti che il 40 pg è generalmente la dose massima RNA in cui effetti non specifici o tossici del RNA non si verificano. Mantenere la soluzione di lavoro su ghiaccio. Iniettare l'embrione con MO e quindi l'mRNA di salvataggio, o co-iniezione di entrambi insieme. Ad esempio, se la concentrazione del prepar mRNAed al passo 4.5 è 0,6 mg / mL, aggiungere 0,67 ml di mRNA (0,4 mg) di 4,33 ml di acqua RNasi libero di fare una concentrazione finale di 0,08 mg / mL, allora una goccia (500 pl) di ciascuna iniezione contiene 40 pg di mRNA. Preparare MO come descritto al punto 3.

5. Preparazione di embrioni iniettati per Imaging fluorescente

1. Dopo incubazione a 28,5 ° CO / N, aggiungere 0,003% N-feniltiourea (PTU) all'acqua E3 per prevenire melanizzazione, che colpisce l'osservazione della struttura pronephros mediante microscopia a fluorescenza. Tuttavia, non aggiungere PTU prima gastrulation, perché colpisce sviluppo embrionale precoce.
2. Al 48 HPF, dechorionate manualmente gli embrioni con pinzette sottili. Prendere le immagini di 48 e di 72 embrioni HPF al microscopio dissezione luce.
   NOTA: Queste immagini possono essere prese senza anestesia.
3. Circa 10 minuti prima di imaging al microscopio a fluorescenza, anestetizzare gli embrioni mettendoli inuna capsula di Petri 10 centimetri contenente 160 mg / ml tamponata Tricaine. Attendere 5-10 minuti, quindi toccare leggermente il zebrafish per verificare che non si muovono e quindi l'anestesia sta lavorando.
4. Dopo gli embrioni vengono anestetizzati, montarli in 3% metilcellulosa e li orientano in posizione prona sotto un microscopio da dissezione (fare riferimento alla Tabella 1).
5. Osservare la struttura pronephros sotto un microscopio a fluorescenza (fare riferimento alla Tabella 1) e scattare foto a diversi ingrandimenti (10X e 20X).

Risultati

Wnt5a abbattere è stato ottenuto con l'introduzione di traduzione bloccando MO (AUG-MO) o esone / introni splice confine MO (giuntura-MO) per zebrafish embrioni nella fase di una cella. Il AUG-MO rivolge il codone di inizio e, quindi, inibisce entrambi messaggio Wnt5a materna e zigotico. La giunzione-MO rivolge il terzo sito donatore di splicing e inibisce solo la trascrizione zygotic di Wnt5a (Figura 1A). Il AUG- e morphants splice- phenocopied vicenda con più difetti, tra cui l...

Discussione

Rene policistico (PKD) è una delle principali cause di malattia renale allo stadio terminale nell'uomo ed è caratterizzata da progressiva formazione di cisti, l'allargamento renale, e lo sviluppo tubulo anormale ^14. Autosomica dominante PKD (ADPKD) è una malattia genetica in cui la mutazione di una PKD1, codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, codifica policistina-2 (PC2), i risultati di reni policistiche. Molti altri geni, in particolare quelli che codificano proteine ​​che si trovano nel cilium...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop