Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causes kystes chez le poisson zèbre reins

Résumé

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Résumé

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introduction

Poisson zèbre (Danio rerio) embryons ont été largement utilisé comme un modèle pour étudier le développement du rein et la polykystose rénale. Il existe de nombreux avantages à l'utilisation du poisson zèbre comme modèle animal: la faisabilité de l'étude des interactions génétiques, la capacité d'utiliser morpholinos antisens (MO) pour la protéine knockdown, la possibilité de doser rapidement un grand nombre d'embryons, et la facilité de visualisation des phénotypes d'organes en ^une larves vivantes. Les pronéphros est le premier rein à développer chez les vertébrés et est fonctionnel chez le poisson zèbre larves ^2. La structure des pronéphros poisson zèbre est relativement simple par rapport à métanéphros mammifères, la troisième et dernière rein de développer chez les mammifères. Le néphron est l'unité de travail du rein, rein humain avec chacun contenant entre ^3,4 et 500,000-1,000,000 néphrons chaque rein de souris ayant environ 13000 néphrons ^5, il est difficile d'observer la structure de néphron unique in reins humains ou de souris. Le poisson zèbre n'a que deux néphrons, et chaque néphron poisson zèbre contient tous les composants majeurs trouvés dans le glomérule et les tubules de souris et les humains ⁶ et types similaires de cellules rénales spécialisés. Par rapport à d'autres modèles de vertébrés tels que Xenopus, le poisson zèbre néphron ressemble plus étroitement néphron de mammifère parce qu'il a un système fermé ^7.

Au cours des dernières années, le génome du poisson zèbre a été séquencé, ce qui permet la mise en place de l'ensemble des outils génétiques, de vastes ressources mutantes et des collections de lignées rapporteuses dans des modèles transgéniques de poisson zèbre. Les pronéphros de poisson zèbre formes entre 12-72 heures après la fécondation (HPF) et peuvent être visualisées facilement dans les embryons transparents. La protéine de tumeur du Wilm WT1 est un facteur essentiel pour le développement du rein. Lignes de poisson zèbre transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur de wt1b Tg (wt1b: GFP) montrer GFP EXPREssion spécifiquement situé dans les régions pronephrique dans embryons de poisson zèbre, à partir de 17 hpf ^8. Néphronophtise (NPHP), une maladie du rein kystique autosomique récessive, est causée par des mutations de gènes NPHP ^neuf. NPHP4 knockdown morpholino causé par la formation de kystes dans la Tg (wt1b: GFP). Poisson ¹⁰ Par conséquent, ce poisson transgénique est un modèle approprié pour l'observation des structures de rein et la formation de kystes au cours du développement rénal. Fait important, l'influence des modulateurs de développement du rein peut être étudiée en utilisant cette souche dans un temps et du travail de manière efficace.

Notre article décrit l'utilisation de Tg (wt1b: GFP) poisson comme un modèle de visualiser la formation de kystes rénaux après modulation génique. Nous avons utilisé le site d'épissage de début et anti-sens OM pour abattre le gène Wnt5a chez le poisson zèbre. Wnt5a est une glycoprotéine sécrétée non-canonique de la famille Wnt qui joue un rôle important dans le développement de divers organes et postnatal cellulairefonction ^11. Wnt5a fonctionne par des voies Wnt non canoniques, y compris la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP), qui se est révélé jouer un rôle dans la division cellulaire lors de l'allongement orienté tubulaire rénale. Wnt5a régule la voie / PCP Wnt en formant un complexe avec le récepteur, comme la tyrosine kinase (Ryk), qui transduit en outre signalisation Wnt5a en formant un complexe avec le VANGL protéine de la polarité cellulaire plane 2 (Vangl2), favorisant ainsi Vangl2 stabilité ^12. Défauts dans la voie de PCP peuvent entraîner dans la division cellulaire aléatoire et provoquer la formation de kyste rénal. Nous avons utilisé le Tg (wt1b: GFP) ligne poisson zèbre pour observer la formation de kystes rénaux suivante Wnt5a knockdown. Le Tg (wt1b: GFP) modèle de poisson zèbre permet l'imagerie en direct et l'observation en temps opportun de la structure du rein. Après Wnt5a knockdown, la formation de kystes rénaux a été trouvée à partir de 24 hpf; à 72 HPF, les kystes peuvent être trouvés dans les glomérules et les tubules proximaux. Cette méthode peut également être utilisée pour sCreen autres gènes qui pourraient provoquer la formation de kystes rénaux.

Protocole

Déclaration de l'éthique: NOTE: Toutes les expériences de poisson zèbre ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Eastern Virginia Medical School.

1. Préparation Morpholino

1. Conception et traduction synthétiser-blocage (août-) et épissage inhiber (jonction ou) anti-sens morpholino (MO) oligonucléotides pour le gène d'intérêt selon les instructions du fabricant (figure 1A). Se il vous plaît voir les informations du fabricant dans le tableau 1.
   NOTE: OM sont expédiées comme les stocks lyophilisés dans des bouteilles en verre.
2. Ajouter de l'eau stérile de haute qualité pour les bouteilles en verre pour remettre en suspension les OM à une concentration finale de 25 ug / ul. Assurez-vous que l'oligonucléotide est complètement dissous. Si quelques restes solides, chauffer le flacon contenant la solution stock oligonucléotide à 65 ° C pendant 5 à 10 min et le vortex brièvement.
3. Rangez la solution stock de MO à température ambiante. Ne pas les stocker à 4 ° C ou -20 °; C car des températures plus basses peuvent provoquer l'oligonucléotide MO à se lier à la paroi du récipient. Mesurer la concentration de la solution d'achat d'actions à l'aide d'un spectrophotomètre (se il vous plaît se référer à Tableau 1) à chaque fois une nouvelle solution MO boursier est faite.
4. Préparer la solution de travail MO sur le jour de l'injection par dilution de la solution mère avec de l'eau stérile de haute qualité pour la dose souhaitée. Ajouter 0,5% de phénol-rouge pour atteindre une concentration de 0,05%. Par exemple, pour rendre la solution de travail de 5 pi avec une concentration de 15 ng / nL, ajouter 3 pi MO solution stock et 0,5 ul de 0,5% de phénol-rouge pour 1,5 pi d'eau.
   NOTE: Avec cette concentration de travail, chaque goutte (500 pl) d'injection contient 7,5 ng de MO et de deux gouttes contient 15 ng de MO.

2. Préparation de l'appareil d'injection

1. Achat verre aiguilles pré-tiré (se il vous plaît voir le tableau 1 pour des informations détaillées). Sinon, tirez l'injection de verre aiguille with un extracteur de l'aiguille.
2. Allumez le compresseur d'air et d'ajuster le réglage à 50 psi pression. Allumez la source de lumière du microscope de dissection et Pico pompe micro-injection et d'ajuster les paramètres comme suit: maintenir la pression de 20 psi, éjectez la pression de 10 psi, la valeur de période de 2,5 et 100 microsecondes gamme de déclenchement.
3. Chargez le verre aiguille pré-tiré avec 5 pi de la solution d'injection et placer l'aiguille dans une position verticale avec la pointe vers le bas. Attendez jusqu'à ce que toute la solution atteint la pointe de l'aiguille sans bulles d'air visibles. Placer le support d'aiguille dans une position appropriée à côté du microscope et insérer l'aiguille de verre dans le support. Ajustez l'angle d'injection à 45 degrés.
4. Apportez la pointe de l'aiguille dans la vue sous le microscope, haute hors de la scène, et se concentrer sur la région la plus mince de la pointe. Casser la pointe de l'aiguille avec de fines pinces ponctuelles.
5. Placez une règle et un tube capillaire avec diamètre intérieur de 0,15 mm côte à côte sous le microscope;injecter la solution dans une extrémité du tube capillaire à faire une colonne de liquide. Réglez le temps d'éjection pour atteindre toutes les 17 gouttes par colonne de liquide de longueur de 1 mm, le volume de chaque goutte est une nl (volume de la goutte = π x rayon de ² x de longueur (de la colonne de liquide) / nombre (de gouttes).
   REMARQUE: Une goutte d'un diamètre de 0,1 mm donne un volume d'injection de l'ordre de 500 pl (volume de goutte = 4/3 π x rayon x ^3).

3. Préparation de fécondés embryons de poissons zèbres et injection avec Morpholinos

1. Mettre en place Tg (wt1b: GFP) couples reproducteurs de poisson zèbre transgénique selon des protocoles publiés pour l'élevage du poisson zèbre standard et l'entretien. Recueillir des embryons après spawn naturel, et de les garder dans une boîte de Pétri 10 cm rempli d'eau E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM de _CaCl2, 0,33 mM MgSO _4). Lancer injection MO immédiatement ^13. Surveiller embryon morphologie sous le microscope et faire l'injection MO sûr, ce est à la de unstade de la cellule, ou au plus tard au stade de quatre cellules.
   1. Transfert des embryons dans une boîte de Pétri de 10 cm avec de la gélose en forme de coin creux. Aspirer l'eau E3 supplémentaire et appuyez doucement sur les embryons dans les creux.
   2. Manipuler les embryons avec la micropipette pour visualiser embryons au stade 1 cellule sous le microscope de dissection. Pénétrer le chorion puis le jaune d'injecter une ou deux gouttes de MO dans le jaune (1 goutte = 500 pl). Transférer les embryons injectés à une boîte de Pétri de 10 cm avec de l'eau E3 et incuber à 28,5 ° C.
2. Après les injections, retirer les embryons morts et d'enregistrer le nombre d'embryons injectés. Remplacer l'eau E3 dans le plat tous les 24 à 48 heures.

4. Les expériences phénotype sauvetage

1. Sélectionnez un orthologue d'une autre espèce qui a une structure différente (habituellement 3-7 paires de bases de l'inadéquation) de paires de base primaire et est donc résistant à la MO, pour le sauvetage. Par exemple, dans cette expérience, nous avons choisisouris parce que la séquence d'ARNm de souris Wnt5a est différente de la séquence de poisson zèbre.
2. Conception d'un jeu d'amorces avec l'amorce sens à partir de l'emplacement de translation et l'amorce inverse à proximité de l'extrémité de la région codante de l'ARNm. Ajouter une séquence de promoteur de T7 à l'extrémité 5 'de la séquence de l'amorce sens. Dans cette expérience, nous avons utilisé les séquences d'amorces suivantes; avant: 5'-taa tac GAC TCA GGA tag CTA CTA tga tgc tgc TGA TGA AGC a- 3 'et inverser: 5'TCA ctt gca GAC gta CTG gtc- 3'.
3. Effectuer une réaction en chaîne par polymerase de 50 pi (PCR) avec le jeu d'amorces (0,5 uM de chaque amorce) conçu ci-dessus et 0,1 ug d'ADN matrice contenant la souris séquence Wnt5a ADNc avec le programme de PCR suivant: 1 cycle à 95 ° C pendant 5 min; 35 cycles de 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 min); et l'étape d'extension finale à 72 ° C pendant 7 min.
4. A la fin de til vélo, de courir 2 pl du produit de PCR sur un gel d'agarose à 1% pour se assurer que la bande est la bonne taille. Purifier le produit de la PCR avec un kit de purification PCR selon les instructions du fabricant. Vérifier la concentration de l'ADN avec un spectrophotomètre. Stocker le produit PCR purifié à -20 ° C ou utiliser directement dans plafonné transcription de l'ARN dans l'étape suivante.
5. La synthèse in vitro d'ARNm coiffés avec un kit de synthèse d'ARN coiffée selon les instructions du fabricant. Diluer l'ARNm dans 20 ul d'eau libre de RNase et déterminer la concentration. Aliquoter l'ARN et conserver à -80 ° C.
6. Le jour de l'injection, préparer une solution de travail de l'ARNm par la RNase de l'eau stérile libre. Notez que 40 pg dose est généralement de l'ARN de la plus élevée à laquelle des effets non spécifiques ou toxiques de l'ARN ne se produisent pas. Gardez la solution de travail sur la glace. Injecter l'embryon avec MO et l'ARNm de sauvetage, ou co-injecter les deux ensemble. Par exemple, si la concentration de l'ARNm de prépared à l'étape 4.5 est de 0,6 ug / ul, ajouter 0,67 ul d'ARNm (0,4 ug) à 4,33 pi de RNase eau libre pour obtenir une concentration finale de 0,08 ug / ul, puis une goutte (500 pl) de chaque injection contient 40 pg de l'ARNm. Préparer MO comme décrit à l'étape 3.

5. Préparation des embryons injectés pour l'imagerie de fluorescence

1. Après incubation à 28,5 ° CO / N, ajouter 0,003% de N-phénylthiourée (PTU) à l'eau pour empêcher la mélanisation E3, ce qui affecte l'observation de la structure de pronéphros en utilisant la microscopie de fluorescence. Cependant, ne ajoutez pas PTU avant gastrulation, car elle affecte le développement embryonnaire précoce.
2. Au 48 HPF, dechorionate manuellement les embryons avec des pincettes fines. Prenez des photos de 48 et 72 embryons hpf sous un dissection microscope optique.
   NOTE: Ces photos peuvent être prises sans anesthésie.
3. Environ 10 minutes avant l'imagerie au microscope à fluorescence, anesthésier les embryons en les plaçant dansune boîte de Pétri de 10 cm contenant 160 ug / ml tamponnée tricaïne. Attendre 5 à 10 min, puis appuyez légèrement sur le poisson zèbre pour confirmer qu'ils ne se déplacent pas et donc l'anesthésie travaille.
4. Après les embryons sont anesthésiés, montez-les dans 3% de méthylcellulose et de les orienter dans une position couchée sous un microscope de dissection (se il vous plaît voir le tableau 1).
5. Observer la structure de pronéphros sous un microscope à fluorescence (se il vous plaît se référer au tableau 1) et prendre des photos à différents grossissements (10x et 20x).

Résultats

Wnt5a abattre a été réalisé par l'introduction traduction bloquant MO (AUG-MO) ou de l'exon / intron jonction des frontières MO (épissage MO) pour embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule. L'AUG-MO cible le codon d'initiation et, par conséquent, inhibe à la fois un message de Wnt5a maternelle et zygotique. L'épissure-MO vise le troisième site donneur d'épissage et inhibe seulement la transcription zygotique de Wnt5a (figure 1A). Le août-...

Discussion

Polykystose rénale (PKD) est l'une des principales causes de maladie rénale terminale chez l'homme et est caractérisée par la formation progressive d'un kyste, l'élargissement rénale, et le développement des tubules anormale ^14. PKD autosomique dominante (ADPKD) est une maladie génétique dans laquelle une ou l'autre mutation de PKD1, codant pour la polycystine-1 (PC1) ou PKD2, codant pour la polycystine-2 (PC2), les résultats dans les reins polykystiques. Beaucoup d'autres g?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
NanoDrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D. 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop