JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Abstract

מדעי מוח ניסיוניים עדים עניין מוגבר בפיתוח והיישום של רומן ופרוטוקולים לעתים קרובות מורכבים, לולאה סגורה, שבו הגירוי מיושם תלוי בזמן אמת על התגובה של המערכת. היישומים אחרונים נעים בין יישום מערכות מציאות מדומה ללימוד תגובות מנוע הן בעכברי 1 ובדג הזברה 2, לשלוט בהתקפים הבאים שבץ קליפת המוח באמצעות optogenetics 3. יתרון עיקרי של טכניקות לולאה סגורה מתגורר ביכולת של חיטוט תכונות ממדיות גבוהות יותר שאינן נגישים באופן ישיר או שתלויות במשתנים רבים, כגון רגישות עצבית 4 ואמינות, ואילו באותו הזמן למקסם את התפוקה הניסיונית. בתרומה זו ובהקשר של אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית, אנו מתארים כיצד ליישם מגוון רחב של פרוטוקולי לולאה סגורה לחקר מאפייני התגובה של תאי עצב בקליפת המוח, rec פירמידהorded intracellularly עם טכניקת מהדק תיקון בפרוסות מוח חריפות מהקליפה החושית של חולדות צעירות. כמו שאף תוכנת קוד זמינה מסחרי או פתוחה מספקת את כל התכונות הנדרשות ליעילות ביצוע הניסויים שתוארו כאן, ארגז כלים תוכנה חדש בשם LCG 5 פותחו, שמודולרי מבנה למקסימום שימוש חוזר של קוד מחשב ומאפשר היישום של פרדיגמות ניסוי רומן. גל גירוי מצוין באמצעות מטא-תיאור קומפקטי ופרוטוקולי ניסוי מלאים מתוארים בקבצי תצורה מבוסס טקסט. בנוסף, יש LCG ממשק שורת הפקודה שמתאים לחזרה של ניסויים ואוטומציה של פרוטוקולי ניסוי.

Introduction

בשנים האחרונות, אלקטרופיזיולוגיה הסלולרית התפתחה מהפרדיגמה הלולאה הפתוחה המסורתית מועסקות בניסויי מתח ומהדק הנוכחי לפרוטוקולים לולאה סגורה מודרניים. טכניקת הלולאה סגורה הידועה ביותר היא אולי המהדק הדינמי 6,7, שאיפשר ההזרקה סינתטית של תעלות יונים מתח מגודרת מלאכותיות כדי לקבוע את מתח הקרום העצבי 8, הלימוד המעמיק של תופעות של אי-דטרמיניסטי מהבהבים ב תעלות יונים על דינמיקת תגובה עצבית 9, כמו גם הבילוי במבחנה של מציאותי בvivo- כמו פעילות רקע הסינפטית 10.

פרדיגמות לולאה סגורה אחרות שהוצעו כוללות את המהדק תגובתי 11, ללמוד במבחנה הדור של פעילות מתמשכת עצמית מתמשך, והתגובה לצבוט 4,12, כדי לחקור את המנגנונים התאיים רגישות עצבית בסיסית.

ontent "> כאן אנו מתארים מסגרת רבת עוצמה המאפשרת יישום מגוון רחב של פרוטוקולי אלקטרו לולאה סגורה בהקשר של הקלטות מהדק תיקון כל התא מתבצעות בפרוסות מוח חריפות. אנו מראים כיצד להקליט מתח קרום גופני באמצעות הקלטות מהדק התיקון בתאי עצב פירמידה מהקליפה החושית של חולדות צעירות וליישם שלושה פרוטוקולי לולאה סגורה שונים באמצעות LCG, ארגז כלים תוכנה מבוססת שורת פקודה שפותחו במעבדה לנוירוביולוגיה התיאורטית וNeuroengineering.

בקצרה, הפרוטוקולים המתוארים הם, ראשון ההזרקה האוטומטית של סדרה של צורות גל גירוי המהדק הנוכחיים, רלוונטיים לאפיון של קבוצה גדולה של תכונות קרום אקטיביות ופסיביות. אלה הציעו ללכוד את הפנוטיפ אלקטרו של תא במונחים של הנכסים את תגובתה לסדרה סטריאוטיפית של צורות גל גירוי. ידוע כדואר הקוד של תא (לדוגמא, ראה & #160; 13,14), אוסף כזה של תגובות חשמליות משמש על ידי מספר מעבדות לסווג אובייקטיבי נוירונים על בסיס התכונות החשמלית שלהם. זה כולל ניתוח של יחסי העברת קלט-פלט הנייח (עקומת Fi), על ידי טכניקה חדשנית המערב את הלולאה הסגורה, השליטה בזמן אמת של קצב הירי באמצעות בקר פרופורציונאלי נפרד נגזרים (PID) , שני הבילוי של in vivo דמוי פעילות הסינפטית רקע מציאותי בהכנות במבחנה 10 ו, החיבור המלאכותי שלישי בזמן אמת של שני נוירונים פירמידה נרשמו בו זמנית באמצעות interneuron GABAergic וירטואלי, אשר הוא מדומה על ידי המחשב.

בנוסף, LCG מיישם את הטכניקה המכונית אלקטרודה פעילה פיצויים (AEC) 15, המאפשר יישום פרוטוקולי מהדק דינמיים באמצעות אלקטרודה אחת. זה מאפשר פיצוי השפעות לא רצויות (rtifacts) של האלקטרודה ההקלטה שמתעוררות כאשר הוא משמש להעברת גירויים תאיים. השיטה מבוססת על הערכה שאינה פרמטרית של התכונות חשמליות שווי ערך של מעגל ההקלטה.

הטכניקות ופרוטוקולי ניסוי מתוארים במאמר זה יכולים להיות מיושמים בקלות במתח לולאה הפתוחה קונבנציונלי וניסויים מהדק הנוכחיים וניתן להרחיב את תכשירים אחרים, כגון 4,16 תאיים או הקלטות תאיות in vivo 17,18. ההרכבה זהירה של ההתקנה לאלקטרופיזיולוגיה מהדק תא כל תיקון היא צעד חשוב מאוד להקלטות באיכות יציבה, גבוהות. בחלק הבא תניח שהגדרה כזו ניסיונית כבר זמינה לנסיין, ולמקד את תשומת הלב שלנו על המתאר את השימוש של LCG. הקורא הצביע על 19-22 לטיפים נוספים על אופטימיזציה וניפוי שגיאות.

Protocol

הפרוטוקול המתואר כאן תואם את ההמלצות וההנחיות של ועדת האתיקה של המחלקה למדעים ביו-רפואיים מאוניברסיטת אנטוורפן. פרוטוקול זה דורש ההכנה של חומר שאינו חיים מהמוח של חולדות explanted Wistar לנוער, שהושג על ידי טכניקות המתת חסד הומניות אושרו.

1. הכנת ציוד

  1. התקנה והגדרה של מערכת גירוי רכישת נתונים ו.
    1. להשתמש במחשב אישי (PC) מצויד ברכישת נתונים כרטיס (DAQ) הנתמכים על ידי Comedi להקליט אותות ולשלוח מתחי שליטה אנלוגיים למגבר אלקטרו.
      הערה: Comedi הוא מודול לינוקס וספרייה התומך במספר רב של כרטיסי DAQ מהיצרנים הנפוצים ביותר: לבקר http://www.comedi.org לקבלת מידע נוסף.
    2. במקרה מגבר מהדק תיקון מבוקר מחשב נמצא בשימוש, להעסיק מחשב שני מלבד אחד מוקדש למגברשליטה.
      הערה: בעוד זה האחרון עשוי להפעיל מערכת הפעלה קונבנציונלית, המחשב הנוסף יהיה הפועל בזמן אמת באמצעות מערכת הפעלה מיוחדת. בתנאים אלה, זה נוח להשתמש בצג, עכבר ומקלדת יחיד שצורפה למחשב הנוסף, תוך חיבור על ידי יישום שולחן עבודה מרוחק למחשב הייעודי.
    3. הורד את תמונת ISO של התקליטור חי המכיל מערכת הפעלה בזמן אמת לינוקס עם LCG מותקן מראש מhttp://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso ולצרוב אותו על תקליטור או USB מקל "ריק .
    4. פשוט הכנס את התקליטור לכונן של המחשב המכיל את כרטיס DAQ ולהפעיל אותו. לחלופין, להתקין LCG ממאגר המקור המקוון שלה על מחשב שמריץ את מערכת הפעלת לינוקס (למשל, דביאן או אובונטו). עיין במדריך המקוון לקבלת פרטים על הליך ההתקנה. המדריך לזמין באופן מקוון http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
    5. אתחול מהתקליטור החי: תישל יטען אוטומטית מערכת מוגדרת באופן מלא. כדי לעשות זאת, הנח את LCG Live CD בכונן התקליטורים המחשב ולאתחל את המחשב מתקליטור; בחר את הליבה בזמן אמת (ברירת מחדל) ברגע שמופיע תפריט האתחול ולחכות למערכת כדי לאתחל.
    6. כייל את כרטיס DAQ על ידי הקלדה בשורת הפקודה:
      sudo comedi_calibrate
      או
      sudo comedi_soft_calibrate
      תלוי אם לוח נתוני הרכישה תומך בחומרה או בתוכנת כיול, בהתאמה (להשתמש comedi_board_info sudo הפקודה כדי לקבל מידע על הלוח).
    7. הגדר את אנלוגית לדיגיטלי המתאימה ודיגיטלי לאנלוגיים גורמי גיור: זה מחייב גישה שיש למדריך של מגבר אלקטרו הסלולרי, ובמיוחד למפרט שלו בגורמי ההמרה שלה.
    8. השתמש בעורך טקסט כדי לציין את הערכים המספריים המתאימים ב/home/user/.lcg-env הקובץ, למשתני סביבת AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
      הערה: אלה מייצגים את הקלט (AI) ופלט רווחים (AO) למהדק נוכחי (CC) ומהדק מתח מצבים (VC), ומקדמי המרה בין פקודות מתח המסופקות על-ידי המחשב והנוכחי או מתח שנוצר על ידי המגבר , בהתאמה.
    9. לחלופין, השתמש בתסריט LCG סיפק (LCG למצוא המרה-גורמים-), כדי למצוא את מקדמי ההמרה של המערכת שלו או שלה.
      הערה: הערכים מחושבים על ידי LCG-מוצא-המרה-גורמים ניחושים, שבמקרים מסוימים נדרשים להיות מספרי קטועים או מעוגל כדי לשקף את הערכים של מקדמי ההמרה המדויקים.
    10. כדי להשתמש בLCG-מוצא-המרה-גורמים, להתחיל על ידי חיבור של תא המודל "שלעתים קרובות נרכש עם המגבר לheadstage המקבילה. לאחר מכן, פתח מסוף על מכונת לינוקס שבו אתה מפעיל את התקליטור חי והזן את הפקודה הבאה במעטפת הפקודה:
      LCG-מוצא-המרה-גורמי $ HOME / .lcg-env $ HOME / -o .lcg-env -i
      הערה: בשני המקרים (כלומר, שינוי הידני של /home/user/.lcg-env או שימוש בLCG-מוצאים-המרה-גורמים), קרוב ולפתוח את המסוף לשינויים ייכנסו לתוקף.
    11. אם headstages מרובה משמש, להגדיר את מקדמי ההמרה לאותם ערכים בכל הערוצים; אם זה לא אפשרי, עיין במדריך המקוון LCG להבין כיצד להשתמש במקדמי המרה מרובות בLCG-גירוי או כיצד לייצר קבצי תצורה שיתאימו יותר לצרכי המשתמש.

2. הכנת פרוסות המוח חריפה מהקליפה החושית

  1. הכנה של פתרונות לאלקטרופיזיולוגיה.
    1. הכן נוזל המלאכותי Cerebro-השדרה (ACSF) על ידי ערבוב (מ"מ) 125 NaCl, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 3 NaHCO, 25 גלוקוז, 2 CaCl 2, ו- 1 MgCl 2. הכן 10x פתרונות מניות כדי להפחית אתזמן הכנה ביום של הניסוי. הכן 2 L, אשר אחד מהם ישמש להכנת פרוסות והאחרת להקלטה.
    2. להרוות את ACSF עם 95% O 2, 5% CO 2 לפחות 30 דקות לפני תחילת ההליך.
    3. עבור הקלטות מהדק הנוכחיות, להשתמש פתרון תאיים (ICS) המכיל (במ"מ) 115 K-גלוקונאט, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. הכן את הפתרון בקרח ולסנן אותו לפני תחילת ההקלטות לחסל את הסיכון לסתימת פיפטה.
  2. חילוץ מוח.
    1. להרדים את החיה הצבת בעלי החיים בתא אינדוקציה עם 4% Isoflurane ומהירות לערוף אותו באמצעות הגיליוטינה או מספריים גדולים.
    2. חותך את העור לאורך קו האמצע והחלק אותו לאוזניים.
    3. בעזרת זוג נאה של מספריים לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע. שמור את הלהב קרוב ככל האפשר לthמשטח דואר כדי למזער את הנזק למוח הבסיסי. פתח את הגולגולת עם פינצטה, להשתמש במרית כדי לנתק את עצב הראייה וגזע המוח ובעדינות שחרר את המוח בACSF קר כקרח.
    4. הפרד את המוח הקטן ושתי ההמיספרות עם אזמל (להב 24).
    5. להסיר את עודפי מים מאחת משתי ההמיספרות ולהדביק אותו על פלטפורמה נוטה באמצעות טיפה של דבק מגע. במהירות להוסיף כמה טיפות של ACSF על המוח ולהעביר אותו לתא vibratome.
      הערה: בעת הכנת פרוסות sagittal, את הזווית של הפלטפורמה חשובה כדי למנוע נזק לדנדריטים של תאי פירמידה במהלך הליך החיתוך.
  3. הכנת פרוסות.
    1. מקם את הלהב על המוח וזורקי 2.5 ראשון - 3 מ"מ. התאם את המהירות ותדירות להגביל נזק למשטח של הפרוסה ואילו באותו הזמן למזער את הזמן הנדרש להליך החיתוך.
    2. הגדר את העובי 300 μמ 'ולהתחיל חיתוך. ברגע שהלהב נעלם עבר הקליפה, להשתמש בסכין גילוח או מחט כפופה לחתוך מעל היפוקמפוס ובקצוות של אזור קליפת המוח של עניין.
    3. מניחים את הפרוסות בתא דגירה רב גם המשיכו ב32-34 מעלות צלזיוס.
    4. לחזור הלהב ולחזור נקודות 2.3.2 ו2.3.3 עד 5-8 פרוסות לחתוך. פרוסות הטובות ביותר הן בדרך כלל אלה שבם כלי הדם מקבילים למשטח.
    5. דגירה את הפרוסות למשך 30 דקות לאחר הפרוסה האחרונה ממוקמת בתא.

3. הקלטות תיקון מהדק מהשכבה 5 עצב פירמידליים

  1. מניחים פרוסה בחדר ההקלטה ולחפש את תאים בריאים. בדרך כלל יש לי תאים אלה ניגוד נמוך, מראה חלק ואינם נפוחים.
  2. בדוק את הפרוסה מתחת למיקרוסקופ עם עדשת הגדלה 40X ולחפש את תאים בשכבה 5, ממוקם כ -600 עד 1,000 מיקרומטר מפני שטח של המוח.
  3. ברגע שתא מתאים נמצא, שלישי של micropipette עם ICS עומס אחד ולמקם אותו בheadstage.
  4. במחשב האישי פועל במערכת ההפעלה לינוקס מוגדרת מראש CD או החי, להשיק שורת פקודה (לדוגמא, bash) וLCG-אפס בסוג הפקודה שלו בפקודה. זה מבטיח שלוח DAQ לא נוהג המגבר.
  5. החל 30-50 mbar של לחץ חיובי על ידי לחיצה על הבוכנה של מזרק משותף, שמחובר בצינור לבעל פיפטה ו, בעזרת מיקרוסקופ, למקם את פיפטה כ 100 מיקרומטר מעל הפרוסה.
    הערה: הנח את פיפטה בעמדה המאפשרת מסלול ישיר לתא המטרה, רצוי באמצעות מצב הגישה של micromanipulator.
  6. פועל על פקדי מגבר אלקטרופיזיולוגיה, להתאים את פיפטה לקזז ופלט דופק בדיקה (10 mV) במצב מהדק מתח.
  7. להפחית את הלחץ ל10-30 mbar (תלוי בגודל פיפטה) על ידי הנסיגהבוכנה של המזרק; בעדינות להתקרב התא ולבדוק ליצירת גומה על ידי התבוננות בתמונה על מסך מצלמת וידאו. צג דופק המבחן לעלייה בהתנגדות בכל העת, על ידי צפייה בצורת הגל הנוכחית מוצג על אוסצילוסקופ מחובר למגבר אלקטרופיזיולוגיה (לחלופין אתה יכול להשתמש בLCG-חותם מבחן הפקודה כדי לפקח על התנגדות פיפטה).
  8. לשחרר את הלחץ ובמידת צורך להפעיל לחץ שלילי עדין לפיפטה כדי לעזור היווצרות חותם כאשר אתה שם לב לעלייה בהתנגדות פיפטה והיווצרות של 'גומה' בתא.
  9. בעוד צורות החותם, להקטין בהדרגה את הפוטנציאל מחזיק ל-70 mV.
  10. ברגע שחותם gigaohm הושג, להבטיח כי ההחזקה הנוכחית הוא בין 0-30 הרשות הפלסטינית. החל פולסים קצרים של לחץ שלילי (יניקה) כדי לשבור את הקרום ולהקים את תצורת כל התא. לחלופין, ניתן להזריק פולסים חזקים וקצרים של מתח ( כלומר, באמצעות הפקודה' ZAP "על המגבר או מחזיק בתא שלילי מאוד) לקרע הקרום, בהתאם לפיפטה ההכנה והזכוכית בשימוש.
  11. עבור למצב נוכחי מהדק ולוודא שפוטנציאל הממברנה מנוחה אופייני לתאים בריאים. לתאי עצב בקליפת המוח פירמידה באמצעות פתרון מבוסס אשלגן גלוקונאט, ערך זה הוא בדרך כלל בין -65 ו-75 mV.

4. אפיון חצי אוטומטי של מאפייני התגובה חשמליים של תא עצב

  1. ליצור ספרייה לאחסון נתונים של המשתמש. כדי לעשות את זה להעסיק תסריט כלול בLCG Live CD שיוצר תיקיות המבוססות על התאריך. כדי להשתמש בו, סוג בשורת הפקודה
    cd ~ / ניסויים
    LCG-ליצור-ניסוי-תיקיית -s PSP, in_vivo_like
    הפעולה זו תיצור תיקייה שבה נתונים לתא שיישמרו (ו'PSP 'ו' in_vivo_like 'תיקיות משנה) וזה יהיה להדפיס את שמה למסוףחלון; אפשר גם לאחסן מידע נוסף, כגון התנגדות פיפטה וסוג התא באמצעות תסריט זה.
  2. מדריך שינוי לתיקייה החדשה שנוצרה באמצעות הפקודה
    cd ~ / <שם התיקייה>
    שם התיקייה הוא אחד המוצג על ידי LCG-ליצור-ניסוי-תיקייה ולא תהיה לי חותמת של היום הנוכחי (כלומר, שנה-חודש-היום) הפקודה, כמו ב20140331A01.
  3. ודא שהמגבר מוגדר לפעול במצב נוכחי מהדק, שהכבלים מחוברים ואת פקודת המתח החיצונית של המגבר, אם קיימים, מופעלת.
  4. הזן את LCG-ecodeat פקודת שורת הפקודה. זה קורא סדרה של פקודות (כלומר LCG-AP, LCG-VI, LCG-רמפה, LCG-טאו וLCG-שלבים), המשמשת לאפיון תכונות תגובה בסיסיות של התא. LCG-ecode דורש שהמשתמש לציין שני פרמטרים: המשרעת של הדופק 1 MS-הארוך של נוכחי משמש כדי לעורר ספייק יחיד בתא, ואת המשרעת המרבית של האיל הנוכחיעמ 'מוזרק לתוך התא למצוא rheobase.
    השתמש בתחביר הפקודה הבא:
    Y X --ramp-משרעת-משרעת --pulse LCG-ecode
    עם מבחר של X ו- Y הערכים (ברשות) שיש בם כדי להפוך את תא האש בתגובה לדופק 1 MS-ארוך ומתמשכת של הזרקה נוכחית, בהתאמה.
    הערה: פרוטוקולים אלה דורשים ביצוע האומדן המספרי של "ליבת אלקטרודה 'כדי להשתמש באלקטרודה הפיצויים הפעילים (AEC) 15. הזרקה נוכחית רועשת משמשת להעריך את הליבה והמשתמש מתבקש לאשר את מספר הדגימות שמרכיבות את הליבה. ראה 15 למידע מפורט על המשמעות של הקרנל אלקטרודה ואיך לבחור את מספר דגימות ליבה.

5. הזרקה של מוליכות דרך סינפסות סימולציה וסימולציה של in vivo דמוי פעילות רקע

  1. הזרקה של פוטנציאלי פוסט-סינפטי מעוררים מדומים
    1. לשנות את הספרייה שבה תוכל לחסוך הניסוי הבא, על ידי הקלדת הפקודה הבאה בשורת הפקודה של המעטפת:
      PSP cd / 01
    2. העתק קובץ תצורת LCG לספרייה הנוכחית ולפתוח אותו עם עורך טקסט (Nano בדוגמא זו) על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת (קובץ תצורת דוגמא זו כלול בקוד המקור והתקליטור החי) :
      cp ~ / מקומי / src / LCG / תצורות / epsp.xml
      epsp.xml ננו
      הערה: זה פשוט קובץ טקסט עם גורמים שונים הקשורים זה לזה. לפרטים נוספים, ראה סעיף נציגי תוצאות.
    3. אם לערוך צורך inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor וoutputConversionFactor בקובץ זה כדי להתאים את תוכנית ההתקנה של המשתמש.
    4. לחשב את ליבת אלקטרודה הדרושה כדי לבצע את פיצוי אלקטרודה הפעיל 'השיטה בשימוש על ידי LCG לבצע מהדק דינמי אלקטרודה אחת' על ידי הנפקת comמאנד
      LCG-ליבה
      זו תנחה את מספר הנקודות בליבה. שוב, בחר מספר כדי שהליבה אלקטרודה מכסה את הקצה של זנב הדעיכה מעריכית.
    5. בצע את ניסוי המהדק הדינמי באמצעות הפקודה
      LCG-להתנסות epsp.xml -c
    6. רשימת הקבצים ולדמיין את התוצאות על ידי שימוש בפקודה
      ls -l
      LCG-עלילה-קובץ -f האחרון
  2. הזרקה של פוטנציאלי פוסט-סינפטי המעכבים מדומים
    1. צור תיקייה ולהעתיק את קובץ epsp.xml לה על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      mkdir ../02
      cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
      CD ../02
    2. ערוך את קובץ התצורה באמצעות עורך טקסט: לשנות את פוטנציאל ההיפוך הסינפטי ולעלות וזמן דעיכה קבוע של Exp2Synapse סינפסה המודל לפעולות הבאות:
      פרמטרים>
      -80
      0.8e-3
      <לאauDecay> 10E-3
      <פרמטרים>
      צא מעורך הטקסט.
    3. לחשב את ליבת אלקטרודה ולבצע את הניסוי כב 5.1, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      LCG-ליבה
      LCG-להתנסות ipsp.xml -c
    4. רשימת הקבצים ולדמיין את התוצאות, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      ls -l
      -f LCG-עלילה-קובץ
  3. סימולציה של in vivo דמוי פעילות רקע:
    1. לשנות את הספרייה שבה ברצונך לשמור את הניסוי הבא, כפי שהוצג קודם, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      CD ../../in_vivo_like/01
    2. העתק את קובץ התצורה מספריית מקור LCG, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      cp ~ / מקומי / src / LCG / תצורות / in_vivo_like.xml
      in_vivo_like.xml ננו
      הערה: קובץ זה פשוט השרשור של הקודמים; שני תהליכי פואסון נקודות שיוצרים רכבות ספייק, אשר בתורו להאכיל סינפסות מודל מעכבת ומעוררת, ליצור פעילות הרקע.
    3. להתאים את הפרמטרים תצורת DAQ להתקנה של המשתמש, כפי שמתואר ב5.1.3 וצא מהעורך.
    4. לחשב את ליבת אלקטרודה ולבצע את הניסוי כב 5.1, על ידי הקלדת הפקודות הבאות בשורת הפקודה של המעטפת:
      LCG-ליבה
      LCG-להתנסות in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3
      המתגים '10 -n' ו '-i 3' מצביעים על כך שהגירוי יש לחזור 10 פעמים במרווחים של שלוש שניות.
    5. דמיינו את עקבות גלם באמצעות הפקודה הבאה בשורת הפקודה של המעטפת:
      LCG-עלילה-קובץ -f כל

תוצאות

בסעיפים הקודמים, שתארנו כיצד להשתמש בארגז הכלים LCG תוכנה כדי לאפיין את תכונות אלקטרו של תאי פירמידה L5 ולשחזר in vivo דמוי פעילות הסינפטית בהכנת פרוסה. השימוש בממשק שורת הפקודה ופרוטוקול חצי אוטומטי להעדיף את שחזור ויעילות של הניסוי, אשר יכולה להיות השפעה גדולה על ה?...

Discussion

בטקסט זה פרוטוקול מלא ליישום בזמן אמת, ניסויי אלקטרו תא בודד לולאה סגורה תוארו, באמצעות טכניקת מהדק תיקון וארגז כלים תוכנה שפותח לאחרונה בשם LCG. כדי לייעל את האיכות של הקלטות זה קריטי, כי הגדרת ההקלטה להיות מוארקת כהלכה, מוגן ורטט חופשי: זה מבטיח גישה כל התא יציבה וברה-?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue slicerLeicaVT-1000S
Pipette pullerSutterP-97
PipettesWPI1B150F-41.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation tableTMC20 Series
MicroscopeLeicaDMLFS40X Immersion Objective
ManipulatorsScientificaPatchStar
AmplifiersAxon InstrumentsMultiClamp 700BComputer controlled
Data acquisition cardNational InstrumentsPCI-6229Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computerDellOptiplex 7010 TowerOS: real-time Linux
OscilloscopesTektronixTDS-1002
Perfusion PumpGibsonMINIPULS3Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controllerMultichannel SystemsTC02PH01 Perfusion Cannula
ManometerTesto510Optional
IncubatorMemmertWB14
NaClSigma71376ACSF
KClSigmaP9541ACSF, ICS
NaH2PO4SigmaS3139ACSF
NaHCO3SigmaS6014ACSF
CaCl2SigmaC1016ACSF
MgCl2SigmaM8266ACSF
GlucoseSigmaG7528ACSF
K-GluconateSigmaG4500ICS
HEPESSigmaH3375ICS
Mg-ATPSigmaA9187ICS
Na2-GTPSigma51120ICS
Na2-PhosphocreatineSigmaP7936ICS

References

  1. Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
  2. Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
  4. Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
  5. Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
  6. Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
  7. Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  8. Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
  9. White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
  10. Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
  11. Fellous, J. -. M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
  12. Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
  13. Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
  14. Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
  15. Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
  16. Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
  17. Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
  18. Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
  19. Sakmann, B., Neher, E. . Single-channel recording. , (1995).
  20. Molleman, A. . Patch Clamping. , (2002).
  21. Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
  22. Gold, R. . The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
  23. Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
  24. Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
  25. Koch, C., Segev, I. . Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).
  26. Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
  27. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
  28. Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
  29. Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience100

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved