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Resumo

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Resumo

Neuroscience experimental está a assistir um interesse crescente no desenvolvimento e aplicação de protocolos de novos e muitas vezes complexas, em circuito fechado, onde o estímulo aplicado depende em tempo real sobre a resposta do sistema. Aplicações recentes vão desde a implementação de sistemas de realidade virtual para o estudo de respostas motoras, tanto em camundongos e em um peixe-zebra 2, para controlar de convulsões seguintes acidente vascular cerebral cortical usando a optogenética 3. Uma das principais vantagens das técnicas de circuito fechado reside na capacidade de sondagem propriedades dimensionais mais altos que não estão directamente acessíveis ou que dependem de várias variáveis, tais como a excitabilidade neuronal 4 e fiabilidade, ao mesmo tempo maximizar a taxa de transferência experimental. Neste contribuição e no contexto de electrofisiologia celular, que descrevem como a aplicação de uma variedade de protocolos de circuito fechado para o estudo das propriedades de resposta de neurónios piramidais corticais, recorded intracelularmente com a técnica de patch clamp em fatias cerebrais agudas do córtex somatossensorial de ratos jovens. Como nenhum software de código aberto disponíveis comercialmente ou fornece todos os recursos necessários para desempenhar eficazmente as experiências descritas aqui, uma nova caixa de ferramentas de software chamado LCG 5 foi desenvolvido, cuja estrutura modular maximiza a reutilização de código de computador e facilita a implementação de novos paradigmas experimentais. Formas de onda de estimulação são especificados usando uma meta-descrição compacta e protocolos experimentais completos estão descritos nos arquivos de configuração baseados em texto. Além disso, LCG tem uma interface de linha de comando que é adequado para a repetição de ensaios e automação de protocolos experimentais.

Introdução

Nos últimos anos, electrofisiologia celular evoluiu a partir do paradigma de ciclo aberto tradicional utilizado em experiências de tensão e de corrente de fixação com os protocolos de circuito fechado modernos. A técnica de circuito fechado mais conhecido é talvez o grampo dinâmico 6,7, o que permitiu a injecção sintética de canais artificiais dependentes da voltagem de íons para determinar a voltagem da membrana neuronal 8, o estudo em profundidade dos efeitos da não-determinístico piscando em canais iônicos sobre a dinâmica de resposta neuronal 9, bem como a recriação in vitro de realista em vivo- como atividade fundo sináptica 10.

Outros paradigmas de circuito fechado que foram propostas incluem o grampo reactivo 11, para estudar in vitro a geração de actividade persistente auto-sustentado, e a resposta braçadeira 4,12, para investigar os mecanismos celulares excitabilidade neuronal subjacente.

ontent "> Descrevemos aqui um quadro poderosa que permite a aplicação de uma variedade de protocolos electrofisiológicas de circuito fechado no contexto de gravações de células inteiras patch clamp realizados em fatias cerebrais agudas. Mostramos como gravar tensão somática membrana por meio de gravações de patch clamp em neurônios piramidais do córtex somatossensorial de ratos jovens e aplicar três protocolos de circuito fechado diferentes usando LCG, uma caixa de ferramentas de software baseado em linha de comando desenvolvido no laboratório de Neurobiologia e teórico Neuroengineering.

Resumidamente, os protocolos descritos são, em primeiro lugar a injecção automática de uma série de formas de onda de corrente de fixação de estímulo, relevantes para a caracterização de um grande conjunto de propriedades da membrana activas e passivas. Estes têm sido sugeridos para capturar o fenótipo electrofisiológico de uma célula em termos das suas propriedades de resposta a uma série de formas de onda de estímulo estereotipado. Conhecido como o e-code de uma célula (por exemplo, ver & #160; 13,14), como um conjunto de respostas eléctricas é utilizado por vários laboratórios para classificar objectivamente neurónios na base das suas propriedades eléctricas. Isto inclui a análise da relação de transferência de entrada-saída estacionária (curva FI), por uma técnica inovadora que envolve o circuito fechado, o controlo em tempo real da taxa de disparo por meio de um regulador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo a recriação da in vivo -como fundo atividade sináptica realista em preparações in vitro 10 e, em terceiro lugar a conexão artificial em tempo real de dois neurônios piramidais gravados simultaneamente por meio de um interneurônio GABAergic virtual, que é simulada pelo computador.

Além disso, LCG implementa a técnica conhecida como Ativo Eletrodo Compensação (AEC) 15, que permite a implementação de protocolos de fixação dinâmicos usando um único eletrodo. Isto permite compensar os efeitos indesejáveis ​​(umrtifacts) do eléctrodo de registo que surgem quando é utilizado para a entrega de estímulos intracelulares. O método baseia-se numa estimativa não-paramétrico de as propriedades equivalentes eléctricos do circuito de gravação.

As técnicas e protocolos experimentais descritos no presente documento podem ser facilmente aplicadas na tensão de circuito aberto convencional e experiências de fixação de corrente e pode ser alargado a outras preparações, tais como extracelular 4,16 ou gravações intracelulares, in vivo 17,18. A montagem cuidadosa da configuração para fixação de membranas de células inteiras eletrofisiologia é um passo muito importante para, gravações de alta qualidade estáveis. A seguir vamos supor que uma configuração tal experimental já está disponível para o experimentador, e concentrar a nossa atenção na descrição do uso de LCG. O leitor é apontado 19-22 por mais dicas sobre otimização e depuração.

Protocolo

O protocolo aqui descrito está em conformidade com as recomendações e orientações do Comitê do Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade de Antuérpia Ética. Este protocolo requer a preparação de um material não-sensível a partir do cérebro de ratos Wistar explantado juvenis, obtido por técnicas de eutanásia humanas aprovados.

1. Equipamentos Preparação

  1. Instalar e configurar a aquisição de dados e sistema de estimulação.
    1. Usar um computador pessoal (PC) equipado com uma placa de aquisição de dados (DAQ) suportado por Comedi para gravar sinais e enviar voltagens analógicas de controlo para o amplificador electrofisiológico.
      NOTA: Comedi é um módulo de Linux e biblioteca que suporta uma grande variedade de cartões de aquisição de dados dos fabricantes mais comuns: visitar http://www.comedi.org para mais informações.
    2. No caso de um amplificador de patch clamp controlado por computador está em uso, empregar um segundo PC além do uma dedicada ao amplificadorao controle.
      NOTA: Enquanto o último pode executar um sistema operativo convencional, o PC extra será operar em tempo real por meio de um sistema especial de funcionamento. Nestas condições, é conveniente usar um único monitor, mouse e teclado conectado ao PC extra, durante a conexão por um aplicativo de desktop remoto para o PC dedicado.
    3. Baixe a imagem ISO do Live CD que contém um sistema operacional em tempo real com Linux pré-instalado da LCG http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso e queimá-lo em um CD ou USB vara em branco " .
    4. Basta inserir o CD no drive do PC que contém o cartão DAQ e iniciá-lo. Como alternativa, instale LCG do seu repositório fonte on-line em um PC rodando o sistema operacional Linux (por exemplo, Debian ou Ubuntu). Consulte o manual online para obter detalhes sobre o procedimento de instalação. O manual está disponível online em http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf.
    5. Arrancar a partir do CD ao vivo: this carregará automaticamente um sistema totalmente configurado. Para fazer isso, coloque o Live CD do LCG no computador unidade de CD-ROM e inicialize o computador a partir do CD; selecionar o kernel de tempo real (opção padrão), logo que o menu de inicialização aparecer e aguarde o sistema para inicializar.
    6. Calibrar o cartão DAQ, digitando no prompt de comando:
      sudo comedi_calibrate
      ou
      sudo comedi_soft_calibrate
      dependendo se a placa de aquisição de dados suporta calibração de hardware ou software, respectivamente (use o comando sudo comedi_board_info para obter informações sobre a bordo).
    7. Defina o conversor analógico-digital adequada e de digital para analógico factores de conversão: este exige ter acesso ao manual do amplificador eletrofisiológico celular e, particularmente, com as respectivas especificações nos seus factores de conversão.
    8. Use um editor de texto para especificar os valores numéricos apropriados no /home/user/.lcg-env arquivo, para as variáveis ​​de ambiente AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
      NOTA: Estes representam a entrada (AI) e de saída (AO) ganhos para alicate de corrente (CC) ea braçadeira de tensão (VC) modos, e os fatores de conversão entre os comandos de tensão fornecidas pelo computador e que o actual ou tensões geradas pelo amplificador , respectivamente.
    9. Como alternativa, use o script LCG fornecida (LCG-achado-conversão-factores), para encontrar os fatores de conversão de seu sistema.
      NOTA: Os valores calculados pela LCG-encontrar-conversão-fatores são suposições, que em alguns casos são necessários para ser numericamente truncado ou arredondados para refletir os valores exatos dos factores de conversão.
    10. Para usar lcg encontrar-conversão-fatores, comece conectando a "célula modelo", que muitas vezes é comprado com o amplificador para o headstage correspondente. Em seguida, abra um terminal na máquina Linux onde você está executando o Live CD e digite o seguinte comando no prompt shell:
      lcg-encontrar-conversão-fatores -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
      NOTA: Em ambos os casos (ou seja, modificação manual de /home/user/.lcg-env ou uso de LCG-achado-conversão-factores), fechar e abrir o terminal para que as alterações tenham efeito.
    11. Se forem usadas várias headstages, defina os fatores de conversão para os mesmos valores em todos os canais; se isso não for possível, consulte o manual online LCG para entender como usar vários factores de conversão em LCG-estímulo ou como produzir arquivos de configuração que melhor se adequam às necessidades do usuário.

2. Preparação de fatias do cérebro do aguda do córtex somatossensorial

  1. Preparação de soluções para eletrofisiologia.
    1. Preparar fluido cerebrospinal artificial (ACSF) através da mistura de (em mM) 125 de NaCl, 2,5 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 25 de glucose, 2 CaCl2, 1 MgCl2 e. Prepare 10x soluções estoque para reduzir oo tempo de preparação, no dia da experiência. Preparar 2 L, dos quais um será usado para a preparação das fatias e a outra para a gravação.
    2. Saturar o ACSF com 95% de O2 e 5% de CO 2 durante pelo menos 30 minutos antes do início do procedimento.
    3. Para gravações de controle de corrente, usar uma solução intracelular (ICS) contendo (em mM) 115 de K-gluconato, KCl 20, 10 de HEPES, 4 de ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparar a solução em gelo e filtrá-la antes do início das gravações para eliminar o risco de entupimento da pipeta.
  2. Extracção do cérebro.
    1. Anestesiar o animal colocando o animal em uma câmara de indução com 4% de isoflurano e rapidamente decapitar-lo usando uma guilhotina ou tesouras grandes.
    2. Corte a pele ao longo da linha média e deslize-o para os ouvidos.
    3. Usando um belo par de tesouras cortou o crânio ao longo da linha média. Mantenha a lâmina mais perto possível para poe a superfície de modo a minimizar os danos no cérebro subjacente. Abra o crânio com um par de pinças, utilizar uma espátula para separar o nervo óptico e do tronco cerebral e do cérebro cair suavemente em ACSF gelado.
    4. Separa-se o cerebelo e os dois hemisférios com um bisturi (lâmina 24).
    5. Remover o excesso de água a partir de um dos dois hemisférios e colá-la sobre uma plataforma inclinada utilizando uma gota de supercola. Rapidamente adicionar algumas gotas de ACSF sobre o cérebro e transferi-lo para a câmara de vibratome.
      NOTA: Ao preparar fatias sagital, o ângulo da plataforma é importante para evitar danificar os dendritos das células piramidais durante o procedimento de corte.
  3. Preparação das fatias.
    1. Posicione a lâmina sobre o cérebro e descartar o primeiro 2,5-3 mm. Ajustar a velocidade e frequência para limitar os danos à superfície da fatia e, ao mesmo tempo, minimizando o tempo necessário para o procedimento de corte.
    2. Defina a espessura de 300 μm e começar a cortar. Uma vez que a lâmina foi passado o córtex, utilizar uma lâmina de barbear ou de uma agulha dobrada para cortar acima do hipocampo e nas bordas da área cortical de interesse.
    3. Coloque as fatias numa câmara de incubação de poços múltiplos mantida a 32-34 ° C.
    4. Retrair a lâmina e repita pontos 2.3.2 e 2.3.3 até 5-8 fatias são cortadas. Os melhores fatias são normalmente aqueles em que os vasos sanguíneos são paralelas à superfície.
    5. Incubam-se as fatias durante 30 min após a última fatia é colocado na câmara.

3. Gravações patch-clamp de Camada 5 piramidais neurônios

  1. Coloque uma fatia na câmara de gravação e procurar células saudáveis. Estas células normalmente têm menos contraste, uma aparência suave e não estão inchados.
  2. Inspeccionar a fatia sob o microscópio com a lente de ampliação de 40X e procurar as células em 5 camada, localiza-se, aproximadamente, 600 a 1000 um a partir da superfície do cérebro.
  3. Uma vez que uma célula adequada, a carga de um terço da micropipeta com o ICS e colocá-lo no andar de entrada.
  4. No computador pessoal executando o CD ao vivo ou o sistema operacional Linux pré-configurado, abra um shell de comando (por exemplo, bash) e pelo seu tipo prompt de comando LCG-zero. Isso garante que a placa DAQ não está dirigindo o amplificador.
  5. Aplicar 30 - 50 mbar de pressão positiva, pressionando o pistão de uma seringa comum, ligada por tubagem para o suporte da pipeta e, com a ajuda de um microscópio, colocar a pipeta de aproximadamente 100 mm acima da fatia.
    NOTA: Coloque a pipeta numa posição que permite uma via directa para a célula alvo, de preferência usando o modo de abordagem do micromanipulador.
  6. Agindo sobre os controles do amplificador eletrofisiologia, ajustar o deslocamento pipeta e saída de um pulso de teste (10 mV) no modo braçadeira de tensão.
  7. Reduzir a pressão para 10 - 30 mbar (dependendo do tamanho da pipeta), retirando oêmbolo da seringa; aproximar suavemente a célula e verificar a formação de uma ondulação, observando a imagem no monitor da câmara de vídeo. Monitore o pulso de teste para um aumento da resistência em todos os momentos, observando a forma de onda atual exibida no osciloscópio ligado ao amplificador eletrofisiologia (alternativamente, você pode usar o LCG-seal-teste de comando para monitorar a resistência pipeta).
  8. Libertar a pressão e, se necessário aplicar pressão negativa suave para a pipeta para ajudar a formação de selo quando se detectar um aumento na resistência da pipeta e a formação de uma "ondulação" na célula.
  9. Enquanto as formas de vedação, gradualmente, diminuir o potencial de realização de -70 mV.
  10. Uma vez que um selo gigaohm tenha sido obtida, garantir que a corrente de retenção é entre 0-30 pA. Aplicar pulsos curtos de pressão negativa (sucção) para quebrar a membrana e estabelecer a configuração de célula inteira. Alternativamente, você pode injetar pulsos fortes e breves de tensão ( isto é, utilizando o comando "ZAP" no amplificador ou segurando a célula em muito negativa) para romper a membrana, dependendo da preparação e pipeta de vidro utilizado.
  11. Alternar para o modo pinça de corrente e verificar se o potencial de repouso da membrana é típica de uma célula saudável. Para neurônios piramidais corticais usando uma solução baseada em potássio-gluconato, este valor é geralmente entre -65 e -75 mV.

4. Caracterização semi-automática de Imóveis resposta elétrica do neurônio

  1. Crie um diretório para armazenar os dados do usuário. A fim de fazer isso a empregar um script incluído no LCG vivo CD que cria pastas com base na data. Para usá-lo, digite no prompt de comando
    cd ~ / experiências
    LCG-criar-experimento-pasta-s psp, in_vivo_like
    Isto irá criar uma pasta onde os dados para essa célula será salvo (e um 'psp' e 'in_vivo_like' subpastas) e ele irá imprimir o seu nome para o terminaljanela; também é possível armazenar informações adicionais, tais como a resistência da pipeta e tipo de célula usando este script.
  2. Altere o diretório para a pasta recém criada usando o comando
    cd ~ /
    O nome da pasta é a que é exibida pelo comando LCG-criar-experimento de pasta e terão o carimbo de hora do dia atual (ou seja, ano-mês-dia), como em 20140331A01.
  3. Certifique-se de que o amplificador é configurado para operar no modo de alicate de corrente, de que os cabos estão conectados e de comando externo de tensão do amplificador, se presente, está habilitado.
  4. Digite o comando LCG-ecodeat prompt de comando. Isso exige uma série de comandos (ou seja LCG-ap, lcg-vi, lcg-ramp, lcg-tau e LCG-passos), utilizado para caracterizar as propriedades básicas de resposta da célula. LCG-ecode requer que o utilizador especificar dois parâmetros: a amplitude do 1 ms de duração de impulso de corrente usada para induzir um único pico na célula, e a amplitude máxima da corrente de carneirop injectado para dentro da célula para encontrar a sua reobase.
    Use a seguinte sintaxe de comando:
    LCG-ecode --pulse-amplitude X---ramp amplitude Y
    com uma escolha dos valores de x e Y (em Pa) que são suficientes para tornar o fogo de células em resposta a um 1 ms de duração de pulso e uma injecção de corrente contínua, respectivamente.
    NOTA: Estes protocolos exigem a execução da estimativa numérica do 'kernel do eléctrodo ", a fim de usar o eletrodo de Compensação Ativa (AEC) 15. A injeção de corrente ruidosa é usado para estimar o kernel eo usuário é solicitado a confirmar o número de amostras que compõem o kernel. Veja 15 para obter informações detalhadas sobre o significado do kernel do eletrodo e como escolher o número de amostras do kernel.

5. Injeção de condutância através simulados Sinapses e Simulação de In Vivo -como Atividade Fundo

  1. A injeção de potenciais pós-sinápticos excitatórios simulados
    1. Mude para o diretório onde você irá salvar o próximo experimento, digitando o seguinte comando no prompt de comando do shell:
      psp cd / 01
    2. Copiar um arquivo de configuração de LCG para o diretório atual e abri-lo com um editor de texto (Nano neste exemplo), digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell (este arquivo de configuração exemplo está incluído no código fonte eo cd ao vivo) :
      cp ~ / local / src / lcg / configurações / epsp.xml
      nano epsp.xml
      NOTA: Este é simplesmente um ficheiro de texto com diferentes entidades ligadas uma à outra. Para mais detalhes veja a seção Resultados Representante.
    3. Se necessário editar o inputChannel, outputChannel, o inputConversionFactor eo outputConversionFactor neste arquivo para coincidir com a configuração do usuário.
    4. Calcule o kernel eletrodo necessário para executar a compensação eletrodo ativo 'o método utilizado pela LCG para executar eletrodo único grampo dinâmico ", emitindo o command
      LCG-kernel
      Isto irá pedir para o número de pontos do kernel. Novamente, seleccionar um número de modo a que o núcleo de eléctrodo cobre a extremidade da cauda de decaimento exponencial.
    5. Realizar o experimento braçadeira dinâmica usando o comando
      LCG-experimentar epsp.xml -c
    6. Listar os arquivos e visualizar os resultados usando o comando
      ls -l
      LCG-plot--f arquivo último
  2. Injeção de potenciais pós-sinápticos inibitórios simulados
    1. Crie uma pasta e copiar o arquivo para epsp.xml-lo digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
      mkdir ../02
      cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
      cd ../02
    2. Edite o arquivo de configuração usando um editor de texto: mudar o potencial reversão sináptica e subir e tempo de decaimento constantes do Exp2Synapse modelo sinapse para o seguinte:
      parâmetros>
      -80
      0.8e-3
      10e-3

      Saia do editor de texto.
    3. Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
      LCG-kernel
      LCG-experimentar ipsp.xml -c
    4. Listar os arquivos e visualizar os resultados, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
      ls -l
      LCG-plot-arquivo -f
  3. Simulação de in vivo -como atividade de fundo:
    1. Mude para o diretório onde você deseja salvar o seguinte experimento, conforme demonstrado anteriormente, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
      cd ../../in_vivo_like/01
    2. Copie o arquivo de configuração do directório de origem LCG, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
      cp ~ / local / src / lcg / configurações / in_vivo_like.xml
      nano in_vivo_like.xml
      NOTA: Este arquivo é simplesmente a concatenação dos anteriores; dois processos de Poisson pontos que geram trens ponto, que por sua vez alimentam inibitórios e excitatórios sinapses modelo, geram a atividade de fundo.
    3. Ajustar os parâmetros de configuração DAQ para a configuração do usuário, conforme descrito no ponto 5.1.3 e saia do editor.
    4. Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell:
      LCG-kernel
      LCG-experimentar in_vivo_like.xml -c -n -i 10 3
      Os interruptores '-n 10' e '-i' 3 indicam que a estimulação deve ser repetida 10 vezes em intervalos de três segundos.
    5. Visualize os traços matérias por usando o seguinte comando no prompt de comando do shell:
      LCG-plot-arquivo -f tudo

Resultados

Nas seções anteriores, descrevemos como usar a caixa de ferramentas de software LCG para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas de células piramidais L5 e recriar in vivo -como atividade sináptica em uma preparação fatia. O uso de uma interface de linha de comando e protocolo semi-automatizado favorecer a reprodutibilidade e a eficiência da experiência, o que pode ter um grande impacto sobre a produção e a qualidade dos dados produzidos. Além disso, uma vez que os dados são guardados de um...

Discussão

Neste texto um protocolo completo para a aplicação em tempo real, em circuito fechado célula única experimentos eletrofisiológicos foi descrito, utilizando a técnica de patch-clamp e uma caixa de ferramentas de software recentemente desenvolvido chamado LCG. Para otimizar a qualidade das gravações é crucial que a configuração de gravação ser devidamente fundamentada, blindado e vibração livre: Isso garante o acesso de células inteiras estável e duradoura para o celular, que, juntamente com a possibilida...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network “C7”, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology “ENLIGHTENMENT” project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue slicerLeicaVT-1000S
Pipette pullerSutterP-97
PipettesWPI1B150F-41.5/0.84 mm OD/ID, with filament
Vibration isolation tableTMC20 Series
MicroscopeLeicaDMLFS40X Immersion Objective
ManipulatorsScientificaPatchStar
AmplifiersAxon InstrumentsMultiClamp 700BComputer controlled
Data acquisition cardNational InstrumentsPCI-6229Supported by Comedi Linux Drivers
Desktop computerDellOptiplex 7010 TowerOS: real-time Linux
OscilloscopesTektronixTDS-1002
Perfusion PumpGibsonMINIPULS3Used with R4 Pump head (F117606)
Temperature controllerMultichannel SystemsTC02PH01 Perfusion Cannula
ManometerTesto510Optional
IncubatorMemmertWB14
NaClSigma71376ACSF
KClSigmaP9541ACSF, ICS
NaH2PO4SigmaS3139ACSF
NaHCO3SigmaS6014ACSF
CaCl2SigmaC1016ACSF
MgCl2SigmaM8266ACSF
GlucoseSigmaG7528ACSF
K-GluconateSigmaG4500ICS
HEPESSigmaH3375ICS
Mg-ATPSigmaA9187ICS
Na2-GTPSigma51120ICS
Na2-PhosphocreatineSigmaP7936ICS

Referências

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