JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Abstract

סינתזת חלבון היא תהליך בסיסי לביטוי גנים המשפיעים על תהליכים ביולוגיים מגוונים בעיקר הסתגלות לתנאי סביבה. צעד הייזום, הכולל הרכבה של תת-יחידות ריבוזומלי בmRNA קודון החניכה, הגורם מעורב ייזום כולל eIF4G1. פגמים בשלב זה שיעור הגבלה של תרגום צמודים להפרעות שונות. כדי לחקור את ההשלכות הפוטנציאליות של deregulations כזה, Xenopus laevis ביציות מהוות מודל אטרקטיבי עם מעלות גבוהות של שימור של מנגנונים תאיים ומולקולריים חיוניים עם אדם. בנוסף, במהלך התבגרות meiotic, ביציות תעתיק מודחקות וכל החלבונים הדרושים מתורגמים מקיימים מראש mRNAs, נגזר אימהי. מודל זה מאפשר זול mRNA אקסוגניים להשתלב בצורה מושלמת עם תרגום יעיל. כאן מתואר פרוטוקול להערכת תרגום עם גורם עניין (כאן eIF4G1) באמצעות storאד mRNA האימהי שהם ראשון להיות polyadenylated ותורגם במהלך הבשלת ביצית כקריאת נתונים פיזיולוגית. בתחילה, ה- mRNA synthetized ידי שעתוק במבחנה של פלסמידים של עניין (כאן eIF4G1) מוזרקים בביציות וקינטיקה של הבשלת ביצית על ידי זיהוי התפלגות רמינל שלפוחיות נקבע. יעד mRNA האימהי למד הוא סרין / Mos תראונין חלבון-קינאז. polyadenylation והתרגום הבא שלה נחקרים יחד עם הביטוי וזירחון של חלבונים של Mos מפל איתות מעורב בהבשלת ביצית. וריאציות של הפרוטוקול הנוכחי לשים קדימה פגמי translational גם הציעו להדגיש תחולתה הכללית. לאור ראיות שמתעוררות סינתזת חלבון חריגה עשויה להיות מעורבת בפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות, מודל כזה מספק את ההזדמנות כדי להעריך בקלות ירידת ערך זו ולזהות מטרות חדשות.

Introduction

חלבונים הם מרכיבים חיוניים של חיים סלולריים ובכך בקנה מידה גדולה יותר של האורגניזם. הם להבטיח רוב הפונקציות סלולריות כוללים מבנה, תחבורה, קטליזה תגובה, רגולציה, ביטוי גנים וכו 'הביטוי שלהם הוא התוצאה של מנגנון מורכב של תרגום המאפשר המרה של mRNA לחלבון. התרגום הוא נתון לבקרה שונות להסתגל ולהסדיר ביטוי גנים על פי צרכי התא, במהלך התפתחות והתמיינות, הזדקנות, לחצים פיסיולוגיים או פתולוגי גילויים.

תרגום מחולק ל 3 שלבים (ייזום, התארכות וסיום) ומתנות 3 מערכות תרגום ייזום כדי לענות על צרכי אלה: כובע תלוי, כובע-עצמאי באמצעות מגזר הפנימי הריבוזום כניסה (IRES) מבנים וכובע-עצמאי משפרי תרגום ( CITE).

רוב mRNA אוקריוטים מתורגמים בכובע-depeאופן ndent באמצעות כובע 5'-טריפוספט 7-methylguanosine המשמש כתכונת זיהוי במהלך סינתזת חלבון. כובע זה נקשר לeIF4E, רכיב של מורכב eIF4F עם eIF4G1 וeIF4A. קשור עם שותפים אחרים כמו פולי () חלבון מחייב (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, גורמי חניכת תרגום אלה מאפשרים לcircularize mRNA ולשפר את הנגישות שלה לצורות מורכבות 43s עד ייזום אוגוסט קודון הכרת 1. אירוע זה מתאים לסוף כלומר ייזום תרגום, הצעד הראשון של תרגום.

תרגום Cap-עצמאי משמש קידוד mRNA לחלבונים חיוניים בתנאים הדגישו כי לגרום להתפשטות תאים למשל ואפופטוזיס. מנגנון זה כולל מבנים משניים בmRNA 5'- אזור מתורגם (UTR) נקרא IRES, סוף carboxy מסוף של eIF4G1 הקשורים eIF4A והמורכב 43s. כריכה של זה 43s מראש הייזום גomplex לIRES יוזם את התרגום העצמאי הכובע ללא הצורך בגורם eIF4E 2,3.

לבסוף, מנגנון תרגום אחר עדיין לא הבין היטב תומך בפעילות תרגום כובע-העצמאי הזה, לפי תנאים הדגישו באמצעות CITE מבנים הנמצאים בתוך ה- mRNA 4 UTR.

דרך אלה מצבים השונים של התרגום השונה על ידי צעדי החניכה שלהם, תרגום משחק תפקיד קריטי בהומאוסטזיס סלולארי וכל שינוי באחד מהתהליכים אלה ובכך ישפיעו האורגניזם עם קטן לתופעות בקנה מידה גדולות. ואכן, החניכה היא צעד שיעור הגבלת שלטון תהליכי התרגום הנכון של mRNA לחלבונים ולכן היעד של מספר רב של בקרות ונקודות תקנה 5. בין אם מדובר באפשרות השנייה או לרכיבים של תהליכים אלה, אם אחד הופך להיות פגומים, זה יהיה לטרוד את האיזון שנקבע בתא ובכך עלול להוביל לקונדי פתולוגייםמשא. בהקשר זה, מוטציות בגורמי תרגום היו מעורבות במספר הפרעות, כולל הפרעות ניווניות כגון `leukoencephalopathy עם ההיעלמות לבנה matter' (מקטע eIF2B1-5) 6, בתסמונת וולקוט-Rallison (קידוד EIF2AK3 גן ל"הערכה") 7, שעלול להיות ב המחלה (p.R1205H eIF4G1) פרקינסון 8. לכן חשוב לבצע מחקרים תאיים ומולקולריים של חלבוני מוטציה אלה כדי להגדיל את הידע שלנו על התפתחות מחלה ועל התהליך הכללי של חניכת תרגום.

כדי לבצע את המחקרים הללו, זה חיוני כדי לבחור את הדגמים המתאימים ביותר לקיים את ההשלכות של מוטציות אלה Xenopus laevis ביציות מותאמות במיוחד גם בשל המאפיינים הפיסיולוגיים וביוכימיים שלהם:. סינכרוניות הפיזיולוגית (חסום בG2 שלב של מחזור התא) , קיבולת גבוהה של סינתזת חלבון (200-400 ng / יום / ביצית), מספר גבוה של OOC חולץytes מאותה חיה (800-1,000 ביציות / נקבה) וגודל תא (1.2-1.4 מ"מ קוטר) המאפשר המניפולציה שלהם. Microinjection של ביציות Xenopus עם mRNA מסונתז בקלות ניתן לבצע כדי לנתח את הפעולות תרגום. בתצוגה זו מציג יתרונות אחרים. בהתחשב במהירות של התקדמות מיוזה ותרגום לאחר microinjection mRNA (~ שעה 24), ביצית Xenopus מייצגת מערכת מהירה בהשוואה למערכות מחדש סלולריות (שחולצו מE.coli, חיידקי חיטה או reticulocyte ארנב ...) שבו mRNA הוא מתורגם עם שיעור מופחת ותרגום במהירות נמוכה יותר. אז, את ההשפעות של מוטציה הציגה בmRNA תהיה במהירות לצפייה ולמד בקלות בכמה ביציות. יתרון נוסף של ביציות Xenopus הוא שmRNAs האימהי הוא סמוי ותרגום חלבון חסום לפני גירוי פרוגסטרון. תוספת של פרוגסטרון היא אפוא אמצעי טוב של השליטה האינדוקציה התרגום. p cytoplasmicolyadenylation אינו מתרחש במהלך oogenesis. זה מתחיל בהבשלת ביצית בביציות מגורה פרוגסטרון בצו זמני וממשיך לאורך התפתחות מוקדמת ויכול לשמש כדי לחקור את השלבים השונים של תרגום.

Polyadenylation של Mos mRNA הוא בין הראשונים שמתרחשים והוא שייך עם אורורה / Eg2, היסטון-כמו B4 mRNA לכיתה של גנים "התבגרות המוקדמת" כהגדרתו בCharlesworth et al. (2004) 9. האינדוקציה translational של mRNA "מאוחר" כגון Cyclin A1 וCyclin B1 מתרחשת בערך בזמן של התמוטטות נבטי שלפוחית ​​(GVBD). Mos mRNA מקודד קינאז סרין / תראונין חלבון. התרגום שלה הוא קריטי שכן הוא גורם למפל קינאז מפה שבעקיפין מפעיל את הבשלת הביצית. ואכן, בתגובה לפרוגסטרון, polyadenylation של Mos mRNA מוגבר באמצעות תהליך הכרוך אורורה / Eg2 חלבונים רגולטוריים וחלבוני RNA מחייב אחרים עם ההדואר 3'UTR של Mos mRNA. polyadenylation המוגבר של Mos mRNA מוביל לעלייה של רמת חלבון mos, אשר בתורו מפעילה MEK1. תהליך זה מתווך את ההפעלה של קינאז מוסדר האיתות תאי 2 (ERK2) (איור 1). מפל איתות זה יכול לגרום לאז M-שלב התבגרות קידום גורמים, מורכב נוצר על ידי קינאז Cyclin B וCdc2, וסופו של דבר גורם לחידוש meiotic.

לכן בXenopus laevis ביציות, יכול לשמש בקלות המחקר של mRNA האימהי כגון Mos לבדוק translatability עם כמה נקודות קצה מpolyadenylation היעילה שלהם לתרגום של כמה Mos איתות רכיבים, הכולל גם את קביעת שיעור GVBD. מערכת זו היא מעניינת ולכן כדי להעריך את ההשלכות הראשונות של מוטציות בגורמי חניכת תרגום ללא התערבות של mRNA עיבד חדש או של יעילות transfection, בעיות לעתים קרובות מתרחשות עם eukaryמחקרי תא otic.

כאן, פרוטוקול הוקם בי mRNAs eIF4G1 מוטצית microinjected בXenopus laevis ביציות ובתרגום של mRNA האימהי נבדק. בנוכחות של פגם בהתקדמות GVBD, Mos polyadenylation mRNA שהוא חיוני להתקדמות דרך מחזור תא ביצית meiotic ולתרגום הבא של mRNAs כיתה המוקדם והמאוחר הוא הוברר. זירחון אורורה / Eg2 וERK הוא גם למד כדי לאשר את התוצאה של deregulation.Thus mos, ביציות Xenopus מייצגות דרך פשוטה כדי לנתח את הפעולות שונות של תרגום mRNA.

Protocol

כל ניסויי Xenopus בוצעו במתקן בעלי החיים של אוניברסיטת 1 Lille על פי הכללים של הנחיות מועצת הקהילה האירופית (86/609 / EEC) לניסויים בבעלי חיים במעבדה. פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי הסקירה מוסדית הלוח המקומי (Comité d'en Ethique הניסויים animale נור-פה דה קאלה, CEEA 07/2010).

טיפול 1. ביצית

  1. הכן את פתרון ההרדמה: לפזר 1 גרם של אבקת sulphonate תאן tricaine ב1 ליטר של מים סטריליים.
  2. צניחת צפרדעים נקבת laevis לפתרון זה, לכסות את הכוס, כדי למנוע בריחה ולחכות כ -45 דקות לחיה להיות מסוממת לגמרי (ללא כל תגובה לקמצוץ רגל).
  3. שטוף את הצפרדע עם סבון ולשטוף במים ברז ואז למקם את החיה על גבה על רדיד אלומיניום נקי.
  4. הצמד את העור של החלק הרוחבי של הבטן וברמת השחלות עם מלקחיים.עושה חתך של כ 1 סנטימטר במספריים לנקות לפני שימוש עם 70% אתנול. ודא שהסעיף הוא עמוק מספיק ולהגיע לדופן בטן הבסיסי כדי לאפשר כריתה של רקמת השחלה שבכמה ביציות בשלבים שונים של פיתוח נמצאות.
  5. לנתח את אונות השחלה, לשטוף אותם 4 פעמים בצלחת פטרי (50 מ"מ) עם מדיום ND96 (96 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgCl 2, 1.8 מ"מ CaCl 2, 5 מ"מ HEPES מותאם pH 7.4 עם NaOH, בתוספת עם 50 מיקרוגרם / סטרפטומיצין / פניצילין, מיקרוגרם 225 מיליליטר / מיליליטר נתרן פירובט, 30 מיקרוגרם / מעכבי טריפסין סויה מיליליטר, μl 1 / טטרציקלין מיליליטר) כדי להסיר כל העקבות של דם ופסולת.
    הערה: טטרציקלין מאפשר שימור אופטימלי והתאוששות טובה לאחר טיפול microinjection.
  6. לאחסן אותם בצלחת פטרי מכוסה השקועה במדיום בגיל 14 מעלות צלזיוס, ומאפשר השימור שלהם במשך שבוע אחד.
  7. לתפור את דופן הבטן ועור עם לא נספגים וטרינרלחם ומחט תפירה (3 או 4 תפרים יהיו צורך).
  8. מניחים את החיה בכוס בלי מים ולחים לעור במים ברז עד לצפרדע נעה שוב. מכסה את הכוס כדי למנוע בריחה.
  9. להפריד בזהירות את אונות השחלה במדיום בקבוצות של 5 עד 10 ביציות באמצעות 2 זוגות מלקחיים תחת stereomicroscope עם הגדלה של פי 10. ביציות בחרו בVI השלב. הם יכולים להיות מוכרים על ידי i) הצורה והצבע שלהם עם מוט חום פיגמנט בעלי חיים ומוט וגטטיבי צהוב מופרד על ידי החגורה ברורה ii) גודלם עולה על 1.2 מ"מ בקוטר 10.
  10. דגירה הביציות שנבחרו בפתרון collagenase (1 מ"ג / מיליליטר collagenase מhistolyticum Clostridium, מומס בND96 ללא טטרציקלין) בצלחת פטרי תחת תסיסה עדינה במהלך 45 דקות כדי להקל על defolliculation הביצית (collagenase מעכל קשרי תא ביצית זקיקים /). יש לשטוף את הביציות 3 או 4 פעמים עם מדיום ND96 המשיכו בגיל 14מעלות צלזיוס.
    הערה: אל דגירה הביציות פחות או יותר מ -45 דקות בשל הסיכון של הרס חלבוני פני השטח ביצית ולגרום לכדאיות עניה. טיפול Collagenase יכול לגרום GVBD הספונטני.
  11. דגירה ביציות במדיום במשך 3-4 שעות. הסרת תאי זקיקים עם פינצטה בסדר תחת זכוכית מגדלת משקפת ולשמור אותם בגיל 19 מעלות צלזיוס במדיום ND96.

2. הכנה של mRNA סינתזה

  1. Linearize 5 מיקרוגרם של פלסמידים הבאים על ידי עיכול אנזימטי באמצעות PME אני אנזים.
    הערה: pcDNA6.2 / V5-DEST המכיל חומצות אמינו מסוג 1,599 eIF4G1 cDNA פראי (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST מכיל cDNA eIF4G1 הדומיננטי שלילי (eIF4G1-DN) עם מוטציות c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T, 2125T>> - וc.2126T> G מפריע באזור של אינטראקציה בין eIF4G1 וeIF4E בעמדה 612-618 של החלבון המקביל betwe אינטראקציהen eIF4G1 וeIF4E 8, pcDNA6.2 / C-EmGFP מכיל chloramphenicol אצטיל transferase (GFP). הכן 2 תערובות לכל אחד מפלסמידים 3: PME הראשון כולל אני אנזים והשני ללא אנזים כשליטה.
  2. לזרז פלסמיד דנ"א באמצעות הליך אתנול קלאסי וresuspend אותו 20 μl של H nuclease ללא 2 O.
  3. לקבוע את הריכוז שלה באמצעות ספקטרופוטומטר. הריכוז צריך להיות עדיף על 150 ng / μl לתמלל קרנה.
  4. הפעל 1 μl של דגימות והבקרה שלהם עם 5 μl של חיץ טעינה על ג'ל agarose 0.8% כדי לאמת את linearization פלסמיד.
  5. השתמש בערכה לשעתוק במבחנה וטיהור קרנה על פי הוראות יצרן. קרנה עיבד הם resuspended ב 20 μl של H nuclease ללא 2 O. דוגמאות ניתן לאחסן ב -80 ° C במידת הצורך.
  6. הכן את חיץ הגירת מגבים 10X המכיל 0.2 M מגבים (pH 7.0), 20 מ 'אצטט M נתרן ו -10 מ"מ EDTA (pH 8.0). לעקר פתרון עם מסנן 0.45 מיקרומטר. מניות הפתרון מוגנים מפני האור על RT כדי למנוע חמצון פתרון.
  7. נקה את מיכל אלקטרופורזה ברציפות עם NaOH, HCl ושטף היטב במים מסוננים כפולים לO / N להימנע RNase ולמנוע השפלה RNA.
  8. עופרת agarose ג'ל המכיל 1.5% מגבים ופורמלדהיד. חם עד לפירוק agarose מלא ולתת לו להתקרר עד 55 מעלות צלזיוס. מתחת למכסה מנוע קטר, להוסיף 0.1 בנפח של מגבים 10X, 6.6% של פורמלדהיד ו -4 מיקרוגרם של ברומיד (10 מ"ג / מיליליטר). יוצקים את הג'ל מתחת למכסת מנוע קטר ולחכות כ 1 שעה לג'ל להקשיח.
    הערה: פורמלדהיד וethidium ברומיד הם רעילים.
  9. הכן דגימות להגירה בצינור 0.2 מיליליטר עם 1 μl של קרנה, 8.8% של פורמלדהיד, 60% מפוראמיד ונפח של 0.1 מגבים 10X. דגירה של 3 דקות ב 70 מעלות צלזיוס ולשים את הצינורות על קרח למשך 10 דקות. צנטריפוגה דגימות כמה שניות בx גרם 5000. הוסף 2 μl של חיץ טעינת ג'ל.
    הערה: Formamide הוא רעיל.
  10. הפעל דגימות עבור 20 דקות ב 90V. משרים את הג'ל בOO H 2 nuclease ללא / N לdestain ג'ל לפני הניתוח בו כדי לבדוק את איכות קרנה.
  11. קביעת ריכוז קרנה באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן אותם ב -80 ° C.

3. Microinjection של מסונתז רנ"א וביציות בשלים גירוי

  1. הכן את הציוד הדרוש לmicroinjection ביציות. להשתמש חולץ micropipette למשוך נימי זכוכית קטנות. תחת סטראו, לשבור את הגפיים של הנימים עם פינצטה כדי ליצור קצה קהה. מלא את micropipette הנימים עם שמן מינרלים באמצעות מזרק 1 מיליליטר עם מסנן Millipore 0.45 מיקרומטר בדיוק בקצה השני. הר micropipette על פיפטה microinjection. בחר micropipette מדויק מכויל על ידי היצרן לתת דיוק טוב בעת שימוש עם נימי זכוכית מתאימות.
  2. בצע microinjection 1-2 שעות לאחר defolliculation, עיכוב הכרחי להתאוששות ביצית בביציות נשמרים בגיל 14 מעלות צלזיוס. מנות שימוש פטרי עם התחתית מגורדת עם מלקחיים כדי ליצור משטח דביק לביציות ולמלא אותם במדיום ND96.
  3. לארגן ביציות לאורך נתיב מגורד בצלחת פטרי המאפשרת הזרקה רצופה של ביציות עם micropipette הנימים בזווית של 45 מעלות צלזיוס.
  4. להזריק באזור הקו המשווה הביצית, מתחת לאזור בעלי החיים פיגמנט לדיפוזיה אופטימלית של דגימות בציטופלסמה. הכנס את החלק הדק ביותר רק של קצה נימים על כ 150-200 מיקרומטר של עומק.
  5. הזרק 30 ng של קרנה הושג בהתאמה מפלסמידים השונים בהיקף של 60 NL בביצית ראשונה. לאחר הזרקה, לחכות 5-10 שניות לפני הסרת קצה הנימים כדי למנוע בריחת מדגם (איור 2 א).
    הערה: אל תעלה על 120 NL. להזריק לאט ככל שתוכל. שליטה במים מזוקקים מומלצת.
  6. הזז ידני צלחת פטרי להזריק הביצית הבאה.
    הערה: ודא שהקצה אינו סתום על ידי יצירת דופק קטן מפתרון האמבטיה לאחר 2 עד 3 microinjections.
  7. העברת ביציות הזריקו בתרבות צלחות 24 בארות (10 ביציות / טוב) מלא עם 3 מיליליטר של מדיום ND96 הטרי ולהשאיר אותם בגיל 19 מעלות צלזיוס.
  8. דגירה הביציות בND96 עם פרוגסטרון (PG) (2 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי לעורר התבגרות meiotic (GVBD) בגיל 19 ° C, 15 שעות או 4 שעות לאחר microinjection של cRNAs polyadenylated הושג בהתאמה מpcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 וpcDNA6 .2 / C-EmGFP משמש כביקורת (איור 2 א).
    הערה: ההזרקה משותפת של סמן פלואורסצנטי עם קרנה היא כלי נחמד כדי להבטיח שקרנה הוזרקה ונשארה בביצית. לבצע ניסויים ראשוניים כגון באמצעות קרנה של עניין עם תג ה- GFP.
  9. Microinject כמו ב# 3.5 יחסים שונים (1: 3, 2: 2; 3: 1) של polyadenylated eIF4G1-WT וeIF4G1-DN cRNAs כדי teרח השפעת התרגום של cRNAs eIF4G1-WT בפנוטיפ מוטנטי (איור 2 ד).

קביעת התפלגות 4. רמינל שלפוחיות

  1. לספור את מספר הביציות בשלות לאחר גירוי PG ידי התבוננות הנוכחות של כתם לבן בקוטב החיה השחור עם סטראו. חזור על ספירת כל שעה עד השעה עשרים והארבעה (איור 2, 2C).

5. מערבי כתם ניתוח (WB)

  1. Homogenize הקבוצה של 10 ביציות על ידי קדימה ואחורה בתנועות עם קצה micropipette, על 4 מעלות צלזיוס ב200 μl במאגר הבא: 50 מ"מ Hepes, pH 7.4, 500 מ"מ NaCl, 0.05% SDS, 5 מ"מ MgCl 2, 1 מ"ג / אלבומין מיליליטר שור סרום, 10 מ"ג / מיליליטר leupeptin, 10 מ"ג / מיליליטר aprotinin, 10 מ"ג / מיליליטר מעכבי טריפסין הסויה, 10 מ"ג / מיליליטר benzamidine, 1 מ"מ PMSF, vanadate נתרן 1 מ"מ.
  2. צנטריפוגה דגימות במשך 15 דקות על 10,000 XG להסיר את השומנים בדם (עליון שלב) והקרום f (שלב תחתון)ractions. לאסוף את חלק cytoplasmic, לאחסן aliquot כדי לקבוע ריכוז חלבון ולהשלים את היתרה עם Laemmli או חיץ מדגם Bis-טריס (1: 1).
    שים לב: יש לי ג'לי Bis-טריס ומאגר טעינת pH ניטראלי יותר שמגן על חלבונים מהידרוליזה
  3. מחממים 20 מיקרוגרם של מדגם ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לטעון כל דגימה לתוך הבארות של ג'ל acrylamide. מניחים את הג'ל בטנק עם מאגר מתאים.
  4. לבצע אלקטרופורזה עבור h 1 ב 200 V.
  5. מבין WB בכפות pH 8.0 (טריס HCl 15 מ"מ, 150 מ"מ NaCl, Tween 0.1%, המכיל 10% אלבומין בסרום שור) עם אנטי-אורורה / Eg2 עז (1: 3000, 2 שעות) או עם אנטי ארנב -Aurora / Eg2-P (1: 1,000, O / N ב 4 ° C), עכבר אנטי-ERK2 (1: 3000, שעה 2), אנטי-ERK2-P עז (Tyr204) (1: 3000, 2 שעות ), ארנב נגד Mos (1: 5,000, 4 שעות), ארנב נגד GFP (1: 3000, שעה 2) antibodies.Use נוגדני העכבר אנטי V5 (1: 10,000, 2 שעות) וארנב נגד RSK (1 : 1,000, 2 שעות) (שולטת טעינה).
  6. לשטוףהקרום 3 פעמים במשך 10 דקות בכפות-Tween דגירה שעה 1 עם או אנטי עכבר או נוגדנים משני שכותרתו peroxidase חזרת נגד ארנב או אנטי-עז (IgM) בדילולים של 1: 5,000, 1: 7,500 ו1 : 5,000 בהתאמה.
  7. בצע 3 שוטף של 10 דקות בכפות-Tween ולזהות את מתחמי אנטיגן-נוגדנים במערכת מתקדם ECL איתור.

6. polyadenylation Assay

  1. לדוגמא 5 ביציות לכל מצב ב1.5 מיליליטר. לשטוף אותם עם 1 מיליליטר של nuclease ללא PBS 1X (pH 7.4). השלבים הבאים יבוצעו מתחת למכסת מנוע קטר.
  2. לחלץ RNA באמצעות הליך אורגני קלאסי (ראה הוראות יצרן).
  3. להתאושש RNA על ידי צנטריפוגה (10,000 XG) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר supernatant ו- RNA האוויר היבש למשך 10 דקות.
  4. גלולה RNA הגלול בμl 30 של H nuclease ללא 2 O.
  5. קח 15 μl של דגימות בצינור חדש ולהוסיף 85 μl של H nuclease ללא 2 O. לנקות אתדגימות se כדי לשפר את האיכות שלהם על הטור של סיליקה על פי הוראות היצרן. Elute RNA באמצעות 30 μl של H nuclease ללא 2 O
  6. הפעל 1 μl של דגימות עם 5 μl של חיץ טעינה על ג'ל agarose 0.8% כדי לבדוק את תקינות RNA.
  7. קבע את ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
  8. הכן 2 תערובות קשירה למצב (כלומר, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN ושליטת 2 O H) עם ריאגנטים הבאים: 10 U של האנזים RNA, 0.1 נפח של 10X חיץ, 1 מ"מ ATP, 10% מPEG8000 50% , 0.1 מיקרוגרם של P1 פריימר (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') 11 ולהביא את הנפח הסופי עד 10 μl עם H nuclease ללא 2 O. להוסיף בRNA התערובת הראשון שהתקבל מביציות ללא גירוי PG ובRNA התערובת השני מתקבל מPG מגורה ביציות.
  9. דגירה עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן במשך 20 דקות על 65 מעלות צלזיוס כדי להשבית את האנזים.
  10. שלנוEA cDNA הפוך תמלול ערכה (RT). מכין את תערובת RT, לכל צינור: 0.1 נפח של חיץ 10X RT, 0.1 מיקרוגרם של P2 פריימר (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) 10, תערובת 4 מ"מ dNTP, 50 U של טרנסקריפטאז ולהשלים עם H nuclease ללא 2 O נפח סופי 10 μl. הוסף 10 μl תגובת קשירה שהושגה בעבר. בצע RT בתנאים שתוארו על ידי היצרן.
  11. הכן תגובת שרשרת פולימראז תערובת (PCR), לכל צינור: 0.1 נפח של חיץ 10X, 1.5 מ"מ MgCl 2, 133 מיקרומטר תערובת dNTP, 0.2 מיקרומטר פריימר הספציפי, 0.2 מיקרומטר P2 פריימר, פולימראז 0.025 U תקי, 1 μl של cDNA ולהשלים עם -Nuclease חופשי H 2 O לנפח סופי של 50 μl. לבצע PCR בתנאים הבאים: 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, [95 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, 56 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות] * 40 מחזורים, 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות 9. פריימרים הספציפיים הם כדלקמן: mos, GB4 כמו-היסטון TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; B1 cyclin: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT 9.
  12. הכן 3% agarose ג'ל. להוסיף בכל מוצרי ה- PCR 10 μl של חיץ טעינה. הפעל את הג'ל עם 10 μl דגימות ב 110 V להגירה אופטימלית. נתח את הג'ל לאחר 10 ו -20 דקות כדי לבחון שינוי של גודל המשקף את אורכו של פולי הזנב () ובכך התבגרות RNA שהוא תנאי הכרחי לתרגום שלהם.

תוצאות

התבגרות הקינטית של ביציות Xenopus ונחישות של GVBD ביצית אחוז לאחר 24 שעות של גירוי PG (2B דמויות, 2C):

על מנת ללמוד את ההשלכות של התרגום של המוטציה eIF4G1-DN, התגובה לPG ב Xenopus laevis ביציות microinjected עם קרנה eIF4G1-DN הוא בהשוואה לeIF4G1-WT ול...

Discussion

תרגום הוא מנגנון המעורב בphysiopathology של הפרעות אנושיות רבות, כולל כמה מחלות ניווניות. למשל במחלת פרקינסון כמה דיווחים הציעו ירידת הערך בתרגום הקשורים מוטציות תורשתיות 8,12,13.

כמה דגמים סלולריים זמינים ללמוד תרגום. כאן, על מנת לל?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tricaine methane sulphonateSandozMS-222oocytes handling
ForcepsMoriaDumont MC40
Streptomycin/penicillinSigma781
Sodium pyruvateSigmaP2256
Soybean trypsin inhibitorSigmaT9128
TetracyclinSigmaT7660
Veterinarian absorbable Vicryl threadJohnson&Johson IntlJV1205
Collagenase ARoche diagnostics10103586001
PmeINew England BiolabsR0560SPreparation of synthetic mRNA
DNAse/RNAse free H2OLife Technologies10977
Sodium AcetateMerck6268
Absolute ethanolSigma02854
Nano DropThermo Scientific
TBE 10XEppendorf0032006.507
Ethidium bromide 10 mg/mlLife Technologies15585-011
mMESSAGE mMACHINE KitAmbion by Life TechnologiesAM1344
MOPSSigmaM1254
EDTAFluka03609
AgaroseLife Technologies16500-500
Formaldehyde 37%Merck1.04003.1000
FormamideFluka47671
Gel Doc ImagerBiorad
Oocyte Pipet with 100 8" Glass CapillariesDrummond Scientific Company3-000-510-Xmicroinjection
Replacement Glass 8"Drummond Scientific Company3-000-210-G8
0.45 µm filterMilliporeSLHA025NB
ProgesteroneSigmaP0130
HepesSigmaH3375Western Blot
NaClSigmaS5886
SDSBiorad161-0301
MgCl2SigmaA3294
Bovine serum albuminSigmaA4612
leupeptinSigmaL8511
aprotininSigmaA1153
benzamidineSigmaB6506
PMSFSigmaP7626
sodium vanadateSigmaS6508
Laemmli bufferBiorad161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 wellLife TechnologiesNP0323BOX
SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGXBiorad456-1036 and -1096
horizontal semi-dry blotting systemW.E.P. Compagny
GlycineBiorad161-0718
Tris-HClBiorad161-0719
Hybond ECL MembraneAmersham Life Science10401180
MethanolVWR20846-292
Ponceau Red (0.5%)SigmaP3504
Tween 20SigmaP2287
anti-GFPLife TechnologiesA11122
anti-V5Santa Cruz Biotechnologysc-58052
anti-Eg2Santa Cruz Biotechnologysc-27884
anti-Eg2-PCell SignalingC39D8
anti-ERK2Santa Cruz Biotechnologysc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)Santa Cruz Biotechnologysc-7976
anti-RskSanta Cruz Biotechnologysc-231
anti-mosSanta Cruz Biotechnologysc-86
anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-2005
anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-2812
anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibodySanta Cruz Biotechnologysc-2378
Advanced ECL Detection SystemAmershan Life ScienceRPN2135
PBS 1xSigmaP4417polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)Qiagen79306
ChloroformSigma31998-8
IsopropanolSigma278475-1L
RNeasy mini kitQiagen74106
RTL buffer Qiagen79216
RNAse free DNAse setQiagen79254
PrimersEurogentec
T4 RNA ligase 1 New England BiolabsM0204S
High capacity c-DNA Reverse Transcription kitApplied Biosystems, Life Technologies4368813
Taq polymeraseLife Technologies10342020

References

  1. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  2. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
  3. Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
  4. Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
  5. Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
  6. Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
  7. Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
  8. Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
  9. Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
  10. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
  11. Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
  12. Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
  13. Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson's disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
  14. Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
  15. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
  16. Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
  17. Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
  18. Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
  19. Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
  20. Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
  21. Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
  22. Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
  23. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  24. Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
  25. Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
  26. Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

103Laevis XenopuseIF4G1microinjectionpolyadenylation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved