Xenopus laevis als Modell zur Übersetzung Impairment Identifizieren

Zusammenfassung

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Zusammenfassung

Die Proteinsynthese ist ein fundamentaler Prozess, um die Genexpression beeinflussen vielfältigen biologischen Prozesse, insbesondere die Anpassung an Umweltbedingungen. Die Initiierungsschritt, der den Zusammenbau der ribosomalen Untereinheiten auf der mRNA-Initiationscodon beteiligten Initiationsfaktor einschließlich eIF4G1 beinhaltet. Defekte in diesem geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Translation an verschiedenen Erkrankungen verbunden. Um die möglichen Folgen eines solchen Deregulierungen studieren, Oozyten von Xenopus laevis bilden ein attraktives Modell mit hohem Grad von der Erhaltung der wesentlichen zellulären und molekularen Mechanismen mit menschlichen. Darüber hinaus soll während meiotischen Reifung Oozyten transkriptionell unterdrückt und alle notwendigen Proteine ​​aus bereits vorhandenen, maternalen mRNAs umgerechnet. Dieses preisgünstige Modell ermöglicht exogene mRNA, um perfekt mit einem effektiven Übersetzungs integriert werden. Hier ist ein Protokoll für die Bewertung der Übersetzung mit einem Faktor von Interesse (hier eIF4G1) mit stor beschriebened mütterlichen mRNA, die die ersten sind, um polyadenylierte und während Oocytenreifung als physiologischer Auslese übersetzt werden. Zuerst mRNA durch in vitro-Transkription von Plasmiden von Interesse (hier eIF4G1) synthetisiert werden in Oozyten und die Kinetik der Oocytenreifung von Keimbläschen Schlagerkennung injiziert wird bestimmt. Die untersuchten mütterlichen mRNA Ziel ist die Serin / Threonin-Proteinkinase mos. Seine Polyadenylierung und die anschließende Übersetzung zusammen mit der Expression und Phosphorylierung von Proteinen des MOS-Signalkaskade in Eizellreifung Beteiligten untersucht. Variationen des derzeitigen Protokolls zu unterbreiten Translationsfehlern werden ebenfalls vorgeschlagen, um der Allgemeinheit zu betonen. Angesichts der zunehmend Hinweise, dass aberrante Proteinsynthese kann in der Pathogenese von neurologischen Erkrankungen beteiligt sein, bietet ein solches Modell die Möglichkeit, leicht zu beurteilen diese Beeinträchtigung zu erkennen und neue Ziele.

Einleitung

Proteine ​​sind wesentliche Elemente des zellulären Lebens und damit zu größeren Maßstab des Organismus. Sie sorgen für die Mehrzahl von Zellfunktionen einschließlich der Struktur, Transport, Reaktionskatalyse, Regulierung der Genexpression usw. Ihre Expression ist das Ergebnis eines komplexen Mechanismus der Übersetzung für die Konvertierung einer mRNA in Protein. Die Übersetzung wird auf verschiedene Kontrollen unterzogen, sich anzupassen und die Genexpression nach den Zell Anforderungen während der Entwicklung und Differenzierung, Alterung, physiologischen Spannungen oder pathologischen Erscheinungen regulieren.

Über Internal Ribosome Entry Segment (IRES) Strukturen und CAP-unabhängige Translation Enhancers (cap-abhängige, cap-unabhängig: Die Übersetzung wird in 3 Phasen (Initiation, Elongation und Termination) und präsentiert 3 Einleitung Übersetzungssysteme, um auf diese Bedürfnisse zu reagieren unterteilt CITE).

Meisten eukaryotischen mRNA in einer cap-depe setztenndent Weise über die 7-Methylguanosin 5'-Triphosphat Kappe, die als Erkennungsfunktion während der Proteinsynthese dient. Diese Kappe bindet an eIF4E, einer Komponente von eIF4F Komplex mit eIF4G1 und eIF4A. Mit anderen Partnern wie Poly (A) Binding Protein (PABP) verbunden sind, eIF2-GTP-Met-tRNA ^Met, damit diese Translationsinitiationsfaktoren, um mRNA zirkularisieren und 43S-Komplex zur Verbesserung seiner Zugänglichkeit zu Formen bis zum August Initiationscodon Anerkennung ^1. Dieses Ereignis entspricht dem Ende der Translationsinitiations dh dem ersten Schritt der Übersetzung.

CAP-unabhängige Translation von mRNA-Codierung für essentiellen Proteine ​​unter Stressbedingungen, die beispielsweise Zellproliferation und Apoptose induzieren. Dieser Mechanismus beinhaltet Sekundärstrukturen der mRNA-5'-untranslatierten Region (UTR) bezeichnet IRES, dem Carboxy-terminalen Ende mit eIF4G1 eIF4A und dem 43S-Komplex assoziiert. Die Bindung dieser 43S vorge Einleitung complexe IRES leitet die Kappe unabhängige Translation ohne eIF4E Faktor ^2,3.

Schließlich ist ein weiterer Übersetzungsmechanismus noch nicht gut verstanden unterstützt diese CAP-unabhängige Translation Aktivität unter Stressbedingungen über CITE Strukturen innerhalb mRNA UTR ⁴ entfernt.

Durch diese verschiedenen Formen der Übersetzung, die sich um ihre Initiationsschritte spielt Übersetzung eine entscheidende Rolle bei der zellulären Homöostase und jede Änderung in einer dieser Prozesse würde somit beeinflussen den Organismus mit kleinen bis großen Skaleneffekten. In der Tat ist die Einleitung einer geschwindigkeitsbestimmenden Schritt über die richtigen Übersetzungsprozesse von mRNA in Proteine ​​und damit das Ziel von zahlreichen Kontrollen und Regulierungspunkte ^5. Ob es sich für die letztere oder für Komponenten dieser Prozesse, wenn man stellt sich heraus, um defekt zu sein, wird es das vorgegebene Gleichgewicht in der Zelle zu stören und so konnten pathologische bedingungen führengen. In diesem Zusammenhang haben Mutationen in Translationsfaktoren in mehreren Erkrankungen einschließlich neurodegenerativer Störungen wie `Leukoenzephalopathie mit verschwindender weißen Materie' (eIF2B1-5 ^{Untereinheit)} 6, in Walcott-Rallison Syndrom (EIF2AK3 kodierenden Gen ^PERK) 7, potentiell in involviert Parkinson-Krankheit (eIF4G1 p.R1205H) ^8. Es ist daher wichtig, um zelluläre und molekulare Studien dieser mutierten Proteine ​​durchzuführen, um das Wissen über die Entwicklung der Krankheit und dem allgemeinen Verfahren der Translationsinitiation zu erhöhen.

Zur Durchführung dieser Studien ist es wichtig, um die am besten geeigneten Modellen wählen, die Konsequenzen dieser Mutationen beobachten Xenopus laevis Oozyten sind besonders gut aufgrund ihrer physiologischen und biochemischen Eigenschaften angepasst:. Physiologische Synchronizität (in der Phase G2 des Zellzyklus blockiert) , hohe Kapazität der Proteinsynthese (200-400 ng / Tag / Eizelle), hohe Anzahl von extrahierten oocytes aus demselben Tier (800-1.000 Oozyten / weiblich) und der Zellgröße (1,2-1,4 mm Durchmesser), die ihre Handhabung vereinfacht. Mikroinjektion von Xenopus-Oozyten synthetisierte mRNA leicht durchgeführt werden, um die Translation Schritte zu zerlegen. In dieser Ansicht zeigt es andere Vorteile. Angesichts der Geschwindigkeit der Meiose Progression und der Übersetzung nach der mRNA Mikroinjektion (~ 24 Stunden), Xenopus-Oozyten eine schnelle System im Vergleich zu rekonstituierten Zellsystemen (aus E. coli extrahiert, Weizenkeime oder Kaninchen-Retikulozyten ...), in der eine mRNA ist setzten mit einer reduzierten Translationsrate und mit einer niedrigeren Geschwindigkeit. So werden die Auswirkungen einer Mutation in einer mRNA eingeführt schnell beobachtbar und einfach in verschiedenen Oozyten untersucht werden. Ein weiterer Vorteil des Xenopus-Oozyten, dass mütterliche mRNAs sind latent und Proteintranslation vor Progesteron Stimulation blockiert. Zugabe von Progesteron ist ein geeignetes Mittel zur Steuerung des Übersetzungs Induktion. Cytoplasmic polyadenylation nicht während der Oogenese auftreten. Es beginnt bei der Eizellreifung in Progesteron-stimulierten Eizellen in einer zeitlichen Reihenfolge und setzt sich während der frühen Entwicklung und könnte verwendet werden, um die verschiedenen Schritte der Übersetzung zu untersuchen.

Die Polyadenylierung mos mRNA ist unter den ersten, auftreten, und es gehört mit Aurora A / Eg2, histonähnlichen B4 mRNA zur Klasse der "frühen Reifung" Gene als in Charlesworth et al definiert. (2004) ^9. Die Translations Induktion der "späten" mRNA wie Cyclin A1 und Cyclin B1 tritt um die Zeit der Keimbläschen Aufteilung (GVBD). MOS-mRNA kodiert für ein Serin / Threonin-Proteinkinase. Die Übersetzung ist von entscheidender Bedeutung, da sie die MAP-Kinase-Kaskade, die indirekt aktiviert die Eizellreifung induziert. Zwar in Reaktion auf Progesteron, Polyadenylierung mos-mRNA wird durch ein Verfahren mit Aurora A / Eg2 regulatorische Proteine ​​und andere RNA-Bindungsproteine ​​mit verbesserten the 3'UTR mos-mRNA. Diese erhöhte Polyadenylierung mos-mRNA führt zu einer Erhöhung des MOS Proteinebene, die wiederum aktiviert MEK1. Dieser Vorgang vermittelt die Aktivierung von extrazellulären signalregulierten Kinase 2 (ERK2) (Abbildung 1). Diese Signalkaskade kann dann lösen die Reifung M-Phasen-fördernde Faktoren, einen Komplex von Cyclin B und Cdc2 Kinase gebildet und schließlich zu meiotische Wiederaufnahme.

Daher in Xenopus laevis Oozyten, könnte die Untersuchung der mütterlichen mRNA wie MOS leicht verwendet werden, um ihre Translatierbarkeit mit mehreren Endpunkten ihrer effiziente Polyadenylierung der Übersetzung mehrerer MOS-Signalkomponenten, darunter auch die Bestimmung des GVBD Geschwindigkeit testen. Dieses System ist daher interessant, die ersten Folgen von Mutationen in Translationsinitiationsfaktoren ohne Einmischung von neu transkribierten mRNA oder der Transfektionseffizienz zu bewerten, Probleme oft mit eukary vorkommendeOhrzellstudien.

Hier wird ein Protokoll eingesetzt, wo eine Mutante eIF4G1 mRNAs mikroinjiziert in Xenopus laevis Oozyten und die Übersetzung der mütterlichen mRNA getestet. In Gegenwart von einem Defekt in GVBD Progression, mos mRNA Polyadenylierung, die durch die Eizelle meiotischen Zellzyklus und für die nachfolgende Übersetzung der frühen und späten Klasse mRNAs essentiell für Progression ermittelt. Die Phosphorylierung Aurora A / Eg2 und ERK wird auch untersucht, um die Folge der mos deregulation.Thus bestätigen Xenopus-Oozyten, sind ein einfacher Weg, um verschiedene Schritte der mRNA-Translation zu analysieren.

Protokoll

Alle Xenopus Experimente wurden bei der Tierhaltung der Universität Lille 1 nach den Regeln des Gemeinschaftsrahmens des Europäischen (86/609 / EWG) für Labortierversuche durchgeführt. Das Tier-Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission genehmigt (Comité d'Ethique en Experimentieren Animale Nord-Pas-de-Calais, CEEA 07/2010).

1. Oocyte Handhabung

1. Bereiten Sie die Narkoselösung: 1 g Tricainmethansulphonat Pulver in einem 1 l sterilem Wasser.
2. Plunge weiblichen Xenopus laevis in diese Lösung, decken Sie den Becher, um das Entweichen zu vermeiden und warten Sie etwa 45 Minuten für das Tier vollständig sediert werden (ohne Reaktion an einem Bein Pinch).
3. Waschen Sie den Frosch mit Seife und spülen mit Leitungswasser legen Sie dann das Tier auf seinem Rücken auf saubere Aluminiumfolie.
4. Klemmen Sie die Haut des lateralen Teil des Bauches und an der Eierstöcke Ebene mit einer Pinzette.Einen Einschnitt von etwa 1 cm mit einer Schere vor dem Gebrauch mit Ethanol 70% gereinigt. Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt ist tief genug, und die zugrunde liegenden Bauchwand zu Exzision des Eierstockgewebe, in dem mehrere Eizellen in verschiedenen Stadien der Entwicklung zu finden sind erlaubt zu erreichen.
5. Sezieren die Ovar Lappen, wäscht sie 4 mal in einer Petrischale (50 mm) mit ND96-Medium (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 1,8 mM _CaCl 2, 5 mM HEPES auf pH 7,4 mit NaOH, ergänzt mit 50 ug / ml Streptomycin / Penicillin, 225 ug / ml Natriumpyruvat, 30 ug / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 1 & mgr; l / ml Tetracyclin), um alle Spuren von Blut und Trümmer zu entfernen.
   Hinweis: Tetracycline ermöglicht eine optimale Konservierung und eine gute Erholung nach Mikroinjektion Behandlung.
6. Speichern sie in einer Petrischale abgedeckt im Medium bei 14 ° C eingetaucht, so dass ihre Erhaltung für eine Woche.
7. Nähen Sie die Bauchdecke und die Haut mit Tierarzt resorbierbaren tHread und eine Nähnadel (3 oder 4 Maschen notwendig).
8. Legen Sie das Tier in einem Becherglas ohne Wasser und feuchter die Haut mit Leitungswasser, bis der Frosch ist wieder in Bewegung. Das Becherglas, um eine Flucht zu verhindern.
9. Trennen Sie sorgfältig die Eierstöcke Keulen in dem Medium, in Gruppen von 5 bis 10 Oozyten unter Verwendung von 2 Pinzetten unter einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Wählen Oozyten im Stadium VI. Sie können durch i mit einem braunen pigmentierten Tiermast und gelben vegetative Pol durch eine klare Band ii) ihrer Größe besser als 1,2 mm Durchmesser ^{10 getrennt} erkannt werden) ihre Form und Farbe.
10. Während 45 Minuten die ausgewählten Oozyten in einer Collagenase-Lösung (1 mg / ml Collagenase A aus Clostridium histolyticum, in ND96 gelöst, ohne Tetracyclin) in einer Petrischale unter leichtem Schütteln inkubieren, um die Eizelle defolliculation erleichtern (Kollagenase verdaut Eizelle / follikulären Zellverbindungen). Spülung der Oozyten 3 oder 4 mal mit ND96-Medium bei 14 gehalten° C.
    Hinweis: die Oozyten weniger oder mehr als 45 min, da das Risiko von Oozyten Oberflächenproteine ​​zerstören und was eine schlechte Lebensfähigkeit inkubieren nicht. Collagenase-Behandlung kann spontane GVBD induzieren.
11. Oozyten Inkubieren im Medium für 3-4 Std. Entfernen Follikelzellen mit feinen Pinzette unter binokularen Lupe und halten sie bei 19 ° C in ND96 Medium.

2. Herstellung der mRNA-Synthese

1. Linearisieren 5 ug der folgenden Plasmide durch enzymatischen Verdau mit Pme I-Enzym.
   HINWEIS: pcDNA6.2 / V5-DEST, die ein 1599 Aminosäuren eIF4G1 cDNA Wildtyp (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST, die eine eIF4G1 dominant negative cDNA (eIF4G1-DN) mit Mutationen c.2105T > G c.2106A> C, c.2120-> G, c.2122T> A, 2125T> - und c.2126T> G im Bereich der Wechselwirkung zwischen eIF4G1 und eIF4E an Position 612 bis 618 des entsprechenden Proteins störenden Interaktion between eIF4G1 und eIF4E ^8, pcDNA6.2 / C-EmGFP enthält Chloramphenicolacetyltransferase (GFP). Vorzubereiten 2 Mischungen für jede der 3-Plasmiden: Die erste darunter Pme I-Enzym, und die zweite ohne Enzym als Kontrolle.
2. Ausfällung von Plasmid-DNA unter Verwendung eines klassischen Ethanol Verfahren und Resuspendieren in 20 ul Nuklease-freies _H 2 O.
3. Bestimmen Sie die Konzentration mit einem Spektralphotometer. Die Konzentration sollte überlegen sein zu 150 ng / ul an cRNA zu transkribieren.
4. Versuch 1 & mgr; l Proben und deren Steuerungen mit 5 ul Beladungspuffer auf einem 0,8% Agarose-Gel, um die Plasmid-Linearisierung zu verifizieren.
5. Verwenden ein Kit zur in vitro-Transkription und cRNA Reinigung gemß den Herstelleranweisungen. Die transkribierten cRNA werden in 20 & mgr; l Nuklease-freies _H 2 O resuspendiert Proben können bei -80 ° C, wenn erforderlich gespeichert.
6. Bereiten Sie die Migration MOPS 10X-Puffer, der 0,2 M MOPS (pH 7,0), 20 mM Natriumacetat und 10 mM EDTA (pH 8,0). Sterilisieren Lösung mit einem 0,45 um Filter. Aktien des von der Licht bei RT geschützt werden, um Oxidation zu vermeiden Lösung Lösung.
7. Reinigen Sie die Elektrophoresetank nacheinander mit NaOH, HCl und gründlich mit doppelt gefiltertes Wasser für einen O gespült / N, um RNase zu vermeiden und zu verhindern, RNA-Abbau.
8. Werfen ein 1,5% Agarose-Gel mit MOPS und Formaldehyd. Warm bis zur vollständigen Agarose-Auflösung und abkühlen lassen bis 55 ° C. Unter Abzug werden 0,1 Volumen MOPS 10X, 6,6% Formaldehyd und 4 ug Ethidiumbromid (10 mg / ml). Gießen Sie das Gel unter dem Abzug und warten Sie etwa 1 Stunde für das Gel zu härten.
   Hinweis: Formaldehyd und Ethidiumbromid sind giftig.
9. Vorbereitung der Proben für die Migration in einem 0,2-ml-Röhrchen mit 1 ul cRNA, 8,8% Formaldehyd, 60% Formamid und 0,1 Volumen MOPS 10X. Inkubation für 3 min bei 70 ° C und legte die Röhrchen auf Eis für 10 min. Centrifuge Proben paar Sekunden auf5.000 x g. In 2 ul Gelladepuffer.
   Hinweis: Formamid ist giftig.
10. Laufen Proben für 20 min bei 90V. Tränken Sie das Gel in Nuklease-freies _H 2 OO / N, um das Gel vor der Analyse ist es, die Qualität zu überprüfen cRNA entfärben.
11. Bestimmen Sie cRNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und lagern Sie sie bei -80 ° C.

3. Mikroinjektion von synthetisierten RNA und Eizellen Reifung Stimulation

1. Bereiten Sie die notwendige Ausrüstung für Eizellen Mikroinjektion. Verwenden Sie einen Mikropipette Abzieher für kleine Glaskapillare zu ziehen. Unter Stereomikroskop, brechen Sie das Ende der Kapillare mit der Pinzette, um ein stumpfes Ende zu schaffen. Füllen der Kapillare Mikropipette mit Mineralöl unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einem Millipore-Filter 0,45 um am gegenüberliegenden Ende. Montieren Sie die Mikropipette auf die Mikroinjektion Pipette. Wählen Sie eine genaue Mikropipette vom Hersteller kalibriert, um eine gute Genauigkeit, wenn sie mit entsprechenden Glaskapillare verwendet zu geben.
2. Führen Sie die Mikroinjektion 1-2 Stunden nach defolliculation, notwendige Verzögerung für Eizelle Erholung an Eizellen gehalten bei 14 ° C. Verwenden Petrischalen mit dem Boden kratzte mit einer Pinzette, um eine Klebefläche für Eizellen zu erstellen und füllen sie mit ND96 Medium.
3. Ordnen Oozyten entlang einem Kratzspur in einer Petrischale ermöglicht eine sukzessive Injektion von Oozyten mit der Kapillare Mikropipette in einem Winkel von 45 ° C.
4. Injizieren in die Oozyte Äquatorialzone unterhalb der pigmentierten Tierbereich für eine optimale Diffusion der Proben im Zytoplasma. Legen Sie nur den dünnsten Teil der Kapillarspitze auf etwa 150-200 & mgr; m Tiefe.
5. Injizieren 30 ng cRNA von den verschiedenen Plasmiden in einem Volumen von 60 nl in einer ersten Oozyte jeweils erhalten. Nach der Injektion, warten Sie 5-10 Sekunden, bevor Sie die Kapillarspitze zu Proben escape (2A) zu vermeiden.
   Hinweis: Nehmen Sie 120 nl nicht überschreiten. Spritzen Sie so langsam, wie Sie können. Ein Steuer mit destilliertem Wasser wird empfohlen.
6. Verschieben Sie manuell die Petrischale, um die nächste Eizelle zu injizieren.
   Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Spitze nicht durch die Erzeugung eines kleinen Impulses aus dem Bad-Lösung nach 2 bis 3 Mikroinjektionen verstopft.
7. Übertragungs injizierten Oozyten in 24 Vertiefungen-Kulturplatten (10 Oocyten / Vertiefung) werden mit 3 ml frischem ND96 Medium gefüllt und lassen sie auf 19 ° C.
8. Die Eizellen in ND96 inkubieren mit Progesteron (PG) (2 ug / ml) zu der meiotischen Reifung (GVBD) bei 19 ° C ausgelöst werden, 15 Stunden oder 4 Stunden nach der Mikroinjektion von polyadenylierter cRNAs jeweils von pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 und pcDNA6 erhalten .2 / C-EmGFP verwendet als Kontrolle (Abbildung 2A).
   Anmerkung: Co-Injektion von Fluoreszenzmarker mit der cRNA ist ein schönes Werkzeug, um sicherzustellen, dass die cRNA injiziert wurde und blieb in der Oocyte. Zuführen, Vorversuchen unter Verwendung eines cRNA von Interesse mit einem GFP-Tag.
9. Microinject wie in # 3.5 unterschiedlichen Verhältnissen (1: 3, 2: 2; 3: 1) von polyadenyliert eIF4G1-WT und eIF4G1-DN cRNAs um test die Übersetzung Wirkung eIF4G1-WT cRNAs auf dem mutierten Phänotyp (2D).

4. Keimbläschen Pannen Bestimmung

1. Zählen Sie die Anzahl der reifen Eizellen nach der PG-Stimulation durch die Beobachtung der Gegenwart von einem weißen Fleck auf der schwarzen Tiermast mit einem Stereomikroskop. Wiederholen Sie das Zählen jede Stunde bis zum vierundzwanzigsten Stunde (2B, 2C).

5. Western Blot (WB) Analyse

1. Homogenisierung der Gruppe von 10 Oozyten von Hin- und Herbewegungen mit einer Mikropipettenspitze, bei 4 ° C in 200 & mgr; l in dem folgenden Puffer: 50 mM Hepes, pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,05% SDS, 5 mM MgCl _{2, 1} mg / ml Rinderserumalbumin, 10 mg / ml Leupeptin, 10 mg / ml Aprotinin, 10 mg / ml Sojabohnen-Trypsininhibitor, 10 mg / ml Benzamidin, 1 mM PMSF, 1 mM Natriumvanadat.
2. Zentrifuge Proben für 15 min bei 10.000 × g, um das Lipid (obere Phase) und der Membran (untere Phase) f entfernenractions. Sammeln Sie die cytoplasmatische Fraktion, speichern eines Aliquots auf Proteinkonzentration zu bestimmen, und die restlichen mit Laemmli oder ein Bis-Tris-Probenpuffer (1: 1).
   Anmerkung: Bis-Tris Gelen und Ladepuffer einen neutraleren pH die Proteine ​​durch Hydrolyse schützt
3. Wärme 20 ug Probe bei 95 ° C für 10 min. Laden jeder Probe in die Vertiefungen der Acrylamidgel. Legen Sie das Gel in einem Behälter mit geeigneten Puffer.
4. Führen eine Elektrophorese für 1 h bei 200 V.
5. Realisieren WB in TBS pH 8,0 (Tris HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween 0,1%, das 10% Rinderserumalbumin) mit einem Ziege-Anti-Aurora-A / Eg2 (1: 3000, 2 h) oder mit Kaninchen-Anti -Aurora A / Eg2-P (1: 1000, O / N bei 4 ° C), Maus-anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), Ziege-anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 h ), Kaninchen-Anti-mos (1: 5000, 4 h), Kaninchen-Anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use Antikörper Maus-anti-V5 (1: 10.000, 2 h) und Kaninchen-Anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (als Lade Kontrollen).
6. Washdie Membran 3 x 10 min in TBS-Tween und inkubiere 1 h entweder mit einem Anti-Maus oder Anti-Kaninchen oder Anti-Ziege (IgM) Meerrettichperoxidase-markierter sekundärer Antikörper in Verdünnungen von 1: 5.000, 1: 7.500 bis 1 : 5,000 auf.
7. Führen Sie 3 Waschungen von 10 min in TBS-Tween und erfassen die Antigen-Antikörper-Komplexe mit dem Advanced ECL-Nachweissystem.

6. Polyadenylierung Assay

1. Probe 5 Oozyten pro Bedingung in einem 1,5 ml. Mit 1 ml Nuklease-freies PBS 1X (pH 7,4) waschen. Die folgenden Schritte werden unter Abzug durchgeführt werden.
2. Auszug RNA unter Verwendung eines klassischen organischen Verfahren (siehe Anweisungen des Herstellers).
3. Erholen RNA durch Zentrifugation (10.000 × g) für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und an der Luft trocknen RNA für 10 min.
4. Resuspendieren RNA-Pellet in 30 & mgr; l Nuklease-freies _H 2 O.
5. Nehmen Sie 15 ul der Proben in ein neues Röhrchen und fügen Sie 85 ul Nuklease-freies _H 2 O. Bereinigen Sie diese Proben, um ihre Qualität zu Spalte Kieselsäure ist nach den Anweisungen des Herstellers zu verbessern. Elution der RNA unter Verwendung von 30 ul Nuklease-freies _H 2 O
6. Versuch 1 ul-Proben mit 5 ul Beladungspuffer auf einem 0,8% Agarose-Gel, um die RNA-Integrität zu überprüfen.
7. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
8. Vorzubereiten 2 Ligierungsgemische pro Bedingung (dh eIF4G1-WT, eIF4G1-DN _und die H 2 O-Kontrolle) mit den folgenden Reagenzien: 10 U RNA-Ligase, 0,1 Volumen 10x-Puffer, 1 mM ATP, 10% PEG8000 50% 0,1 ug Primer P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') ¹¹ und bringen das Endvolumen auf 10 ul mit Nuklease-freiem _H 2 O. Hinzufügen in dem ersten Gemisch aus RNA Oozyten ohne PG-Stimulation erhalten und in der zweiten Mischung RNA aus PG erhalten stimuliert Oozyten.
9. Inkubation für 1 h bei 37 ° C dann 20 min bei 65 ° C, um das Enzym zu inaktivieren.
10. Unsea cDNA Reverse Transkription (RT) Kit. Bereiten Sie die RT-Mischung, je Rohr: 0,1 Volumen 10X RT-Puffer, 0,1 ug Primer P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) ^{10, 4} mM dNTP-Mischung, 50 U der reversen Transkriptase und komplett mit Nuklease-freies _H 2 O auf ein Endvolumen von 10 & mgr; l. Zugabe von 10 ul Ligationsreaktions zuvor erhaltenen. Führen Sie die RT unter dem vom Hersteller beschriebenen Bedingungen.
11. Vorbereitung Polymerase Chain Reaction (PCR), die aus je Röhrchen: 0,1 Volumen Puffer 10X, 1,5 mM MgCl _2, 133 & mgr; M dNTP-Gemisch, 0,2 uM spezifischen Primer, 0,2 & mgr; M Primer P2, 0,025 U Taq-Polymerase, 1 & mgr; l cDNA und komplett mit Nuklease-freies _H2 O auf ein Endvolumen von 50 ul. Führen Sie die PCR unter den folgenden Bedingungen: 50 ° C für 2 min, 95 ° C für 10 min, [95 ° C für 1 min, 56 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 s] * 40 Zyklen, 72 ° C für 10 ^min 9. Die spezifischen Primer sind wie folgt: mos, GTTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA Histon-ähnlichen B4, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; Cyclin A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Cyclin B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT ^9.
12. Bereiten Sie einen 3% igen Agarosegel. Fügen Sie in jeder PCR-Produkte 10 ul Auftragspuffer. Führen Sie das Gel mit 10 ul der Proben bei 110 V für eine optimale Migration. Analyse des Gels nach 10 und 20 Minuten, um eine Änderung der Größe des Reflexions Länge des Schwanzes poly (A) und somit der RNA-Reifung, die eine Voraussetzung für die Übersetzung ist zu beobachten.

Ergebnisse

Kinetic Reifung des Xenopus-Oozyten und die Bestimmung des Prozent Eizelle GVBD nach 24 Stunden von PG-Stimulation (2B, 2C):

Um die translatorische Folgen der eIF4G1-DN Genmutationsversuch die Reaktion auf PG in Xenopus laevis Oozyten mit cRNA eIF4G1-DN mikroinjiziert wird eIF4G1-WT und auf andere Steuerbedingungen (H _{2 O,} GFP) verglichen. Die Kontrollen zu ermöglichen, das Auftreten von Oozyten Mikroinjektion unabhängig von der Art des eingesp...

Diskussion

Translation ist ein Mechanismus in der Pathophysiologie von zahlreichen menschlichen Erkrankungen einschließlich mehreren neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Zum Beispiel in der Parkinson-Krankheit mehrere Berichte vorgeschlagen, die Wertminderung in der Übersetzung mit erblichen Mutationen ^8,12,13 verbunden.

Mehrere zelluläre Modelle stehen zur Verfügung, um die Translation zu studieren. Hier wird, um die translatorische Folgen einer Mutation in eIF4G1, die als dominan...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine methane sulphonate	Sandoz	MS-222	oocytes handling
Forceps	Moria	Dumont MC40
Streptomycin/penicillin	Sigma	781
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Tetracyclin	Sigma	T7660
Veterinarian absorbable Vicryl thread	Johnson&Johson Intl	JV1205
Collagenase A	Roche diagnostics	10103586001
PmeI	New England Biolabs	R0560S	Preparation of synthetic mRNA
DNAse/RNAse free H2O	Life Technologies	10977
Sodium Acetate	Merck	6268
Absolute ethanol	Sigma	02854
Nano Drop	Thermo Scientific
TBE 10X	Eppendorf	0032006.507
Ethidium bromide 10 mg/ml	Life Technologies	15585-011
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion by Life Technologies	AM1344
MOPS	Sigma	M1254
EDTA	Fluka	03609
Agarose	Life Technologies	16500-500
Formaldehyde 37%	Merck	1.04003.1000
Formamide	Fluka	47671
Gel Doc Imager	Biorad
Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-510-X	microinjection
Replacement Glass 8"	Drummond Scientific Company	3-000-210-G8
0.45 µm filter	Millipore	SLHA025NB
Progesterone	Sigma	P0130
Hepes	Sigma	H3375	Western Blot
NaCl	Sigma	S5886
SDS	Biorad	161-0301
MgCl2	Sigma	A3294
Bovine serum albumin	Sigma	A4612
leupeptin	Sigma	L8511
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6506
PMSF	Sigma	P7626
sodium vanadate	Sigma	S6508
Laemmli buffer	Biorad	161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well	Life Technologies	NP0323BOX
SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX	Biorad	456-1036 and -1096
horizontal semi-dry blotting system	W.E.P. Compagny
Glycine	Biorad	161-0718
Tris-HCl	Biorad	161-0719
Hybond ECL Membrane	Amersham Life Science	10401180
Methanol	VWR	20846-292
Ponceau Red (0.5%)	Sigma	P3504
Tween 20	Sigma	P2287
anti-GFP	Life Technologies	A11122
anti-V5	Santa Cruz Biotechnology	sc-58052
anti-Eg2	Santa Cruz Biotechnology	sc-27884
anti-Eg2-P	Cell Signaling	C39D8
anti-ERK2	Santa Cruz Biotechnology	sc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7976
anti-Rsk	Santa Cruz Biotechnology	sc-231
anti-mos	Santa Cruz Biotechnology	sc-86
anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2812
anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2378
Advanced ECL Detection System	Amershan Life Science	RPN2135
PBS 1x	Sigma	P4417	polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)	Qiagen	79306
Chloroform	Sigma	31998-8
Isopropanol	Sigma	278475-1L
RNeasy mini kit	Qiagen	74106
RTL buffer	Qiagen	79216
RNAse free DNAse set	Qiagen	79254
Primers	Eurogentec
T4 RNA ligase 1	New England Biolabs	M0204S
High capacity c-DNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems, Life Technologies	4368813
Taq polymerase	Life Technologies	10342020