Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Resumo

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Resumo

A síntese de proteínas é um processo fundamental para a expressão do gene impactando processos biológicos diversos, nomeadamente de adaptação a condições ambientais. A etapa de iniciação, que envolve a montagem das subunidades ribossomais no mRNA codão de iniciação, fator de iniciação envolvidos, incluindo eIF4G1. Defeitos neste passo limitante da taxa de tradução estão ligados a diversos distúrbios. Para estudar as consequências potenciais de tais desregulamentações, oócitos de Xenopus laevis constituem um modelo atraente com um alto grau de conservação dos mecanismos celulares e moleculares essenciais com humano. Além disso, durante a maturação meiótica, os oócitos são transcriptionally reprimida e todas as proteínas necessárias são traduzidos do pré-existentes, mRNAs maternos. Este modelo de baixo custo permite mRNA exógena para tornar-se perfeitamente integrado com uma tradução eficaz. Aqui é descrito um protocolo para avaliação de tradução com um fator de interesse (aqui eIF4G1) usando stored ARNm materno que são as primeiras a ser traduzido poliadenilado e durante a maturação do oócito como uma leitura fisiológico. Em primeiro lugar, o ARNm sintetizado por transcrição in vitro de plasmídeos de interesse (aqui eIF4G1) são injectados em oócitos e cinética de maturação dos oócitos por detecção de ruptura da vesícula germinal está determinada. O alvo de ARNm materno estudado é a serina / treonina-proteína MOS-quinase. Sua poliadenilação e sua subsequente tradução são investigados juntamente com a expressão e fosforilação de proteínas das mos cascata de sinalização envolvidos na maturação do oócito. Variações do protocolo atual de apresentar defeitos translacionais também são propostos para enfatizar a sua aplicabilidade geral. À luz da evidência de que a síntese de proteína aberrante pode estar envolvido na patogénese de desordens neurológicas emergente, um tal modelo proporciona a oportunidade de avaliar facilmente essa deficiência e identificar novos alvos.

Introdução

As proteínas são elementos essenciais da vida celular e, portanto, em maior escala do organismo. Eles garantem a maioria das funções celulares, incluindo a estrutura, o transporte, a catálise da reacção, a regulação, a expressão do gene, etc. A expressão é o resultado de um complexo mecanismo de tradução permitindo a conversão de um ARNm em proteína. A tradução é submetido a vários controlos para adaptar e para regular a expressão de genes de acordo com as necessidades das células, durante o desenvolvimento e a diferenciação, envelhecimento, stress fisiológico ou manifestações patológicas.

A tradução é dividido em 3 fases (iniciação, alongamento e terminação) e apresenta 3 sistemas de tradução de iniciação, a fim de responder a essas necessidades: dependente da tampa, independente-cap via Segmento Ribossomo Entrada interno (IRES) Estruturas e realçadores de tradução cap-Independent ( CITE).

A maioria dos mRNA eucarióticas são traduzidos em um tampão-Dependent maneira através da tampa de 5'-trifosfato de 7-metilguanosina, que serve como uma função de reconhecimento, durante a síntese de proteínas. Este tampão liga-se a eIF4E, um componente do complexo eIF4F com eIF4G1 e eIF4A. Associado com outros parceiros como poli (A) Binding Protein (PABP), eIF2 ^{GTP-Met-Met-ARNt,} estes factores de iniciação da tradução do mRNA permitir a circularizar e melhorar a sua acessibilidade para as formas 43S complexo de iniciação até que o codão AUG reconhecimento ^1. Este caso corresponde ao fim da iniciação da tradução ou seja, o primeiro passo de tradução.

Tradução independente de Cap é usado por codificação de mRNA para as proteínas essenciais em condições de tensão que induzem para a proliferação celular e apoptose instância. Este mecanismo envolve estruturas secundárias no ARNm 5'-região não traduzida (UTR) chamado IRES, a extremidade carboxi-terminal de eIF4G1 associado com o complexo eIF4A e 43S. A ligação deste 43S pré-iniciação complex para IRES inicia a tradução tampão independente, sem a necessidade de um factor de ^2,3 eIF4E.

Por fim, outro mecanismo de tradução ainda não é bem compreendida suporta esta atividade tradução independente-tampão em condições de tensão via CITE estruturas localizadas dentro de mRNA UTR ^4.

Através destes diferentes modos de tradução que diferem em suas etapas de iniciação, tradução desempenha um papel crítico na homeostase celular e alterações em qualquer um destes processos, assim, teria impacto do organismo com pequena para efeitos de grande escala. Na verdade, o início é um passo limitante da taxa que rege os processos de tradução corretas de mRNA em proteínas e é, portanto, alvo de inúmeros controles e pontos de regulação ^5. Se é para o último ou para os componentes desses processos, se acaba por ser defeituoso, ele vai perturbar o equilíbrio estabelecido na célula e, portanto, poderia levar a condi patológicações. Neste contexto, as mutações em fatores de conversão ter sido envolvido em várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, tais como `Leucoencefalopatia com desaparecer matter' branco (eIF2B1-5 ^subunidade) 6, na síndrome de Walcott-Rallison (gene que codifica para EIF2AK3 ^PERK) 7, potencialmente doença (eIF4G1 p.R1205H) de Parkinson ^8. Por conseguinte, é importante a realização de estudos celulares e moleculares destas proteínas mutantes para aumentar o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento da doença e em geral o processo de iniciação da tradução.

Para realizar esses estudos, é essencial para escolher os modelos mais adequados para observar as consequências dessas mutações oócitos de Xenopus laevis são particularmente bem adaptado devido às suas propriedades fisiológicas e bioquímicas:. Sincronicidade fisiológica (bloqueado na fase G2 do ciclo celular) , elevada capacidade de síntese de proteína (200-400 ng / dia / oócito), elevado número de OOC extraídaytes a partir de um mesmo animal (800-1.000 oócitos / feminino) e o tamanho das células (1,2-1,4 mm de diâmetro), o que facilita a sua manipulação. A microinjecção de oócitos de Xenopus com ARNm sintetizado pode ser facilmente realizada para dissecar passos de tradução. Neste ponto de vista, apresenta outras vantagens. Dada a velocidade de progressão da meiose e da tradução do mRNA após microinjecção (~ 24 h), oócito de Xenopus representa um sistema rápido em comparação com os sistemas celulares reconstituídos (extraído de E. coli, germes de trigo ou de reticulócitos de coelho ...) em que um ARNm é traduzida com uma taxa de tradução reduzida e a uma velocidade mais baixa. Assim, os efeitos de uma mutação introduzida em um ARNm irá ser rapidamente e facilmente observável estudada em vários ovócitos. Outra vantagem de oócitos de Xenopus é que mRNAs maternas são latentes e tradução da proteína é bloqueada antes da estimulação progesterona. A adição de progesterona é, portanto, um bom meio de controlar a indução de tradução. Citoplasmática pO olyadenylation não ocorrer durante a oogenese. Inicia-se durante a maturação de oócitos em oócitos de progesterona estimulada por em uma ordem temporal e continua durante todo o desenvolvimento precoce e pode ser usado para estudar as diferentes etapas de tradução.

A poliadenilação do mRNA é mos entre os primeiros a ocorrer e que pertence Aurora com A / EG2, Histone-Like B4 mRNA para a classe de genes "de maturação precoce", definidas na Charlesworth et al. (2004) ^9. A indução da tradução do mRNA "final", como ciclina A1 e B1 Cyclin ocorre em torno do tempo de rompimento da vesícula germinativa (GVBD). Mos ARNm codifica uma cinase serina / treonina-proteína. Sua tradução é crucial, uma vez que induz a quinase MAP cascata que indiretamente ativa a maturação do oócito. Com efeito, em resposta à progesterona, poliadenilação do ARNm MOS é reforçada através de um processo que envolve Aurora A / EG2 proteínas reguladoras e outras proteínas de ligação de ARN com the 3? UTR do mRNA de MOS. Este aumento de poliadenilação do ARNm MOS leva a um aumento do nível de proteína MOS, que por sua vez activa MEK1. Este processo medeia a activação da sinalização extracelular regulada-quinase 2 (ERK2) (Figura 1). Esta cascata de sinalização pode então provocar o M-fase de maturação promover factores, um complexo formado pela ciclina B e cdc2-quinase, e, eventualmente, resulta no recomeço da meiose.

Portanto, em oócitos de Xenopus laevis, o estudo de ARNm maternais como MOS pode ser facilmente utilizado para testar a sua possibilidade de tradução com vários parâmetros da sua poliadenilação eficiente para a tradução de vários componentes MOS de sinalização, incluindo também a determinação da taxa de GVBD. Este sistema é, portanto, interessante para avaliar as primeiras conseqüências de mutações nos fatores de iniciação da tradução, sem interferência do mRNA recentemente transcrito ou de eficiência de transfecção, os problemas que ocorrem frequentemente com eukaryestudos com células óticas.

Aqui, um protocolo é estabelecido onde mRNAs eIF4G1 mutantes são microinjeção em oócitos de Xenopus laevis ea tradução do mRNA materno é testada. Na presença de um defeito na progressão GVBD, mos de poliadenilação do ARNm que é essencial para a progressão através do ciclo celular meiótica dos oócitos e para o subsequente tradução de mRNAs precoces e tardios classe é verificada. A fosforilação Aurora A / EG2 e ERK também é estudada para confirmar a consequência da mos deregulation.Thus, oócitos de Xenopus representam uma forma simples de analisar diferentes etapas de tradução do mRNA.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de Xenopus no biotério da Universidade de Lille 1 de acordo com as regras estabelecidas nas orientações do Conselho da Comunidade Europeia (86/609 / CEE) para a experimentação em animais de laboratório. O protocolo animal foi aprovado pelo comitê de ética local (Comité d'en Ethique Experimentação Animale Nord-Pas-De-Calais, CEEA 07/2010).

1. Manipulação de Oócitos

1. Preparar a solução anestésica: dissolver 1 g de metano-sulfonato tricaina pó em um 1 L de água estéril.
2. Xenopus laevis fêmea de imersão nesta solução, cobrir o copo para evitar a fuga e esperar cerca de 45 min para o animal a ser completamente sedado (sem qualquer reacção a uma pitada perna).
3. Lave o sapo com sabão e enxaguar com água da torneira, em seguida, colocar o animal em sua parte traseira em papel alumínio limpo.
4. Prenda a pele da parte lateral do abdômen e no nível ovários com uma pinça.Faça uma incisão de aproximadamente 1 cm com uma tesoura limpos antes do uso com etanol 70%. Certifique-se de que a secção é suficientemente profunda e para alcançar a parede abdominal subjacente para permitir a excisão de tecido de ovário, em que são encontrados vários oócitos em vários estágios de desenvolvimento.
5. Dissecar as lóbulos ovário, lavá-los 4 vezes numa placa de Petri (50 mm) com meio ND96 (mM de NaCl 96, KCl 2 mM, 1 _mM de MgCl2, 1,8 mM de CaCl _2, 5 mM de HEPES ajustado para pH 7,4 com NaOH, suplementado com 50 ug / ml de estreptomicina / penicilina, 225 ug / ml de piruvato de sódio, 30 ug / ml de inibidor de tripsina de soja, 1 ul / ml de tetraciclina) para remover todos os vestígios de sangue e detritos.
   Nota: Tetraciclina permite uma conservação óptima e uma boa recuperação após o tratamento de microinjeção.
6. Armazená-los em uma placa de Petri cobertas submerso no meio a 14 ° C, permitindo a sua conservação durante uma semana.
7. Costure a parede abdominal ea pele com o veterinário absorvível thread e uma agulha de sutura (3 ou 4 pontos será necessária).
8. Colocar o animal em um copo sem água e úmido a pele com água da torneira até que a rã está se movendo novamente. Tapar o copo para impedir a fuga.
9. Separa-se cuidadosamente os lóbulos de ovário no meio em grupos de 5 a 10 oócitos utilizando 2 pares de pinças sob um estereomicroscópio com uma ampliação de 10 vezes. Seleccione ovócitos na fase VI. Eles podem ser reconhecidos por i) a sua forma e cor com um polo animal com pigmento castanho e polo vegetativo amarelo separado por uma correia claro ii) o seu tamanho superior a 1,2 mm de diâmetro, ^10.
10. Incubar os oócitos seleccionados de uma solução de colagenase (1 mg / ml de colagenase A de Clostridium histolyticum, dissolvido em ND96 sem tetraciclina) numa placa de Petri com agitação suave durante 45 minutos para facilitar a defolliculation oócito (colagenase digere conexões de células foliculares de oócitos /). Lavar o oócitos 3 ou 4 vezes com meio mantido a 14 ND96° C.
    Nota: Não incube os oócitos menos ou mais de 45 min, devido ao risco de destruição de proteínas de superfície do oócito e de causar viabilidade pobres. Tratamento de colagenase pode induzir GVBD espontânea.
11. Incubar oócitos no meio durante 3-4 horas. Remover as células foliculares com uma pinça fina sob lupa binocular e mantê-los a 19 ° C em meio ND96.

2. Preparação de ARNm Síntese

1. 5 ug de linearizar os seguintes plasmídeos por digestão enzimática com PmeI enzima.
   NOTA: pcDNA6.2 / V5-DEST contendo um aminoácidos eIF4G1 cDNA tipo selvagem 1599 (eIF4G1-WT; NM_198241), pcDNA6.2 / V5-DEST contendo um cDNA negativo dominante eIF4G1 (eIF4G1-DN) com mutações c.2105T > L c.2106A> C, c.2120-> L, c.2122T> A, 2125T> - e c.2126T> G na região de interacção entre eIF4G1 e eIF4E na posição 612 a 618 da proteína correspondente a perturbar interação between eIF4G1 e eIF4E ^8, pcDNA6.2 / C-EmGFP contendo cloranfenicol acetil-transferase (GFP). Preparar 2 misturas de cada um dos plasmídeos 3: o primeiro incluindo PmeI enzima e a segunda enzima, sem como controlo.
2. Precipitar o DNA de plasmídeo utilizando um procedimento clássico de etanol e ressuspender-lo em 20 ul de H-nuclease livre ₂ O.
3. Determinar a sua concentração, utilizando um espectrofotómetro. A concentração deve ser superior a 150 ng / mL para transcrever ARNc.
4. Corra 1 ul de amostras e os controlos, com 5 ul de tampão de carregamento num gel de agarose 0,8% para verificar a linearização do plasmídeo.
5. Usar um kit de transcrição in vitro e purificação de ARNc de acordo com as instruções do fabricante. Os transcritos de ARNc foram ressuspensas em 20 ul de H-nuclease livre ₂ O. As amostras podem ser armazenadas a -80 ° C se necessário.
6. Preparar o tampão de MOPS 10X migração contendo MOPS 0,2 M (pH 7,0), 20 mAcetato de sódio M e EDTA 10 mM (pH 8,0). Esterilizar solução com um filtro de 0,45 um. Estocar a solução protegido contra a luz à temperatura ambiente para evitar solução de oxidação.
7. Limpe o tanque de eletroforese sucessivamente com NaOH, HCl e cuidadosamente lavados com água duplamente filtrada para um O / N para evitar RNase e evitar a degradação do RNA.
8. Fundido num gel de agarose a 1,5% contendo MOPS e formaldeído. Aqueça até a dissolução completa agarose e deixe esfriar até 55 ° C. Sob hotte, adicionar 0,1 volumes de MOPS 10X, 6,6% de formaldeído e 4 ug de brometo de etídio (10 mg / mL). Despeje o gel sob a coifa e esperar cerca de 1 hora para o gel para endurecer.
   Nota: O formaldeído e o brometo de etídio são tóxicos.
9. Preparar as amostras para a migração de um tubo de 0,2 mL com 1 mL de ARNc, 8,8% de formaldeído, 60% de formamida e 0,1 volumes de MOPS 10X. Incubar durante 3 min a 70 ° C e colocar os tubos em gelo durante 10 min. Centrifugar as amostras poucos segundos a5.000 x g. Adicionar 2 mL de tampão de carga de gel.
   Nota: Formamida é tóxico.
10. Execute amostras durante 20 minutos a 90V. Mergulhe o gel em livre de nuclease _H 2 OO / N para destain o gel antes de analisá-lo para verificar a qualidade cRNA.
11. Determinar a concentração de cRNA utilizando um espectrofotómetro e armazená-las a -80 ° C.

3. microinjeção de RNA sintetizado e Oócitos Maturação Estimulação

1. Prepare o equipamento necessário para oócitos microinjeção. Use um extrator micropipeta para puxar pequeno capilar de vidro. Sob microscópio estereoscópico, parta a extremidade do capilar com a pinça para criar uma extremidade romba. Encher a micropipeta capilar com óleo mineral utilizando uma seringa de 1 mL com um filtro Millipore de 0,45 um na extremidade oposta. Montar o micropipeta na pipeta microinjecção. Escolha uma micropipeta preciso calibrado pelo fabricante para dar boa precisão quando usado com capilar de vidro adequado.
2. Realizar microinjecção 1-2 horas após defolliculation, o atraso necessário para a recuperação de oócitos em oócitos mantida a 14 ° C. Use pratos de Petri com o fundo raspado com uma pinça para criar uma superfície adesiva para oócitos e preenchê-las com meio ND96.
3. Dispor oócitos ao longo de uma pista raspadas em uma placa de Petri que permite uma injecção de oócitos com sucessivo a micropipeta capilar a um ângulo de 45 ° C.
4. Injectar na zona equatorial do oócito, abaixo da área de animais pigmentada para uma difusão óptima de amostras no citoplasma. Insira apenas a parte mais fina da ponta capilar em cerca de 150-200 mm de profundidade.
5. Injectar 30 ng de ARNc obtido a partir de, respectivamente, os plasmídeos diferentes num volume de 60 nl de uma primeira oócito. Após a injecção, esperar durante 5-10 segundos antes de remover a ponta capilar para evitar a fuga da amostra (Figura 2A).
   Nota: Não exceda 120 nl. Injectar tão lentamente quanto você puder. Um controlo com água destilada é recomendado.
6. Mova manualmente a placa de Petri para injetar o próximo oócito.
   Nota: Certifique-se de que a ponta não está obstruído, gerando um pequeno impulso para fora da solução do banho após 2 a 3 microinjeções.
7. Transferência de oócitos injectados em placas de cultura de 24 poços (10 oócitos / poço) encheu-se com 3 ml de meio fresco ND96 e deixá-los a 19 ° C.
8. Incubar os oócitos em ND96 com progesterona (PG) (2 ug / ml) para induzir a maturação meiótica (GVBD) a 19 ° C, 15 horas ou 4 horas após a micro-injecção de ARNc poliadenilados obtidos respectivamente a partir de pcDNA6.2 / V5-DESTeIF4G1 e pcADN6 .2 / C-EmGFP utilizado como um controlo (Figura 2A).
   Nota: A co-injecção de marcador fluorescente com o ARNc é um bom instrumento para assegurar que o cRNA foi injectado e permaneceu no oócito. Realizar tais experimentos preliminares usando um cRNA de interesse com uma tag GFP.
9. Microinject como em diferentes proporções # 3.5 (1: 3, 2: 2, 3: 1) de poliadenilado eIF4G1-WT e eIF4G1-DN cRNAs, a fim de ter o efeito da conversão de ARNc eIF4G1-WT no fenótipo mutante (Figura 2D).

4. Germinal Vesicle Breakdown Determinação

1. Contar o número de oócitos maduros após estimulação PG observando a presença de um ponto branco no pólo animal branco com um estereomicroscópio. Repita a cada hora a contar até vinte e quatro horas (Figura 2B, 2C).

5. Western Blot (WB) Análise

1. Homogeneizar o grupo de 10 oócitos por trás e por diante movimentos com uma ponta de micropipeta, a 4 ° C em 200 ul no tampão seguinte: 50 mM de Hepes, pH 7,4, NaCl 500 mM, 0,05% de SDS, 5 _mM de MgCl2, 1 mg / ml de albumina de soro bovino, 10 mg / ml de leupeptina, 10 mg / ml de aprotinina, 10 mg / ml de inibidor de tripsina de soja, 10 mg / mL de benzamidina, 1 mM de PMSF, 1 mM de vanadato de sódio.
2. Centrifugar as amostras durante 15 min a 10000 xg para remover o lípido (fase superior) e a membrana (fase inferior) fractions. Recolher a fracção citoplasmática, armazenar uma aliquota para determinar a concentração de proteína e completar o restante com Laemmli ou um tampão de amostra bis-Tris (1: 1).
   Nota: Gel Bis-Tris e o tampão de carga tem um pH mais neutro, que protege as proteínas a partir da hidrólise
3. Aquecer 20 ug de amostra a 95 ° C durante 10 min. Carregar cada amostra nos poços do gel de acrilamida. Colocar o gel num tanque com um tampão apropriado.
4. Executar uma electroforese durante 1 h a 200 V.
5. Realizar um WB em TBS a pH 8,0 (Tris-HCl 15 mM, NaCl 150 mM, Tween a 0,1%, contendo 10% de albumina de soro de bovino) com um anticorpo de cabra anti-Aurora A / EG2 (1: 3000, 2 horas) ou com um anti-coelho Um -Aurora / EG2-P (1: 1000, O / N a 4 ° C), de ratinho anti-ERK2 (1: 3000, 2 h), de cabra anti-ERK2-P (Tyr204) (1: 3000, 2 hr ), de coelho anti-MOS (1: 5.000, 4 h), de coelho anti-GFP (1: 3000, 2 h) antibodies.Use anticorpos de ratinho anti-V5 (a 1: 10000, 2 h) e de coelho anti-Rsk (1 : 1000, 2 h) (como controlo de carga).
6. lavagema membrana 3 vezes durante 10 min em TBS-Tween e incubar 1 hora quer com um anti-murganho ou anti-coelho ou anti-cabra (IgM) anticorpo secundário rábano marcado com peroxidase a diluições de 1: 5000, 1: 7500 e 1 : 5.000, respectivamente.
7. Faça 3 lavagens de 10 min em TBS-Tween e detectar os complexos antígeno-anticorpos com o sistema de Detecção Avançada ECL.

6. Poliadenilação Assay

1. Amostra 5 ovócitos por condição em um 1,5 ml. Lavá-las com 1 ml de PBS isento de nuclease-1X (pH 7,4). Os passos seguintes serão feitos sob coifa.
2. Extrato de RNA utilizando um procedimento orgânico clássica (veja as instruções do fabricante).
3. Recuperar o ARN por centrifugação (10000 xg) durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ARN secar ao ar durante 10 min.
4. Ressuspender sedimento de ARN em 30 ul de H-nuclease livre ₂ O.
5. Pegue 15 ul de amostras em um novo tubo e adicionar 85 ul de H Nuclease-free _{2 O.} Limpar oAmostras de se melhorar a sua qualidade em coluna de sílica de acordo com as instruções do fabricante. Elui-se o ARN utilizando 30 ul de H-nuclease livre _H2O
6. Corra 1 ul de amostras com 5 ul de tampão de carregamento num gel de agarose 0,8% para verificar a integridade do ARN.
7. Determinar a concentração de ARN utilizando um espectrofotómetro.
8. Preparar 2 misturas de ligação por condição (isto é, eIF4G1-WT, eIF4G1-DN e o _H2O de controlo) com os seguintes reagentes: 10 U de ARN-ligase, 0,1 volume de 10X tampão, ATP 1 mM, 10% de PEG8000 a 50% , 0,1 ug de iniciador P1 (5'-P-GGTCACCTTGATCTGAAGC-NH2-3 ') ¹¹ e levar o volume final para 10 uL com H-nuclease livre _{2 O.} Adicionar no primeiro RNA obtido a partir de oócitos mistura PG sem estimulação e na segunda ARN obtido a partir de mistura de PG estimulada oócitos.
9. Incubar durante 1 hora a 37 ° C e depois durante 20 min a 65 ° C para inactivar a enzima.
10. Nósea cDNA Transcrição Reversa kit (RT). Prepare-se a mistura à temperatura ambiente, por tubo: 0,1 volume de tampão 10X de RT, 0,1 ug de iniciador P2 (5'-GCTTCAGATCAAGGTGACCTTTTT) ^10, uma mistura de dNTP 4 mM, 50 U de transcriptase reversa e completa com Nuclease-livre _H2O para volume final de 10 ul. Adicionar 10 ul de reacção de ligação obtido anteriormente. Realizar a TA sob condições descritas pelo fabricante.
11. Prepare a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) de uma mistura, por tubo: 0,1 volume de tampão 10X, 1,5 mM de MgCl _2, 133 mistura uM de dNTP, 0,2 uM de iniciadores específicos, 0,2 uM de iniciadores P2, 0,025 U de polimerase Taq, 1 ul de ADNc e completa com livre de nuclease _H2O para volume final de 50 ul. Executar a PCR sob as seguintes condições: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, [95 ° C durante 1 min, 56 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg] * 40 ciclos, 72 ° C ^9, durante 10 min. Os iniciadores específicos são os seguintes: G, MOSB4 TTGCATTGCTGTTTAAGTGGTAA histona-like, AGTGACAAACTAGGCTGATATACT; A ciclina A1, CATTGAACTGCTTCATTTTCCCAG; Ciclina B1: GTGGCATTCCAATTGTGTATTGTT ^9.
12. Preparar um gel de agarose a 3%. Adicionar em cada produto de PCR 10 ul de tampão de carga. Submeter o gel com 10 uL de amostras a 110 V para uma migração óptima. Analisar o gel depois de 10 e 20 minutos para observar a mudança de tamanho reflectindo o comprimento da cauda poli (A) e, portanto, a maturação de RNA que é um pré-requisito para a sua tradução.

Resultados

Kinetic maturação de ovócitos de Xenopus e determinação do GVBD percentual de oócitos após 24 horas de estimulação PG (Figuras 2B, 2C):

A fim de estudar as consequências de translação da mutação eIF4G1-DN, a resposta ao PG em oócitos de Xenopus laevis microinjectados com ARNc eIF4G1-DN é comparado com eIF4G1-WT e de outras condições de controlo _(H2O, GFP). Os controlos permitem avaliar a incidência de microinjecção de oócito...

Discussão

A tradução é um mecanismo envolvido na fisiopatologia de numerosas doenças humanas, incluindo várias doenças neurodegenerativas. Por exemplo, na doença de Parkinson vários relatórios sugeriram o comprometimento em tradução associada a mutações hereditárias ^8,12,13.

Vários modelos celulares estão disponíveis para estudar a tradução. Aqui, a fim de estudar as consequências de translação de uma mutação em eIF4G1 que actua como dominante negativo mutação redu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine methane sulphonate	Sandoz	MS-222	oocytes handling
Forceps	Moria	Dumont MC40
Streptomycin/penicillin	Sigma	781
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9128
Tetracyclin	Sigma	T7660
Veterinarian absorbable Vicryl thread	Johnson&Johson Intl	JV1205
Collagenase A	Roche diagnostics	10103586001
PmeI	New England Biolabs	R0560S	Preparation of synthetic mRNA
DNAse/RNAse free H2O	Life Technologies	10977
Sodium Acetate	Merck	6268
Absolute ethanol	Sigma	02854
Nano Drop	Thermo Scientific
TBE 10X	Eppendorf	0032006.507
Ethidium bromide 10 mg/ml	Life Technologies	15585-011
mMESSAGE mMACHINE Kit	Ambion by Life Technologies	AM1344
MOPS	Sigma	M1254
EDTA	Fluka	03609
Agarose	Life Technologies	16500-500
Formaldehyde 37%	Merck	1.04003.1000
Formamide	Fluka	47671
Gel Doc Imager	Biorad
Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-510-X	microinjection
Replacement Glass 8"	Drummond Scientific Company	3-000-210-G8
0.45 µm filter	Millipore	SLHA025NB
Progesterone	Sigma	P0130
Hepes	Sigma	H3375	Western Blot
NaCl	Sigma	S5886
SDS	Biorad	161-0301
MgCl2	Sigma	A3294
Bovine serum albumin	Sigma	A4612
leupeptin	Sigma	L8511
aprotinin	Sigma	A1153
benzamidine	Sigma	B6506
PMSF	Sigma	P7626
sodium vanadate	Sigma	S6508
Laemmli buffer	Biorad	161-0737
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well	Life Technologies	NP0323BOX
SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX	Biorad	456-1036 and -1096
horizontal semi-dry blotting system	W.E.P. Compagny
Glycine	Biorad	161-0718
Tris-HCl	Biorad	161-0719
Hybond ECL Membrane	Amersham Life Science	10401180
Methanol	VWR	20846-292
Ponceau Red (0.5%)	Sigma	P3504
Tween 20	Sigma	P2287
anti-GFP	Life Technologies	A11122
anti-V5	Santa Cruz Biotechnology	sc-58052
anti-Eg2	Santa Cruz Biotechnology	sc-27884
anti-Eg2-P	Cell Signaling	C39D8
anti-ERK2	Santa Cruz Biotechnology	sc-1647
anti-ERK2-P (Tyr204)	Santa Cruz Biotechnology	sc-7976
anti-Rsk	Santa Cruz Biotechnology	sc-231
anti-mos	Santa Cruz Biotechnology	sc-86
anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2812
anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-2378
Advanced ECL Detection System	Amershan Life Science	RPN2135
PBS 1x	Sigma	P4417	polyadenylation assay
TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent)	Qiagen	79306
Chloroform	Sigma	31998-8
Isopropanol	Sigma	278475-1L
RNeasy mini kit	Qiagen	74106
RTL buffer	Qiagen	79216
RNAse free DNAse set	Qiagen	79254
Primers	Eurogentec
T4 RNA ligase 1	New England Biolabs	M0204S
High capacity c-DNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems, Life Technologies	4368813
Taq polymerase	Life Technologies	10342020