מכרסמים מוח Microinjection לחקר מולקולריים מצעים של התנהגות מוטיבציה

Summary

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Abstract

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Introduction

Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli^1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions⁴. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry^3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways^7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry^1,11,12.

While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,¹³ which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,¹⁴ which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles¹⁵ or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.^16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,^18-20 these procedures will not be covered here.

We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.^21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. ^21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,^21,24 we will focus mainly on practical concerns.

Protocol

נהלים הקשורים בנושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה ולדבוק במדריך NIH לטיפול והשימוש בחי מעבדה.

1. הכנת מיישמת לפני הניתוח וMicroinjection

1. הגדרה להכנת חומר:
   1. להשיג 26 צינורות G צינורית, 33 חוט אטם G, 33 צינורות מחט microinjection G, צינורות פלסטיק microinjector (PE20 או שווה ערך), hemostats ישר שני משקל בינוני, מעבדה קלטת, שליט, סמן קבוע, 70% אתנול (V / V), אחסון בקבוקונים (למשל, נצנץ זכוכית 20 מיליליטר), דבק סופר, קטנים שוקלים סירות, וכלי סיבובי מצויד בדיסק חתוכים החובה לא כבדה.
      שימו לב: אבטחת הכלי הסיבובי לתיבת קצה פיפטה באמצעות רצועות או קלטת הוא מועיל, כפי שהוא מרומם את הכלי. לובש משקפי מגן חשוב כדי להימנע מפגיעה בעת השימוש בכלי סיבובי.
   2. צרף חתיכהשל מעבדה או קלטת החיטוי לספסל.
2. הכנת cannulae:
   הערה: לפחות שני cannulae נדרש לחולדה להזרקה דו-צדדית. צינורית נוספת אחת תשמש בשלב מאוחר יותר.
   1. לרכוש חלק של צינור צינורית של אורך מספיק כדי למנוע כיפוף בתהליך סימון וחיתוך.
   2. צייר קו התייחסות 15 מ"מ בקלטת מצעד 1.1.2 באמצעות עט שקצהו קנס. זה ישמש כמדריך לסימון סעיפים 15 מ"מ רציפים בצינור באמצעות סמן קבע חד.
   3. לגעת בצינורות הצינורית, בנקודות המסומנות, לדיסק מסתובב חתך האיטי של הכלי הסיבובי כדי לחרוץ את הצינור. סובב את הצינורית 180˚ ולחרוץ בצד השני של הצינור. לא לחתוך דרך צינורות לחלוטין, משום שהיא עלולה להוביל לחסימה.
   4. חדות לכופף את הצינור כדי לשבור אותו ל~ 15 סעיפי מ"מ.
   5. החזק כל קצה לחתוך של הצינורית בניצב לחתךדיסק בין האגודל לאצבע. סובב את צינורות הצינורית תוך נגיעה בקצה אל פני השטח קדימה הגדולים של דיסק חתוכים (כלומר, לא בקצה). זה יפיק קצה קהה. הערה: אל תכופף את הצינורית, שיכול להניב להזרקה מחוץ לאתר.
   6. לקדד את שני הקצוות של הצינורית עם 26 מחט משופעת G (רכזת חום) כדי להבטיח שכל הקוצים הוסרו ושהצינורית היא בלא הפרעה.
   7. לעבור מדגם של חתך חוט אטם ל~ 35 מ"מ דרך הצינורית לחתוך כדי לוודא שאין מכשולים פנימיים.
   8. להרים כל צינורית בנפרד באמצעות hemostats unclamped ולמדוד כל צינורית השלימה עם סרגל על ​​מנת להבטיח שזה בדיוק 14 מ"מ באורך.
3. הכנת obturators:
   1. הצמד צינורית אחת כבמחצית אורך עם משקל בינוני, hemostats ישר. הנח את hemostat הנעול על הספסל. הצינורית צריכה להיות בניצב לספסל.
      הערה: צינורית זואין להשתמש בניתוח לאחר שהוחזק על ידי hemostats הנעול, כפי שהוא צפוי כפוף.
   2. להאכיל קצה אחד של חוט אטם לתוך הצינורית עד שהגיע לספסל. להקפיץ את החוט בצינורית כדי להבטיח שבר לא מונע ממנו להגיע לספסל;. כלומר, להגיע לתחתית של הצינורית. אורך אטם נכון יהיה למנוע סתימה וצלקות רקמות נוספות.
   3. בנד החוט על ידי צובט באצבעות עד זווית ~ 30˚ מושגת תוך שמירה על קשר בין האטם והספסל. ודא שהזווית של העיקול היא כזה שהיא מטילה מיושרות עם כובע הראש, ואת העודף פונה קדימה, מה שהופך את זה קשה יותר לחולדה כדי להסיר.
   4. הסר את החוט מcannulae ומנותק חלק העודף ב ~ 2.5 מ"מ מהעיקול עם חותכים אלכסוניים קטנים (מספרי תיל).
      הערה: לפחות שתי obturators יידרש לחולדה להזרקה דו-צדדית, כמו כל צינורית מושתלת דורשת אטם. יצירהבאמצע הדרך ~ 35˚ עיקול נוסף באטם יהיה גם לסייע במניעת ההסרה על ידי בעלי החיים. אחסן שני cannulae וobturators בבקבוקונים נפרדים (לדוגמא., נצנץ זכוכית 20 מיליליטר) המכיל 70% אתנול (V / V) עד לשימוש, אבל לפחות O / N.
4. הכנה ובדיקה של microinjectors:
   1. להשיג פיסת צינור מחט microinjector שהיא ~ ארוך 1 מ '.
   2. החזק סוף צינורות microinjector אחד ניצב עם hemostats ישר נעול.
   3. לסובב את hemostat, תוך שמירה על מתח בצינורות לסליל אותו בחוזקה סביב hemostat לפחות פעם אחת.
   4. מדוד 32 מ"מ מההפך, הסוף הרופף של צינורות microinjector ולתפוס נקודה זו בניצב עם hemostat שני ברציפות, בינוני במשקל ולנעול אותם. לתפוס את צינורות microinjector עם hemostats בצד של 32 מ"מ לסמן הקרובים ביותר לסוף הרופף ולא בצד הקרוב לhemostat עם חוט פצע.
   5. בןד צינורות קדימה ואחורה, תוך שמירה על מתח בצינורות עד שזה נשבר.
      הערה: עיקול חד, חד כלפי מעלה וכלפי מטה יהיה לייצר הפסקה בוטה, שהוא רצוי על מנת להבטיח כי microinjection מתרחש באזור במוח הרצוי.
   6. בדוק צינורות microinjector כדי להבטיח ששני הקצוות ישרים ושהקוטר הפנימי הוא בלא הפרעה.
   7. לרכוש צינורות צינורית שישמשו לייצור צווארון microinjector.
   8. למדוד ולסמן סעיפי 5 מ"מ רציפים של צינורות צינורית באמצעות סמן קבוע וקו התייחסות 5 מ"מ נמשך על קלטת (צעד 1.1.2).
      הערה: כל microinjector דורש צווארון אחד. קולרים הם פשוט cannulae הקצר דבק בחוט microinjector.
   9. לגעת צינורות צינורית, בנקודות המסומנות, לדיסק מסתובב חתך האיטי של כלי סיבובי כדי לחרוץ את הצינור. סובב את הצינורית 180˚ ולחרוץ בצד השני של הצינור. חיתוך לחלוטין עשויה לחסום את צינורות.
   10. באופן חדצינורות צווארון microinjector עיקול כדי לשבור אותו ל~ 5 סעיפי מ"מ.
   11. לקדד הקוטר הפנימי של שני הקצוות של הצווארון עם 26 מחט משופעת G (רכזת חום) כדי להבטיח שרוב הקוצים הוסרו. כמה קוצים קטנים יהיו לתפוס את חוט microinjector ובכך לסייע בהדבקה.
   12. להחליק צווארון אחד על כל צינור microinjector ~ 2 סנטימטר מהקצה.
   13. ליצור מאגר קטן של דבק סופר בפינה של סירה לשקול קטנה.
   14. השתמש בצינורות צינורית גרוטאות לחתוך ל~ 25 מ"מ להחיל כמות קטנה של דבק סופר לצינור microinjector ~ 5 מ"מ מקצה אחד. הבא, חלק את הצווארון מעל חרוז דבק סופר זה כך שזה ~ 1 מ"מ מקצה צינורית microinjection. לכסות את שני הקצוות של הצווארון עם דבק.
       הערה: הימנע מהצטברות גדולה של דבק סופר על הצווארון, כפי שהוא ימנע את צינורות פלסטיק מאיטום סביב microinjector. אמנם חשוב להימנע מקבל דבק סופר על הקצה הפתוח של צינור microinjector, כמו זו תהפוךmicroinjector לא שמיש, זה גם חשוב כדי להחליק את הצווארון הקרוב לסוף ככל האפשר כדי למזער חלל נפח (הזרקה שאינה).
   15. להישען microinjector הושלם בצד החיצוני של סירה אחרת לשקול קטנה עם הצד את הצווארון ולאפשר לו להתייבש במשך 24 שעות.
   16. להשיג חתיכת סנטימטר ~ 8 של צינורות פלסטיק microinjector (PE20 או שווה ערך), מזרק 1 מיליליטר מלא במים סטריליים, ו -26 מחט משופעת G (רכזת חום).
   17. צרף מחט 26 G (רכזת חום) למזרק והחלק את צינורות לחתוך על המחט, הבטחה לא לנקב את הצינור.
   18. חלק את צינורות פלסטיק על קצה הצווארון של microinjector המיובש, השלם.
   19. לסחוט את בוכנת מזרק מלא מים כדי לבדוק פתיחות.
       הערה: מים צריכים לרסס רחוק מאוד וישר מקצה microinjector. אם הזרם הוא לא ישר, מיקום ההזרקה לא יהיה נכון. המקור של ספריי לצדדים או מפוזרים הוא הפסקה עלובה (צעד 1.4.5). Microinjector צריך לאלא ניתן להשתמש אם התרסיס הוא לצדדים או מפוזר. אין להשתמש בתמיסת מלח, כפי שהוא יכול להדביק את microinjector או המחט.
   20. משוך את המזרק בחזרה כדי להסיר מים מmicroinjector. חנות בבקבוקון יבש, אטום; למשל, בקבוקון נצנץ זכוכית 20 מיליליטר.
       הערה: ניתן autoclaved Microinjectors לאחר ייצור עם רוב הדבקים סופר, ³¹ אבל זה צריך להיקבע באופן אמפירי. טכניקות עיקור אלטרנטיביות כוללות אתילן אוקסיד וקרינת גמא.

2. microinjections הכנה ולביצוע

1. להשיג microinjectors הושלם, צינורות פלסטיק microinjector (PE20 או שווה ערך), משאבת microinjection, שתי קטנים שוקלים סירות, מים סטריליים, 70% אתנול (V / V), אצטון, שני מזרקים זכוכית μl gastight 1 עם מחט קהה (25 G), כותנה הטתה applicators עץ, obturators חילוף, מזרק 1 מיליליטר, 26 G (רכזת חום) מחט, מלקחיים מעוקלים קטנים (בסגנון # 7 מומלץ), ומעבדה wipes.
2. הכנת microinjectors להזרקה:
   1. בנד השלים microinjector 15 מ"מ מהיפך הקץ לצווארון, כך שהזווית בין השניים היא ~ 95˚.
      הערה: מיקום מדויק עיקול הוא הכרחי למיקום הזרקה מדויק. שימוש במלקחיים # 7 (או דומה) כדי לתפוס את microinjector וכיפוף כלפי מעלה הוא שימושי. תמיד מחדש למדוד את האורך לפני ביצוע microinjections.
   2. חותך את צינורות הפלסטיק (PE20) ל~ 70 סנטימטרים ושקופיות על צווארון microinjector.
      הערה: הוספת כרטיסיות קלטת לצינור אחד פלסטיק ליד שני microinjector וסופו של הדבר הרופף שימושית כאשר השלימו זריקות, במיוחד כאשר הזרקת שני פתרונות שונים. כרטיסיות אינן מומלצים לשני הצינורות כפי שהן הופכות מסורבלות במהלך ההזרקה.
3. הכנת משאבה לmicroinjections:
   1. כוח על משאבה.
   2. הגדר קוטר של מחט microinjection, קצב עירוי רצוי, ולמקד את עוצמת זריקה.
      הערה: עכברוש העירוידואר ועוצמת זריקה תלוי בדרישות ניסיוני. זה הרחיב בדיון. משאבות כמה יש שולחנות מזרק טעונים מראש. אם לא, ניתן למצוא שולחן מזרק באתר הייצור (ים).
   3. להגדיר מצב משאבה ל'עצמה ', כך שנפח מדויק מועבר באופן אוטומטי. אם מצב 'משאבה' נבחר במקום, הניסוי חייב ידני לעצור את המשאבה.
   4. התאם את בלימת המשאבה כדי לאפשר את המזרק כדי למלא להזרקה בתוספת הנפח 0.2 μl נוסף.
4. הכנת מזרק microinjection וmicroinjector להזרקה:
   1. לנעול כל מזרק microinjection gastight למעמד של משאבת microinjection.
   2. הנח את הקצה של מזרק gastight למים סטריליים הכלולים בקטן לשקול סירה ובעדינות מרפרפות הבוכנה לשמן את החוט הפנימי. באופן שווה למשוך את הבוכנה לבלימה במשאבה כדי למלא במים.
   3. חלק את צינורות PE20 שהוא שיתוףnnected לmicroinjector (בשלב 2.2) על גבי מחט 26 G (רכזת חום) מצורפת מזרק 1 מיליליטר כי הוא מלא מים סטריליים. לרסס מים סטריליים באמצעות microinjector, ולבדוק תבנית ריסוס ומרחק.
      הערה: מים צריכים לרסס רחוק מאוד וישר מקצה microinjector. אם הזרם הוא לא ישר, מיקום ההזרקה לא יהיה נכון.
   4. מניחים את microinjector המעוקרים על שדה סטרילי.
   5. חלק את צינורות משל המחט, שמירה על צינורות microinjector זקוף כדי למנוע ממים הנוטפים החוצה גם בעת חיתוך צינורות מתחת לאזור שנפגע על ידי המחט.
   6. לדחוף את בוכנת מזרק microinjection מעט קדימה כדי ליצור טיפה בסופו של המחט והחלק את צינורות PE20 מלא מים (שמחובר לmicroinjector) על המחט.
      הערה: הפעולה זו תיצור חיבור נוזל לנוזל שיאפשר backpressure המתאים שיכול לעקור לסתום שיכולים להיווצר בטיפ של microinjector.
   7. לדחוף את הבוכנה קדימה לחלוטין להתכונן לטעינת מדגם ולהבטיח כי לא אתנול עקבות נשאר בmicroinjector.
   8. בדוק את ההתקנה להדלפות על ידי נגיעה בטיפת המים שנוצרה בקצה microinjector למעבדה נקייה לנגב מספר פעמים.
5. הערה: כאשר נוגעים למעבדה לנגב, כתם רטוב רק אחד צריך טופס. אם יש טיפות יותר, יש דליפה במערכת.
6. למנוע דליפות על ידי שליטה יישום סופר דבק (שלב 1.4.14) ועל ידי זמירה צינורות PE20 עם מספריים חדים או סכין גילוח כל עת שצינורות PE20 מוסר מכל קשר. בנוסף, חזור על השלבים 2.4.3 באמצעות 2.4.8 לתקן את הדליפה.
7. משוך את בוכנת מזרק בחזרה 0.2 μl; יצירת בועה בין המים סטריליים בצינור / microinjector PE20 והפתרון להיות מוזרק.
8. הערה: בועה זה מונעת דילול של injectate, זיהום המים, ומאפשרת לילניטור של תהליך ההזרקה שכן הוא יעבור במהלך ההזרקה. בועה אחת, מוצקה צריכה להיות מיוצר. אם זה שבור, דליפה היא בהווה או בקצה microinjector הוא חסום; המציין צעד ש2.4.8 (ופתק המצורף) יש לחזור.
9. מניחים את microinjector למגיב להיות מוזרק ולמשוך את בוכנת המזרק לבלימה לאט.
10. הכנת בעלי חיים להזרקה:
11. החזק חזה של העכברוש על החזה של הנסיין. נקה את האזור סביב cannulae עם מוליך כותנה הספוג באתנול 70% (V / V).
12. הערה: עם טיפול נכון, עכברים יכולים להיות מאופקים בעדינות בכף יד. אחרת, ייתכן שיידרשו החליק על.
13. הסר obturators באמצעות מלקחיים קטנים ומקום לסירה לשקול עם 70% אתנול (V / V).
14. ביצוע זריקות:
15. הנח microinjector המלא (צעד 2.4.10) לצינורית. התחלה לחץ על משאבת microinjection ותנועת בועת צג.
16. הערה: גברy יהיה צורך להפעיל לחץ קל על מנת להבטיח שmicroinjectors לא להרים. הבועה (שנוצר בשלב 2.4.9) צריכה לקדם באופן אחיד ולהיכנס באופן מלא בmicroinjector.
17. הסר את microinjectors מהצינורית ולהחליף obturators, פעם אחת ההזרקה היא מלאה ותקופת דיפוזיה לאחר ההזרקה עברה.
18. הערה: פעמים דיפוזיה לאחר הזרקה אופיינית הן 2 - 4 דקות לחומרים כימיים תרופתיים, ו 2 - 10 דקות לאיתור וירוסים. השארת microinjector בתקופה שלאחר העירוי מונעת injectate מrefluxing לגבות cannulae במקום לשדר לתוך הרקמה. obturators מקום בצד של הסירה מלא אתנול שוקל לאפשר אתנול לניקוז לפני ההכנסה מחדש לצינורית.

3. לאחר ההזרקה Clean Up

1. השג בקבוקון אחד קטן של כל אחד: מים סטריליים, EtOH 70%, ואצטון.
2. ניקוי מזרק microinjector וmicroinjection:
   1. הסר מזרק זכוכיתים ממדף מזרק משאבה וצינורות microinjection ממזרק זכוכית.
   2. צינורות microinjector נתקו ממזרק זכוכית ולצרף מזרק 1 מיליליטר מלא במים סטריליים לצינורות microinjector באמצעות מחט 26 G (רכזת חום). לדחוף את בוכנת מזרק 1 מיליליטר קדימה לגרש ~ 0.3 מיליליטר. בשלב הבא, לגעת בקצה של microinjector למעבדה לנגב ולמשוך אוויר חזרה דרך microinjector.
      הערה: microinjector והצינורות יכולים להיות שימוש לניסויים דומים אם כנבון.
   3. הנח מחט מזרק זכוכית לתוך מים סטריליים ולצייר בוכנה חזרה באופן מלא. בשלב הבא, לדחוף את הבוכנה קדימה באופן מלא כדי לשטוף. לגעת בקצה מזרק זכוכית למעבדה לנגב, כדי להבטיח שלא נשאר נוזלי.
   4. חזור על שלב 3.2.3 עם מים סטריליים, אוויר, 70% EtOH, ואצטון לפי הסדר הבא: מים סטריליים, מים סטריליים, אוויר, אוויר, 70% EtOH, EtOH 70%, אוויר, אוויר, אצטון, אצטון, אוויר, אוויר. ביצוע כל צעדי ניקוי אלה יסייעו לשמר את מזרק microinjection.
   5. מניחים את מזרק microinjector (ים) לאריזה ולמשוך את בוכנה חזרה ל0.05 μl.
      הערה: זה חשוב, שכן היא מאפשרת את הבוכנה להיות דחף או משך כדי לסלק בוכנה תקועה שעלולות להתרחש צריך כל פיקדונות מלח הטופס לאחר האחסון.

4. תכנות של assay מוטיבציה

1. היכנס למדינה גרפית עם אישורי מנהל מערכת.
2. בחר או ליצור מסד נתונים רלוונטיים.
3. יצירת לוח זמנים חיזוק יחס מתקדם:
   1. רשימות בחרו> רשימות רמת מסד הנתונים> רשימות מעבר פרמטר אירוע.
   2. בחר 'הוסף'. הזן את המספר מתאים רשימה (# L) ותיאור.
   3. בחר 'הוסף אירועים ".
   4. הזן את ערך לוח זמנים החיזוק הראשון ובחר 'הוסף'. חזור.
      הערה: ערכים ניתן לקבוע על ידי שימוש בנוסחה שבו לוח זמנים יחס המתקדם = 5e ^{(* י (החיזוק הרוויח + 1))} -5 ^7.על מנת להתאים את המשוואה הזאת כדי לבדוק את ההשערה שצריך, j הערך חייב להיקבע באופן אמפירי או שהתקבל מהספרות.
   5. בחר "כדי" בתוך הקופסה "הבחירה להזמין".
   6. בחירה 'החזק ערך = ל: ____ "בתוך הקופסה" בסיום ". הזן את ערך לוח הזמנים חיזוק בתיבת הטקסט שעולה בהרבה על צפויה להגיב. זה יהיה המאמץ הנדרש לכל הערכים שלאחר מכן פעם אחת ברשימה מוצתה.
4. יצירת פרוטוקול ניסוי:
   הערה: גרפי מדינה מעבירה את הנושא באמצעות סדרה של מדינות שיצאו מבוססת על זמן או קריטריוני ביצועים. כוון את כל הרמזים דיסקרטיים וקונטקסטואליים והפרמטרים מסומנים להלן '$' כדי לבחון כראוי את ההשערה בבחינה.
   1. בחר קובץ> יצירת פרוטוקול ניסוי.
   2. הזן את מספר הפרוטוקול הרצוי והתיאור לתיבת טקסט מתאים.
   3. בחירה 'יצירת המדינה ".
   4. כוון את כל הגירויים לשני 'RDY - מדינה מוכנה' ו 'FIN - המדינה מוגמרת ".
   5. בחירה 'מדינה חדשה' ושם את זה "S2 - יחסי ציבור בתגובה.
   6. בחירה 'מדינה חדשה' ושם את זה "S3 -. יחסי ציבור חיזוק וקיו '
   7. בחירה 'מדינה חדשה' ושם את זה "S4 - פסק הזמן".
   8. גולת כותרת "S1" ושם זה S1 -. הרגלה "
      1. בחר הוסף 'זמן עבור אל. "
      2. הזן את הזמן מתאים ($) ויחידות ($), למשל., דקות ובחר 'S2' לתיבה הנפתחת S. 'היחידות' הזמן היחידה נקבעו כאשר מסד הנתונים בתחילה יצרו.
         הערה: מעבר הזמן נוצר צריך לקרוא דומה ל[ אחרי $ דקות GO P = 100%, לS2] איור 1 הוא דוגמא לאירוע זה יצר פעם אחת.

   
   איור דוגמא # 1. תכנות נציג 1. במקרה זה מדינה מופרדת זמן מתואר שבערך משתמש המוגדר של $, המוצג כאן בדקות, מציין מתי המצב הנוכחי צריך לצאת למדינה 2 (S2).

   9. גולת הכותרת 'S2 - יחסי הציבור בתגובה.
      1. הוספת בחירה 'אירוע עבור אל. "
      2. הזן את שם רשימה המכיל את לוח הזמנים של יחס המתקדם שנוצר בשלב 4.3 בתיבת הטקסט הראשונה כL $ (לדוגמא, L1), בחר את operandum המתאים (למשל., מנוף או לדחוף את האף) מתיבה נפתחת ראשון, ובחר ' S3 'לS תיבה נפתחת.
         הערה: האירוע שנוצר יכול לקרוא דומה ל[ אם L $ 1 - GO P = 100% פעילים, לS3]. מזהה 1 - פעיל יועד במהלך יצירת מסד הנתונים. הנה, 1 - פעילמתייחס לoperandum מחובר למתג אחד.
      3. בחר 'הוסף זמן עבור אל. "
      4. סמן תיבת 'R', להיכנס לזמן מתאים ויחידות ($), ובחר 'FIN' לS תיבה נפתחת.
         הערה: אירוע הזמן נוצר יכול לקרוא דומה ל[ R (בדק) אם דקות $ GO P = 100%, לFIN]. זה יבטיח כי הפגישה תסתיים אם אין פעילות בoperandum שאחרי הסף שנקבע;. כלומר, הפגישה תהיה פסק זמן לאחר החיה אינו מגיבה על operandum לזווג החיזוק לתקופה הקצובה של זמן.
      5. הוספת בחירה 'אירוע עבור אל. "
      6. סמן את התיבה 'R', הזן 1 בתיבת הטקסט הראשונה, בחר את שחרורו של operandum המתאים מתיבה הנפתחת ראשון, ובחר 'S2' לתיבה הנפתחת S.
         הערה: האירוע שנוצר יכול לקרוא דומה ל[ R (בדק) לאחר $ [1] GO P פעיל = 100%, לS2]. צעד זה מבטיח כי עם שחרורו של operandum(מסומן בסוגריים לעיל), שהמדינה נכנסה שוב, ובכך מאפסת את סף פסק זמן פגישה (4.4.9.4). בשלב זה, המדינה תצא כאשר היחס המתקדם הכלול ברשימה הושלם (שלב 4.4.9.2) או פעמים מושב החוצה (שלב 4.4.9.4). כך, בכל פעם שoperandum מופעל, זה נחשב לכיוון היחס המתקדם. . ו, בכל פעם שהוא operandum מומת; למשל, את הידית משוחררת או לדחוף את האף שלו יצאה, סף פסק זמן פגישה (שלב 4.4.9.4) מתאפס איור 2 מייצג את כל המעברים מתוכנת עבור 'S2 - יחסי הציבור בתגובה.. "

   
   איור 2. תכנות נציג דוגמא # 2. כאן, המדינה יצאה עם אחד משני קריטריונים. L $ הוא לוח הזמנים יחס המתקדם יצרו בשלב 4.3. על complet לוח הזמניםיון, המדינה יוצאת למדינה 3 (S3). שים לב שקריטריון זה אין R, המאפשר ללוח הזמנים לקידום ולא מתחיל שוב על כל חזרה למצב זה. המדינה יכולה גם יציאה לאחר דקות '$' להצהיר FIN. זהו פסק הזמן שנקבע מראש הסף לאחר שהפגישה תסתיים אם לא להגיב מתרחשת בתוך חלון זה. זה מוסבר בהרחבה בדיון. לבסוף, סף פסק זמן הפגישה הוא לאפס על כל שחרור operandum. לפיכך, "[1] 'מציין שחרור operandum' 1 '.

   9. גולת הכותרת 'S3 - יחסי הציבור וחיזוק Cue. "
      1. בחר 'הוסף זמן ללכת "
      2. הזן את הזמן מתאים ויחידות כדי לספק את החיזוק ($), ובחר "S4" מהתיבה הנפתחת S.
         הערה: אירוע הזמן נוצר יכול לקרוא דומה ל[ לאחר שניות $ GO P = 100%, לS4].
   10. גולת כותרת "S4 - פסק זמן."
       1. בחר הוסף 'זמן ללכת "
       2. הזן את הזמן ויחידות מתאימים להישאר במשלוח החיזוק הבא מצב לא פעיל ($), ובחר 'S2' מהתיבה הנפתחת S.
          הערה: אירוע הזמן נוצר יכול לקרוא דומה ל[ לאחר שניות $ GO P = 100%, לS2]. "S4 - פסק זמן" המדינה לא ייתכן שיידרש לכל העיצובים.
   11. נחישות מדינות בחרו.
       הערה: פרוטוקול זה הוא עכשיו מוכן להפעלה.

תוצאות

כאן אנו מדגימים דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג עם ההליך הנ"ל. מוצג הראשון הוא אזור אופייני שtransfected על ידי וקטורים ויראליים (איור 3). באופן כללי, נפח transfected של 1 ~ ³ מ"מ מתקבל ברקמת striatal. הנפח של אזור transfected ניתן לכמת על פני סעיפים סידוריים בשיטה של Cavalieri ³² חשוב לציין, נפח transfected תלוי בגורמים רבים כגון הסוג של רקמה שtransfected.; סרוטיפ נגיפי; אמרגן; שיעור ונפח מוזרק; מספר החלקיקים המוזרקים; pH injectate; ואם ריאגנטים hyperosmolar, כגון מניטול, היו בשימוש. ^33,34 בדרך כלל, אנחנו microinject 10 ¹² מיליליטר / חלקיקים, μl 1 / צד מעל 10 דקות, ולאפשר 7 דקות נוספות לפני החלפת obturators. בנוסף, injectate הוא בדרך כלל סביב pH 8. הבא, אנו מראים כי מוטיבציה ניתן להשפיע גם על ידי ביטוי transgene (איור 4)או microinjection התרופתי מגיב (איור 5).

באיור 4, הבענו קולט מעצב הופעל אופן בלעדי על ידי סמים מעצב (DREADDs). אזור קידוד קולט DREADD בעקבות אתר כניסה פנימי הריבוזום וקלטת mCitrine. MCitrine מאפשר הדמיה נוחה של תאי transfected. DREADD היה מצמידים את G-חלבון heterotrimeric Gαq. הפעלה של DREADD מצמיד Gαq יכול לעורר האסטרוציטים, ^28,35 וDREADD עצמו יכול להיות מופעל על ידי ממשל מערכתי של קלוזאפין-N-תחמוצת (CNO, 3 מ"ג / קילוגרם, IP). ^14,22,36 חולדות אומנו מנוף להגיב לחיזוק אתנול, שבו 3 בתי מנוף הניבו סיכוי של 1 לשתייה במהלך יום פגישות 1 שעה מעל 60 ימים רצופים. בשלב הבא, חולדות נאלצו להתנזרות, וDREADDs מצמיד Gαq באו לידי ביטוי בגרעין נסמך האסטרוציטים ליבה. לאחר 3 התנזרות שבוע, המוטיבציה העצמית ADMI אתנול נסתר נמדד על ידי נקודת עצירה. ^21,27-30 הפעלה של גרעין נסמך האסטרוציטים ליבה, באמצעות ממשל CNO מערכתי, ירידה במוטיבציה של חולדות לחדש ממשל עצמי אתנול אחרי ההתנזרות בהשוואה לרכב. חשוב לציין, היה CNO אין השפעה בעוקבה באותה מידה הכשרה שמבטאת חלבון פלואורסצנטי הירוק במקום DREADD.

3. אזור איור נציג הגחון striatal transfected על ידי וירוס microinjected. תמונה זו ממחישה את האזור של גרעין נסמך האסטרוציטים שהיו transfected ידי ביצוע השיטה הנ"ל. הנתונים נדפסו מet al בול. ¹³ באישור של בעל זכויות היוצרים. ניתן למצוא את פרטים שבפרסום וחומר נוסף המצורף.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מוטיבציה איור 4. של חולדות לאתנול 'ניהול עצמי הופחתה על ידי הפעלת transgene שהיה-על באו לידי ביטוי בגרעין נסמך האסטרוציטים ליבה. וירוס היה microinjected והמוטיבציה נמדדה באמצעות נקודת עצירה לאחר שאפשר שבוע ללהביע את הווירוס. Transgene הביע היה מעצב קולט הופעל אופן בלעדי על ידי סמים מעצב (DREADDs). כיוון אחד ANOVA (F (2,30) = 3.29, p = 0.04) ואחריו Scheffe פוסט-הוק גילה כי הפעלה של DREADD ידי ממשל מערכתי של קלוזאפין-N-תחמוצת (CNO, 3 מ"ג / קילוגרם, IP ) צמצם באופן משמעותי את המוטיבציה של חולדות לאתנול 'ניהול עצמי לאחר התנזרות בהשוואה לרכב היה CNO אין השפעה בעוקבה באותה מידה הכשרה שמבטאת חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) במקום DREADD. הנתונים נדפסו מet al בול. ¹³ באישור של בעל זכויות היוצרים. ניתן למצוא את פרטים שבפרסום וחומר נוסף המצורף.

איור 5. Microinjection של חוסמי צומת פער הגביר את המוטיבציה של חולדות לעצמיות לנהל אתנול אחרי התנזרות שני חוסמי צומת הפער הוערכו להשפעתם על המוטיבציה (נמדדה באמצעות נקודת עצירה) של חולדות לעצמיות לנהל אתנול:. Mefloquine ו18- α-glycyrrhetinic חומצה (18-α). דו כיוונית ANOVA גילה כי microinjection של חוסמי פער צומת לגרעין נסמך ליבה הגבירה את המוטיבציה של חולדות לעצמיות לנהל אתנול אחרי ההתנזרות (F (3,40) = 5.56, p = 0.003). הנתונים נדפסו מet al בול. ¹³ באישור של בעל זכויות היוצרים. ניתן למצוא פרטים בפרסום ושהחומר משלים הנלווה.

Discussion

ההליך שהוצג כאן הוא אמצעי יעיל לייצור cannulae microinjection וmicroinjectors שיסייע בהבהרת מצעים המולקולריים של התנהגות מוטיבציה. שיטה זו מציעה מספר יתרונות. ראשית, על ידי ייצור שתלים של האדם עצמו וmicroinjectors, פרמטרים ניסיוניים רומן יכולים להיות מותאמים במהירות, כלומר, אף אחד לא צריך לחכות לרכיבים מותאמים אישית להגיע. שנית, בשל הקוטר הקטן של הצינורית, יותר cannulae יכול להיות מושתל בו זמנית. זה מקצר את זמן הניתוח הנדרש, אשר יכול לשפר את השרידות, וגם מאפשר שתלים מרובים לכל בעלי חיים. שלישית, התוכנה המשמשת לשליטה על התאים אופרנטית בקלות להכיל לוחות זמנים יחס מתקדמים מאז הפרדיגמה יחס קבועה ניתן להמיר במהירות לפרדיגמה יחס מתקדמת, פשוט על ידי החלת רשימת פרמטרי מעבר אירוע המכילה את לוח הזמנים של חיזוק הרצוי.

להיותבאופן רחב שימושי, הליך microinjection הגנרית הוצג שצריכה להיות רחב ישים עבור microinjection של כמעט כל מגיב זמין כרגע. כתוצאה מכך, אנו צופים כי טכניקה זו תמשיך להיות של שירות גבוה דומה בעתיד עם שינוי קל. על ידי שינוי רק כמה משתנים, גישה זו יכולה להיות מיושמת על מספר רחב של חומרים כימיים. פרמטרים שנפוצים ביותר לטפל כוללים את האורך שmicroinjector בולט מהצינורית, נפח ההזרקה, ושיעור של הזרקה. לדוגמא, ייתכן שירצה אחד המזרק כדי לבלוט עוד יותר מקצה הצינורית כדי למנוע את צלקת גליה, כי בדרך כלל יוצרת סביב שתלים כרוניים. בנוסף, אחד ייתכן שירצה להזריק נפח גדול יותר. לmicroinjections וירוס striatal, נפח של 1 μL משמש בדרך כלל ונפח זה מוזרק בדרך כלל על פני תקופה ארוכה של זמן (לעתים קרובות 7 - 10 דקות בתוספת 3 - זמן דיפוזיה 10 דקות נוספת) בהשוואה לשימוש שד לחומרים כימיים תרופתיים (בדרך כלל 0.3-0.5 μL על 2 - 3 דקות בתוספת 1 - 3 זמן דיפוזיה נוספת דק '). המשתמש צריך להתייעץ הספרות ו / או אמפירי לקבוע את הפרמטרים המתאימים ביותר לצרכים שלהם. ללא קשר, את ההצלחה של הליך זה תלוי באופן קריטי על 4 משתנה: 1) אורך צינורית, אורך microinjector 2), 3) איכות של תבנית ריסוס microinjector, ו -4) את שלמות המערכת לפני ההזרקה. בגלל מיקום microinjection תלוי בעומק שmicroinjector בולט מהצינורית, זה הכרחי ששני cannulae (שלב 1.2.8) ואורך microinjector (לאחר כיפוף, שלב 2.2.1) הם ידוע דווקא ואחיד בין כל הנושאים . זה בקלות יכול להיות נשלט על ידי בקלות דחייה כל יישום שאינו הנדרש באורך מחדש המדידה הסופית. יתר על כן, ניתן לחזות את מיקום ההזרקה רק אם היא מתרחשת מייד מתחת לצינורית המדריך. לפיכך, כל microinjector שאיילהשעות לא לרסס זרם ארוך, קנס על בדיקות (שלבי 2.4.6) להידחות. הזרקת איכות קשורה גם ליושרה של המערכת לפני הזרקה. אם אחרי כל מחלק המים מהמזרק (לפני מילוי עם מגיב) כתמים מרובים הם נצפו במעבדה לנגב, אז דליפה צריכה להיות לתיקון (שים לב בשלב 2.4.8). יתר על כן, אם הבועה (שלב 2.4.9) שמפרידה את התרופה מהמים בצינור PE20 היא לא אחד, בועה אחת (לאחר מילוי microinjector עם מגיב), ולאחר מכן את המזרק סתום באופן חלקי. כפכף זה יכול גם למנוע או להסיט את הזריקה. זה גם ניתן לתיקון בקלות (הערה על צעד 2.4.8).

צריך אחד רוצה microinject בעוד החיה במסגרת stereotaxic יש שלוש חלופות. ראשית, אפשר להגדיל את האורך של צווארון microinjector כך שהוא יכול להיות מוחזק בחוזקה על ידי מניפולטור stereotaxic וגם להאריך רחוק מספיק כדי לאפשר חיבור לצינורות PE20. שנית, עלדואר יכול באופן זמני להשתיל צינורית ולהשתמש microinjector הסטנדרטי שהוצג כאן. שלישית, אפשר להשתמש נמשך וטפטפות זכוכית מלוטשות. ^16,17

מגבלה משמעותית של ההליך שהוצג כאן היא שזה מתנהל הטוב ביותר בחולדות מטופלות היטב כי הם מכירים את הנוהל. חולדות משמשות לנתונים שתוארו בסעיף התוצאות לא נדרשות נהלי טיפול מיוחדים בגלל אותו החוקר שטפל בחולדות על בסיס יומי במשך 2 חודשים. זה כלל תצפית יומית ומניפולציה של השתל כירורגית לפחות 2 שבועות. עם זאת, חולדות יכולות להיות מורגלות במהירות על ידי מספר הטכניקות המשמשים ללפני assay העיכוב מראש הדופק, אשר יכול להיות מושפע מלחץ. טכניקות התרגלות מיוחדות אלה שפורטו בעבר יפה. ⁴³ בנוסף להליכים אלה, רצוי שחולדות להיות מורגלות להליך microinjection בי microinjectors המקוצר משמש duזריקות טבעת 'דמה'. במהלך זריקות הדמה הללו, זה קריטי, כי microinjector לא יבלוט לתוך הרקמה על מנת להגביל את ניזק לרקמות. במילים אחרות, microinjector צריך להיות כפוף לא יותר מ 14 מ"מ. לפיכך, ההתרגלות היסודית הנדרשת ליישום אופטימלי של טכניקה זו יכולה להיתפס כהגבלה.

בעוד כמה פרדיגמות התנהגות קיימות למדידת מוטיבציה, היחס המתקדם משמש בדרך כלל כדי לכמת את המאמץ שהנושא הוא מוכן להפעיל כדי להשיג חיזוק. הפרדיגמה היחס המתקדמת מייצרת מדד הידוע כנקודת עצירה, אשר לעתים קרובות מוגדר כמספר המקסימאלי של בתי מנוף ביחס סיים האחרון;.. כלומר, מרבית להגיב שנוצר חיזוק ²¹ היחס המתקדם הוא רגיש לחיזוק עוצמה. לדוגמא, קוקאין גבוה יותר (או סוכרוז) מינונים לייצר נקודת עצירה גבוהה יותר וקוקאין נמוך (או סוכרוז) מינונים להניב breakp נמוךoint. ^21,22 בהתאם לכך, נקודת עצירה היא פרוקסי משמש באופן שגרתי למוטיבציה ו / או יעילות חיזוק. ^21,23-26 בגלל הכוונה של נקודת העצירה היא לקבוע מתי החיה מפסיקה להגיב, פרמטר חשוב של הפרדיגמה היחס המתקדם הוא אורך חיבור. אורכי פגישה סופיים יכולים לשים כובע שווא על ערכי נקודת עצירה וזה יכול להחמיר על ידי מראש טיפולים שאופן חריג להקטין את השיעור של ממשל עצמי או שנעצר עליית פוסט-חיזוק. לבלבל זו ניתן להתגבר על ידי מספר רב של גישות;.. למשל, מפגשים שיסתיימו כאשר החיה עוכבה להגיב על ידי כמה מרובה של המרווח בין העירוי הממוצע ⁴⁴ גרסה נפוצה יותר ליישם גישה זו היא לסיים הפעלות פעם להגיב יש נמנע על ידי כמה ערך אמפירי נחוש שמתקיים קבוע על פני נושאים. אנו מספקים השיטה ליישם גישה זו בשלב 4.4.9.11.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cannula Tubing	Amazon Supply/ Small Parts	HTXX-26T-60	26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
Obturator	Amazon Supply/ Small Parts	GWXX-0080-30-05	33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
Microinjector Wire	MicroGroup	33RW 304	33 gauge
Super Glue	Loctite	3924AC	Liquid, Non-gel, can be autoclaved
Microinjector Plastic Tubing	Becton Dickson	427406	PE20
Medium Weight Hemostats	World Precision Instruments	501241-G
Ruler	Fisher	09-016	150 mm
#7 Forceps	Stoelting	52100-77	Dumont, Dumostar
Rotary Tool	Dremmel	285	Two-speeds
Cut-off Disc	McMaster Carr	3602	15/16" x 0.025"
Microinjection Pump	Harvard Apparatus	PhD 2000
1 ul Glass Syringe	Hamilton	7001KH	Needle Style: 25s/2.75"/3
Cotton Tipped Applicator	Fisher	23-400-101
Lab Wipes	Kimwipes	34133
Operant Software	Coulbourn	Graphic State
Operant Chambers	Coulborun	Habitest