Nagetier Gehirn-Mikroinjektion, um molekulare Substrate motiviertes Verhalten Studieren

Zusammenfassung

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

Zusammenfassung

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Einleitung

Rodents and humans respond in remarkably similar ways to behaviorally relevant stimuli^1-3. This suggests that rodents are appropriate subjects for elucidating the molecular substrates of behavior and complex psychiatric conditions⁴. Understanding the molecular substrates of complex behavioral processes, such as motivation, frequently requires brain microinjection. Both the brain microinjection technique and a primary motivation assay will be presented here. Rats will be used as subjects, but these procedures can readily be adapted to well-handled mice. Included herein are procedures for the manufacture of the required cannulae, obturators (dummy cannulae or stylets), and microinjectors. The method presented is significantly more flexible and more cost-efficient than prefabricated implements. This flexibility will prove valuable when optimizing conditions. Importantly, because the microinjection procedure can be used to test a myriad of hypotheses; the techniques presented here should be broadly applicable. For example, receptor ligands can be microinjected to understand neurochemistry^3,5,6; cell-permeable peptides and small-molecules can be microinjected to understand intracellular signaling pathways^7-10; toxins, ion channel blockers, or antagonist cocktails can be microinjected to understand circuitry^1,11,12.

While the generic protocol presented here can be readily adapted by the user for their particular needs, the procedure is particularly well suited for behavioral assays since microinjection occurs in awake rodents that are only under mild hand restraint. No anesthesia or special restraints are required. This is possible because the brain itself lacks pain sensation. However, if anesthesia is not used, microinjection must occur through cannulae that were previously stereotaxically implanted. This is because nociceptors are present on the scalp, meninges,¹³ which are the membranes surrounding the brain, and the periosteum,¹⁴ which is the membrane covering the skull. It should be noted that microinjection under anesthesia is sometimes desirable. One example is when the virus is being injected, and one may wish to inject virus directly through either stainless steal needles¹⁵ or glass pipettes because this can reduce tissue damage and improve transduction efficiency.^16,17 The microinjectors described below can be modified for this purpose and suggestions on how to do this can be found in the Discussion. Because other JoVE articles have demonstrated stereotaxic brain cannula implantation,^18-20 these procedures will not be covered here.

We present these microinjection procedures together with an assay that quantifies motivation. Several rodent models of motivated behavior are currently in use, such as the runway box and barrier scaling. Here, we describe how to use an operant progressive ratio schedule of reinforcement to quantify motivation where operant responding is being maintained by a reinforcer. Responding on the progressive ratio is responsive to reinforcer magnitude.^21,22 Accordingly, this assay is routinely used as a proxy for motivation and/or reinforcing efficacy. ^21,23-30 Because several excellent reviews have covered this topic in detail,^21,24 we will focus mainly on practical concerns.

Protokoll

Verfahren, die Tier Themen wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an Virginia Commonwealth University genehmigt und sich an den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Herstellung der Werkzeuge vor der Operation und Mikroinjektion

1. Richten Sie für die Materialvorbereitung:
   1. Erhalten Sie 26 G Kanüle Schläuche, 33 G Obturator Draht, 33 g Mikroinjektionsnadel Schläuche, Mikroinjektor Kunststoffschlauch (PE20 oder gleichwertiges), zwei mittelschwere geraden Gefäßklemmen, Laborband, Lineal, Permanentmarker, 70% Ethanol (v / v), Lagerung Vials (zB 20 ml Glas-Scintillations), Sekundenkleber, kleine Boote wiegen und Drehwerkzeug mit einem nicht-schwere Trennscheibe ausgestattet.
      Hinweis: Die Sicherung der Drehwerkzeug, um eine Pipettenspitze Feld mit Riemen oder Band ist nützlich, da es das Werkzeug erhöht. Das Tragen von Augenschutz ist wichtig zur Vermeidung von Verletzungen bei der Verwendung eines Drehwerkzeugs.
   2. Bringen Sie ein Stückvon Labor oder Autoklaven Band auf der Bank.
2. Herstellung von Kanülen:
   Hinweis: Mindestens zwei Kanülen werden pro Ratte für einen bilateralen Injektion erforderlich. Einen zusätzlichen Kanüle wird in einem späteren Schritt verwendet werden.
   1. Erwerben Sie einen Abschnitt des Kanülenrohr von ausreichender Länge, um ein Biegen während des Prozesses der Schneiden und zur Markierung zu vermeiden.
   2. Zeichnen Sie eine 15 mm Referenzlinie auf dem Band aus Schritt 1.1.2 mit einem spitzen Stift. Dies wird als eine Führung für die Markierung von sequenziellen 15 mm Abschnitte auf dem Schlauch mit einem scharfen Permanentmarker dienen.
   3. Tippen Sie auf das Kanülenrohr, an markierten Punkten der langsamen Spinn Trennscheibe des Drehwerkzeuges, um die Rohrklasse. Drehen der Kanüle 180˚ und die Kerbe auf der gegenüberliegenden Seite der Rohrleitung. Nicht durch die Rohrleitung vollständig abgeschnitten, denn es kann zu Verstopfung führen.
   4. Den Schlauch knicken, um sie in ~ 15 mm Abschnitte zu brechen.
   5. Halten jedes geschnittene Ende der Kanüle senkrecht zu der AbschneideScheibe zwischen dem Daumen und Zeigefinger. Drehen Sie den Kanülenschlauch beim Berühren mit der Spitze der großen vorderen Oberfläche der Trennscheibe (dh nicht die Kante). Dies wird eine abgestumpfte Spitze zu erzeugen. Hinweis: Knicken Sie die Kanüle, denn das könnte ein Off-Site-Injektion erhalten.
   6. Ries beide Enden der Kanüle mit einer 26 G Nadel abgeschrägt (brown Hub), um sicherzustellen, daß alle Grate entfernt worden sind, und dass die Kanüle ungehindert ist.
   7. Übergeben Sie eine Probe des Obturator Draht geschnitten, um ~ 35 mm durch den Schnitt Kanüle, um zu überprüfen, dass es keine internen Hindernisse.
   8. Pick up jede Kanüle einzeln mit geklemmten hemostats und messen jede vollendete Kanüle mit einem Lineal, um sicherzustellen, dass es genau 14 mm lang ist.
3. Herstellung Obturatoren:
   1. Klemmen Sie eine Kanüle auf etwa halber Länge mit mittlerem Gewicht, gerade hemostats. Legen Sie den gesperrten Gefäßklemme auf der Bank. Die Kanüle sollte senkrecht zu der Bank sein.
      Hinweis: Diese Kanülesollte nicht in Eingriff, nachdem sie von Hämostatika verriegelt gehalten werden, da es wahrscheinlich ist, gebogen wird.
   2. Ernähren Sie ein Ende des Obturators Draht in die Kanüle, bis es von der Bank erreicht hat. Abprallen den Draht in der Kanüle zu gewährleisten, dass ein Grat ist es nicht aus dem Erreichen der Sitzbank verhindert;. Dh Erreichen des unteren Endes der Kanüle. Proper Obturator Länge wird Verstopfung und zusätzlicher Gewebenarbenbildung zu verhindern.
   3. Biegen Sie den Draht durch Quetschen mit den Fingern, bis ein ~ 30˚ Winkel erreicht, während der Kontakt zwischen dem Verschluss und der Bank. Stellen Sie sicher, dass der Winkel der Biegung ist, dass sie fest bündig mit der Kopfkappe, und der Überschuss nach vorne zeigt, dass es schwieriger für die Ratte zu entfernen.
   4. Entfernen Sie den Draht von der Kanülen und schneiden Sie die überschüssige Teil an ~ 2,5 mm von der Biegung mit kleinen Seitenschneider (Drahtschneider).
      Anmerkung: Mindestens zwei Verschlüsse werden pro Ratte für einen bilateralen Injektion erforderlich, da jeder implantierten Kanüle erfordert einen Obturator. Erstelleneine zusätzliche ~ 35˚ bend Mitte der Obturator wird auch in Verhinderung der Entfernung von dem Tier zu helfen. Speichern sowohl die Kanülen und Obturatoren in getrennten Ampullen (z. B. 20 ml Glas-Scintillations), enthaltend 70% Ethanol (v / v) bis zu ihrer Verwendung, zumindest aber O / N.
4. Herstellung und Prüfung Mikroinjektoren:
   1. Besorgen Sie sich ein Stück Mikroinjektor Nadel Schläuche, die ~ ist 1 m lang.
   2. Halten Sie das eine Ende des Mikroinjektor Schlauch senkrecht gesperrt geraden Gefäßklemmen.
   3. Verdrillen Hämostatikum, während Zug auf den Schlauch, um sie eng um die Gefäßklemme mindestens ein Zeit Spule.
   4. Messen Sie 32 mm von der gegenüberliegenden, lose Ende des Mikroinjektor Schläuche und um diesen Punkt senkrecht mit einem zweiten geraden, mittelschwer hemostat erfassen und sperre sie. Fassen Sie die Mikroinjektor Schlauch mit Gefäßklemmen auf der Seite der 32 mm, die am nächsten zu kennzeichnen, um das lose Ende und nicht auf der Seite, die dem Gefäßklemme mit gewickelten Draht.
   5. Bend der Schlauch hin und her, während die Spannung auf der Rohrleitung, bis er bricht.
      Hinweis: Ein einzelnes, scharf nach oben und unten Biegung wird eine stumpfe Pause, was wünschenswert ist, um sicherzustellen, dass die Mikroinjektion in gewünschte Hirnregion tritt zu produzieren.
   6. Inspizieren Mikroinjektor Schlauch, um sicherzustellen, dass beide Enden gerade sind und dass der Innendurchmesser frei ist.
   7. Erwerben Kanülenrohr, die verwendet werden, um eine Mikroinjektor Kragen herstellen wird.
   8. Messen und markieren sequentielle 5 mm Abschnitte Kanülenrohr mit einem Permanent-Marker und ein 5 mm Referenzlinie auf Band (Schritt 1.1.2) erstellt.
      Hinweis: Jeder Mikroinjektor erfordert einen Kragen. Halsbänder sind einfach kurzen Kanülen in die Mikroinjektor Draht geklebt.
   9. Berühren Kanülenrohr, an markierten Punkten der langsamen Spinn Trennscheibe der Drehwerkzeug, um den Schlauch Kerbe. Drehen der Kanüle 180˚ und die Kerbe auf der gegenüberliegenden Seite der Rohrleitung. Schneiden vollständig können Sie den Schlauch zu verschließen.
   10. Scharfbend Mikroinjektor Kragen Schlauch, um sie in ~ 5 mm Abschnitte zu brechen.
   11. Ries den Innendurchmesser der beiden Enden des Kragens mit einer 26 G Nadel abgeschrägt (brown Hub), um sicherzustellen, dass die meisten der Grate wurden entfernt. Einige kleine Grate die Mikroinjektor Draht zu greifen und damit in Kleben unterstützen.
   12. Schieben Sie einen Kragen auf jede Mikroinjektor Rohr ~ 2 cm vom Ende.
   13. Erstellen Sie einen kleinen Pool von Sekundenkleber in der Ecke eines kleinen wiegen Boot.
   14. Verwenden Schrott Kanüle Schlauch geschnitten, um ~ 25 mm, um eine kleine Menge Sekundenkleber an den Mikroinjektor Rohr gelten ~ 5 mm von einem Ende. Dann schieben Sie die Manschette über diese super Kleberaupe, so dass es ~ 1 mm von dem Ende des Mikroinjektionsrohr. Decken Sie die beiden Enden des Kragens mit Leim.
       Hinweis: Vermeiden einer großen Ansammlung von Sekundenkleber auf dem Kragen, wie es die Kunststoffschlauch von der Abdichtung rund um die Mikroinjektor verhindern. Zwar ist es wichtig, zu vermeiden, Superkleber auf das offene Ende des Mikroinjektor Schläuche, da dies machenMikroinjektorkopf unbrauchbar ist es auch wichtig, den Kragen in der Nähe des Endes gleiten kann void (nicht injizierten) Volumen zu minimieren.
   15. Lehnen Sie das ausgefüllte Mikroinjektor an der Außenseite einen anderen kleinen Boot mit dem Kragen nach oben wiegen und lassen Sie es 24 Stunden trocknen.
   16. Erhalten ~ 8 cm Stück Mikroinjektor Kunststoffschlauch (PE20 oder Äquivalent), 1 ml Spritze, die mit sterilem Wasser gefüllt ist, und 26 g abgeschrägte Nadel (brown Hub).
   17. Befestigen Sie eine 26 G (braun Hub) Nadel auf die Spritze und ziehen Sie den Ausschnitt Schlauch auf die Nadel, die Gewährleistung nicht, um das Rohr zu durchstechen.
   18. Gleiten die Kunststoffschlauch über das Muffenende des getrockneten, komplett Mikroinjektor.
   19. Drücken Sie den mit Wasser gefüllten Spritzenkolben, um die Durchgängigkeit zu testen.
       Hinweis: Das Wasser sollte sehr weit und gerade aus dem Mikroinjektor Spitze sprühen. Wenn der Strom nicht gerade ist, wird der Einspritzstelle nicht richtig sein. Die Quelle einer Seite oder diffuse Spray ist eine schlechte Pause (Schritt 1.4.5). Ein Mikroinjektor sollten nichtt verwendet werden, wenn der Sprühnebel seitlich oder diffus. Kochsalzlösung nicht verwendet werden sollte, wie es sein könnte Mikroinjektorkopf oder Nadel zu verstopfen.
   20. Ziehen Sie die Spritze zurück, um Wasser aus Mikroinjektor entfernen. An einem trockenen, verschlossenen Ampulle, zB einem 20 ml Glasszintillationsröhrchen.
       Hinweis: Mikroinjektoren kann nach der Fertigung mit den meisten ^{Sekundenkleber,} 31 autoklaviert werden, sondern dies muss empirisch ermittelt werden. Alternative Sterilisationstechniken schließen Ethylenoxid und Gammastrahlung.

2. Vorbereiten und Durchführen von Mikroinjektionen

1. Erhalten abgeschlossen Mikroinjektoren, Mikroinjektor Kunststoffschlauch (PE20 oder gleichwertig), Mikroinjektion Pumpe, zwei kleine wiegen Boote, steriles Wasser, 70% Ethanol (v / v), Aceton, zwei gas 1 ul Glasspritzen mit einer stumpfen Nadel (25 G), Wattestäbchen Holz Applikatoren, Ersatz Obturatoren, 1-ml-Spritze, 26 G (braun Hub) Nadel, kleinen gebogenen Pinzette (Art # 7 wird empfohlen), und Labor wipes.
2. Vorbereiten Mikroinjektoren zur Injektion:
   1. Biege abgeschlossen Mikroinjektor 15 mm von dem Ende entgegengesetzt zu dem Kragen, so dass der Winkel zwischen den beiden ist, ~ 95˚.
      Hinweis: Eine genaue Biege Lage ist zwingend notwendig für eine genaue Einspritzstelle. Mit # 7 Pinzette (oder ähnlich), um die Mikroinjektor greifen und nach oben Biegen ist nützlich. Immer wieder messen die Länge vor der Durchführung Mikroinjektionen.
   2. Schneiden Sie den Kunststoffschlauch (PE20) auf ~ 70 cm und gleiten über Mikroinjektor Kragen.
      Hinweis: Hinzufügen von Bandlaschen mit einem Kunststoffrohr in der Nähe sowohl der Mikroinjektor und lose Ende ist nützlich beim Ausfüllen Injektionen, vor allem, wenn die Injektion zwei verschiedene Lösungen. Tabs sind nicht für beide Rohre empfohlen, da sie während der Injektion umständlich geworden.
3. Vorbereiten Pumpe für Mikroinjektionen:
   1. Schalten Sie Pumpe.
   2. Set Durchmesser der Mikroinjektionsnadel, gewünschte Infusionsrate und Soll-Einspritzmenge.
      Hinweis: Die Infusion Rattee und Injektionsvolumen ist abhängig von experimentellen Anforderungen. Dies beruht auf der Diskussion erarbeitet. Einige Pumpen haben Spritze Tabellen vorinstalliert. Wenn nicht, kann eine Spritze Tabelle auf die Herstellung Webseite (n) gefunden werden.
   3. Pumpenaggregat Modus zu "Volume", so dass eine genaue Volumen wird automatisch geliefert. Wenn Modus "Pumpe" wird stattdessen ausgewählt, muss der Experimentator manuell die Pumpe zu stoppen.
   4. Stellen Sie die Pumpe Rücklaufsperre, damit die Spritze in die Einspritzvolumen zuzüglich einer 0,2 & mgr; l zu füllen.
4. Vorbereiten Mikroinjektionsspritze und Mikroinjektor zur Injektion:
   1. Verriegeln Sie jedes gasdichte Mikroinjektionsspritze in das Rack der Mikroinjektionspumpe.
   2. Setzen Sie die Spitze des gasdichten Spritze in das in einem kleinen enthaltenen sterilem Wasser wiegen Boot und sanft flattern den Kolben, um den internen Draht zu schmieren. Gleichmäßig ziehen Sie den Kolben in die Rücklaufsperre an der Pumpe mit Wasser zu füllen.
   3. Schieben Sie den PE20 Schlauch, die Zusammenarbeit istzur Mikroinjektor (im Schritt 2.2) auf eine 26 G (brown Hub) Nadel in eine 1 ml Spritze, die mit sterilem Wasser gefüllt ist, angebracht verkehrstechnisch. Spray sterilem Wasser durch die Mikroinjektor und überprüfen Sprühbild und Distanz.
      Hinweis: Das Wasser sollte sehr weit und gerade aus dem Mikroinjektor Spitze sprühen. Wenn der Strom nicht gerade ist, wird der Einspritzstelle nicht richtig sein.
   4. Legen Sie die sterilisiert Mikroinjektor auf einen sterilen Bereich.
   5. Schieben Sie den Schlauch aus der Nadel, aufrecht zwischen Mikroinjektor Schlauch mit Wasser tropft aus, während auch Schneiden Sie den Schlauch unter dem Bereich durch die Nadel beschädigt wird.
   6. Schieben Sie die Mikroinjektion Spritzenkolben leicht nach vorne, um einen Tropfen auf dem Ende der Nadel auf die Nadel zu erstellen und schieben Sie den mit Wasser gefüllten PE20 Schlauch (das ist mit dem Mikroinjektor angeschlossen).
      Hinweis: Dies wird eine Flüssigkeit-zu-Flüssigkeit-Verbindung, die entsprechenden Gegendruck ermöglichen wird, die eine Verstopfung, die zu bilden könnten verdrängen könnte erstellendie Spitze des Mikroinjektor.
   7. Drücken Sie den Kolben ganz nach vorne, um für die Probenbelastung vorzubereiten und sicherzustellen, dass keine Spur Ethanol in der Mikroinjektor bleibt.
   8. Überprüfen Sie die Einrichtung auf Dichtheit durch Berühren der Wassertropfen, die an der Spitze des Mikroinjektor zu einer sauberen Labor gebildet hat wischen mehrmals.
5. Hinweis: Wenn Sie berühren, um das Labor zu wischen, nur einen nassen Fleck bilden sollte. Wenn es mehr Tropfen gibt es ein Leck in dem System.
6. Vermeiden Sie Leckagen durch Steuerung Superkleber Anwendung (Schritt 1.4.14) und durch Trimmen der PE20 Schlauch mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge zu jeder Zeit, dass das PE20 Schlauch wird von jeder Verbindung entfernt wird. Zusätzlich wiederholen Sie die Schritte 2.4.3 bis 2.4.8, um das Leck zu beheben.
7. Ziehen Spritzenkolben zurück 0,2 & mgr; l; Erzeugen einer Blase zwischen dem sterilen Wasser im PE20 Schlauch / Mikroinjektor und der Lösung, die injiziert werden.
8. Anmerkung: Diese Blase verhindert eine Verdünnung des Injektats, Verunreinigung des Wassers und erlaubtzum Überwachen des Einspritzvorganges, da es während der Injektion zu verschieben. Eine einzelne, feste Blase sollte hergestellt werden. Wenn sie defekt ist, vorhanden ist, ein Leck oder die Mikroinjektor Spitze verschlossen; was anzeigt, dass Schritt 2.4.8 (und die dazugehörige Anmerkung) wiederholt werden soll.
9. Zeigen die Mikroinjektor in das Reagenz injiziert werden soll und ziehen Sie langsam den Spritzenkolben in die Rücklaufsperre.
10. Vorbereiten Tier zur Injektion:
11. Halten Sie die Brust der Ratte gegen die Brust des Experimentators. Reinigen Sie den Bereich um Kanülen mit einem Baumwoll-Applikator in 70% Ethanol eingeweicht (v / v).
12. Hinweis: Bei sachgemäßer Handhabung können Mäuse schonend in einer hohlen Hand zurückgehalten werden. Andernfalls kann scruffing erforderlich.
13. Verschlüsse mit kleinen Pinzette und platzieren Sie in wiegen Boot mit 70% Ethanol (v / v).
14. Darstellende Injektionen:
15. Zeigen gefüllt Mikroinjektor (Schritt 2.4.10) in die Kanüle. Drücken Sie Start auf Mikroinjektionspumpe und Monitor Blasenbewegung.
16. Hinweis: Es may notwendig sein, mit leichtem Druck, um sicherzustellen, dass Mikroinjektoren nicht heben anzuwenden. Die Blase (in Schritt 2.4.9 gebildet) sollte gleichmäßig voranzubringen und vollständig in die Mikroinjektor eingeben.
17. Entfernen der Mikroinjektoren aus der Kanüle und ersetzen Obturatoren, sobald die Injektion abgeschlossen ist und die Nacheinspritzung Diffusionsdauer vergangen ist.
18. Hinweis: Typische Nacheinspritzung Diffusionszeiten sind 2-4 min für die pharmakologische Reagenzien und 2-10 min auf Viren. Verlassen des Mikroinjektor in während der Postinfusionsdauer verhindert, dass das Injektat bei Rückflusssicherungskopie der Kanülen anstatt Diffusion in das Gewebe. Obturatoren Ort an der Seite des Ethanols gefüllten Wägeschiffchen, damit das Ethanol mit dem Einsetzen der Kanüle in entleeren.

3. Post-Injection Clean Up

1. Erhalten Sie ein kleines Fläschchen mit jeweils: steriles Wasser, 70% EtOH und Aceton.
2. Reinigungs Mikroinjektor und Mikroinjektionsspritze:
   1. Entfernen Glasspritzes vom Pumpenspritze Zahnstange und die Mikroinjektion Schlauch von Glasspritze.
   2. Trennen Mikroinjektor Schlauch von Glasspritze und fügen Sie eine 1 ml Spritze über eine 26 G-Nadel (braun-Hub) mit sterilem Wasser auf die Mikroinjektor Schlauch gefüllt. Drücken Sie die 1 ml Spritzenkolben nach vorne, um 0,3 ml zu vertreiben ~. Weiter, berühren Sie die Spitze des Mikroinjektor zu einem Labor-wischen und ziehen Luft zurück durch die Mikroinjektor.
      Hinweis: Die Mikroinjektor und Schläuche können für ähnliche Experimente wiederverwendet werden, wenn als klug werden.
   3. Zeigen Glasspritzennadel in sterilem Wasser und zeichnen Kolben vollständig zurück. Als nächstes drücken Sie den Kolben ganz nach vorn zu spülen. Berühren Sie die Glasspritzenspitze in ein Labor zu wischen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit bleibt.
   4. Wiederholen Sie Schritt 3.2.3 mit sterilem Wasser, Luft, 70% EtOH und Aceton in der folgenden Reihenfolge: steriles Wasser, sterile Wasser, Luft, Luft, 70% EtOH, 70% EtOH, Luft, Luft, Aceton, Aceton, Luft, Luft. Darstellende alle diese Reinigungsschritte trägt zur Erhaltung des Mikroinjektionsspritze.
   5. Legen Sie die Mikroinjektor Spritze (n) in die Verpackung und ziehen Kolben zurück, um 0,05 & mgr; l.
      Hinweis: Dies ist wichtig, denn sie ermöglicht den Kolben geschoben oder gezogen werden kann, um einen Kolben stecken die auftreten können, sollte jeder Salzablagerungen bilden nach der Lagerung zu entfernen.

4. Programmierung der Motivation Assay

1. Melden Sie sich bei Graphic Staat mit Administratoranmeldeinformationen.
2. Wählen oder erstellen Sie entsprechende Datenbank.
3. Erstellen Stufensprung Stahlliste:
   1. Wählen Sie Listen> Datenbankebene Listen> Veranstaltungs Transition Parameterlisten.
   2. Wählen Sie "Hinzufügen". Geben Sie entsprechende Listennummer (L #) und Beschreibung.
   3. Wählen Sie 'Add Events'.
   4. Geben Sie die erste Verstärkungsplan-Wert, und wählen Sie "Hinzufügen". Wiederholen.
      Anmerkung: Die Werte können unter Verwendung der Formel in denen der Stufen schedule = ^{5e (j * (reinforcer verdient + 1))} -5 bestimmen ^7.Um diese Gleichung maßzuschneidern, um die Hypothese richtig zu testen, muss der Wert j empirisch bestimmt oder aus der Literatur erhalten werden.
   5. Wählen Sie "Um" im Feld "Selection Bestellen.
   6. Wählen Sie "Halten Value = zu: ____" im "Fertige" Box. Geben Sie die Stahlliste Wert in das Textfeld, das weit über erwartet reagiert. Dadurch wird der Aufwand für alle folgenden Einträge sein, sobald die Liste erschöpft ist.
4. Erstellen eines Versuchsprotokoll:
   Hinweis: Graphic Staat begibt, das Thema durch eine Reihe von Staaten, die verlassen auf beiden Zeit- oder Leistungskriterien basieren. Stellen Sie alle diskreten und kontextuellen Hinweise und Parameter im Folgenden als '$' markiert, um die Hypothese zu testen angemessen geprüft.
   1. Wählen Sie Datei> Neues Experiment Protokoll.
   2. Geben Sie die gewünschte Protokollnummer und eine Beschreibung in die entsprechenden Textfeld ein.
   3. Wählen Sie "Staat Creation".
   4. Stellen Sie alle Reize sowohl für die "RDY - Bereit Staat" und "FIN - fertigen Zustand.
   5. Wählen Sie "Neue Staat" und nennen Sie es "S2 - PR reagieren.
   6. Wählen Sie "Neue Staat" und nennen Sie es "S3 -. PR Reinforcer und Cue '
   7. Wählen Sie "Neue Staat" und nennen Sie es "S4 - Timeout '.
   8. Markieren Sie "S1" und nennen Sie es "S1 -. Habituation"
      1. Wählen Sie Add 'Time Gehe zu.'
      2. Geben Sie geeigneten Zeitpunkt ($) und Einheiten ($), z. B., Minuten und wählen Sie 'S2' von TO S Dropdown-Feld. Die Zeiteinheit "Einheiten" wurde festgestellt, wenn die Datenbank ursprünglich erstellt.
         Hinweis: Die Übergangszeit geschaffen sollte ähnlich [Nach $ Minuten GO P = 100%, bis S2] lesen Abbildung 1 ist ein Beispiel für diese Veranstaltung einmal erstellt.

   
   Abbildung 1. Repräsentative Programmierbeispiel # 1. In diesem Fall ist eine Zeit begrenzt Zustand dargestellt, bei dem ein benutzerdefinierter Wert von $, hier in Minuten angezeigt, zeigt an, wenn der aktuelle Zustand verlassen sollte in den Zustand 2 (S2).

   9. Markieren Sie "S2 - PR reagieren.
      1. Wählen Sie Add 'Veranstaltung Gehe zu.'
      2. Geben Sie Listennamen die Stufensprung Zeitplan, der in Schritt 4.3 in das erste Textfeld als L $ (zB L1) erstellt wurde, enthält, wählen Sie die entsprechende operandum (z. B. Hebel oder Nase Sack) aus der ersten Dropdown-Feld, und wählen Sie " S3 'aus TO S Dropdown-Feld.
         Hinweis: Die erstellte Ereignis kann gelesen ähnlich [IF L $ 1 - Aktive GO P = 100%, bis S3]. Die Kennung 1 - Aktive wurde während der Datenbankerstellung bezeichnet. Hier 1 - Aktiveist mit dem operandum in-Schalter ein steckt Bezug.
      3. Wählen Sie 'Add Zeit Gehe zu.'
      4. Das Kontrollkästchen "R", geben Sie die entsprechende Zeit und Einheiten ($), und wählen Sie aus TO S 'FIN' Dropdown-Feld.
         Hinweis: Die erstellten Zeitereignis kann ähnlich zu lesen [R (markiert) IF $ Minuten GO P = 100% auf FIN]. Dadurch wird sichergestellt, dass die Sitzung endet, wenn es keine Aktivität auf diesem operandum nach der eingestellten Schwelle;. Das heißt, wird die Session-Timeout, nachdem das Tier hält reagiert auf die Verstärker-gepaart operandum für den festgelegten Zeitraum.
      5. Wählen Sie Add 'Veranstaltung Gehe zu.'
      6. Aktivieren Sie das Feld "R", geben Sie 1 in das erste Textfeld, wählen Sie die Freigabe der entsprechenden operandum vom ersten Dropdown-Feld, und wählen Sie 'S2' von TO S Dropdown-Feld.
         Hinweis: Die erstellte Ereignis kann ähnlich zu lesen [R (markiert) Nach $ [1] Aktiv GO P = 100%, bis S2]. Dieser Schritt stellt sicher, dass beim Lösen der operandum(durch Klammern oben angegeben), dass der Staat erneut eingegeben, wodurch das Zurücksetzen Session timeout den Schwellenwert (4.4.9.4). An diesem Punkt wird der Staat zu verlassen, wenn der Stufensprung in der Liste enthalten ist abgeschlossen (Schritt 4.4.9.2) oder die Sitzung abläuft (Schritt 4.4.9.4). Somit wird jedes Mal, dass der operandum aktiviert wird, zählt es in Richtung der Stufensprung. . Und jedes Mal, dass die operandum inaktiviert, zB wird der Hebel freigegeben oder die Nase Sack verlassen wird, ist Session-Timeout der Schwellenwert (Schritt 4.4.9.4) Reset 2 stellt alle für 'S2 programmiert Gänge - PR reagieren.. '

   
   Abbildung 2. Repräsentative Programmierbeispiel Nr. 2. Hier wird der Zustand bei einem von zwei Kriterien verlassen. L $ ist die Stufensprung Plan in Schritt 4.3 erstellt. Nach Zeitplan completIonen, tritt der Staat bis 3 (S3) Zustand. Beachten Sie, dass dieses Kriterium nicht über ein R, die der Zeitplan recht voran als Anfang wieder bei jedem Wiedereintritt in diesem Zustand ermöglicht. Der Staat kann auch Ausfahrt nach '$' Minuten zu erklären, FIN. Dies ist das vorgegebene Zeitlimit Schwelle, ab der die Sitzung zu beenden, wenn keine Antwort innerhalb dieses Fensters auftritt. Dies wird in der Diskussion erläutert. Schließlich wird der Session-Timeout Schwelle bei jedem operandum Release zurückgesetzt. So '[1]' zeigt Freisetzung des operandum '1'.

   9. Markieren Sie "S3 - PR Reinforcer und Cue. '
      1. Wählen Sie 'Add Zeit gehen Sie auf "
      2. Geben Sie zu gegebener Zeit und Einheiten, um den Verstärker ($) von TO S Dropdown-Box zu liefern, und wählen Sie 'S4'.
         Hinweis: Die erstellten Zeitereignis kann gelesen ähnlich [Nach $ Sekunden GO P = 100%, bis S4].
   10. Markieren Sie "S4 - Timeout. '
       1. Wählen Sie 'Time Go To "hinzufügen
       2. Geben Sie angemessene Zeit und Einheiten in einem inaktiven Zustand ($) folgenden Verstärker Liefer bleiben, und wählen Sie 'S2' von TO S Dropdown-Box.
          Hinweis: Die erstellten Zeitereignis kann gelesen ähnlich [Nach $ Sekunden GO P = 100%, bis S2]. Staat "S4 - Timeout" nicht für alle Ausführungen erforderlich.
   11. Wählen Entschlossenheit Staaten.
       Hinweis: Dieses Protokoll ist jetzt betriebsbereit.

Ergebnisse

Hier veranschaulichen wir Beispiele der Ergebnisse, die mit dem obigen Verfahren erhalten werden können. Gezeigten ersten ist ein typischer Bereich, der durch virale Vektoren (Abbildung 3) transfiziert. Im allgemeinen wird eine transfizierte Volumen von ~ 1 ^mm 3 in Striatum-Gewebe erhalten. Das Volumen der transfizierten Bereich kann für Serienteile mit Cavalieri Methode quantifiziert werden ³² Wichtig ist, hängt die transfizierten Volumen von vielen Faktoren ab, wie der Art des Gewebes, transfiziert. viralen Serotyp; Promotor; Rate und das Volumen eingespritzt wird; Anzahl der Teilchen eingespritzt wird; Injektat pH; und ob hyperosmolaren Reagenzien, wie Mannit, wurden verwendet. ^33,34 Typischerweise microinject wir ¹⁰ 12 Partikel / ml, 1 ul / Seite über 10 min, und ermöglichen weitere 7 min vor dem Austausch Obturatoren. Zusätzlich ist das Injektat im allgemeinen etwa pH 8. Weiter wird gezeigt, dass die Motivation kann entweder durch transgene Expression manipuliert werden (Figur 4)oder pharmakologische Reagenz Mikroinjektion (Abbildung 5).

In Abbildung 4, ausgedrückt wir einen Designer Receptor Exklusiv von Designer Drugs (DREADDs) aktiviert. Die DREADD Rezeptor-kodierende Region wurde von einem Internal Ribosome Entry Site und mCitrine Kassetten gefolgt. Die mCitrine erlaubt eine komfortable Visualisierung von transfizierten Zellen. Die DREADD wurde der heterotrimeren G-Protein-gekoppelten Gaq. Aktivierung des Gaq gekoppelten DREADD können Astrozyten ^28,35 und DREADD selbst stimulieren kann durch systemische Verabreichung von Clozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip) aktiviert werden. ^14,22,36 Ratten wurden trainiert Hebel reagieren für Ethanol Verstärkung, wo 3 Hebelpressen ergab 1 Chance, während der täglichen 1 Stunde Sitzungen mehr als 60 zusammenhängende Tage trinken. Als nächstes wurden die Ratten in Abstinenz gezwungen, und Gaq gekoppelten DREADDs wurden ausgedrückt in Nucleus accumbens Kern Astrozyten. Nach 3 Wochen der Abstinenz, die Motivation, Selbst admi Nister Ethanol wurde durch Haltepunkt gemessen. ^21,27-30 Aktivierung des Nucleus accumbens Kern Astrozyten über systemische CNO Verwaltung, verringert die Motivation von Ratten nach Enthaltsamkeit im Vergleich zu Vehikel, um Ethanol Selbstverwaltung wieder aufzunehmen. Wichtig ist, hatte CNO keine Wirkung in einer ebenso geschult Kohorte, die Green Fluorescent Protein anstelle des DREADD exprimiert, wurde.

Figur 3. Repräsentative ventralen Striatum Region von mikroinjizierten Virus transfiziert. Dieses Bild stellt die Region des Nucleus accumbens Astrozyten, die durch Befolgen des obigen Verfahrens transfiziert wurden. Die Daten werden von Bull et al. ¹³ mit der Erlaubnis des Urheberrechtsinhabers nachgedruckt. Details finden Sie in der Veröffentlichung und dem zugehörigen Zusatzmaterial gefunden werden.blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Motivation von Ratten selbst verwalten Ethanol wurde durch die Aktivierung eines Transgens, das überexprimiert im Nucleus accumbens Kern Astrozyten. Das Virus wurde mikroinjiziert und nach Berücksichtigung einer Woche für das Virus, um auszudrücken, Motivation über Haltepunkt gemessen wurde, reduziert. Das Transgen exprimiert wurde, eine Designer-Rezeptor Exklusiv von Designer Drugs (DREADDs) aktiviert. Ein Einweg-ANOVA (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), gefolgt von einer Scheffé post-hoc ergab, dass die Aktivierung des DREADD durch systemische Verabreichung von Clozapin-N-oxid (CNO, 3 mg / kg, ip ) reduzierte signifikant die Motivation der Ratten, die Selbstadministration Ethanol nach Enthaltsamkeit im Vergleich zum Fahrzeug CNO keine Wirkung in einer ebenso geschult Kohorte, die Green Fluorescent Protein (GFP exprimiert, wurde hatte) anstelle der DREADD. Die Daten werden von Bull et al. ¹³ mit der Erlaubnis des Urheberrechtsinhabers nachgedruckt. Details finden Sie in der Veröffentlichung und dem zugehörigen Zusatzmaterial gefunden werden.

Abbildung 5. Mikroinjektion von Gap Junction-Blocker erhöht die Motivation der Ratten, die selbst verabreichen Ethanol nach Abstinenz Zwei Gap Junction-Blocker wurden auf ihre Wirkung auf die Motivation (via Haltepunkt gemessen) von Ratten, die selbst verabreichen Ethanol bewertet:. Mefloquin und 18- alpha-Glycyrrhetinsäure (18-α). Ein Zwei-Wege ANOVA zeigte, dass Mikroinjektion von Gap-Junction-Blocker in den Nucleus accumbens Kern erhöht die Motivation des Ratten selbst verabreichen Ethanol nach Abstinenz (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Die Daten werden von Bull et al. ¹³ mit der Erlaubnis des Urheberrechtsinhabers nachgedruckt. Details finden Sie in der Veröffentlichung zu finden unddie begleitende Zusatzmaterial.

Diskussion

Das hier vorgestellte Verfahren ist ein effizientes Mittel, um die Mikroinjektion Kanülen und Mikroinjektoren, die bei der Aufklärung der molekularen Substrate motivierten Verhaltens helfen werden zu fertigen. Diese Methode bietet mehrere Vorteile. Erstens, durch die Herstellung der eigenen Implantate und Mikroinjektoren, neuartige experimentelle Parameter können schnell optimiert werden, dh, braucht man nicht, um maßgeschneiderte Komponenten warten. Zweitens aufgrund des kleinen Durchmessers der Kanüle mehr Kanülen können gleichzeitig implantiert werden. Dies verkürzt die erforderliche Operationszeit, die Überlebensfähigkeit verbessern kann, und ermöglicht auch mehrere Implantate pro Tier. Drittens, die verwendet werden, die operanten Kammern steuern Software leicht aufnimmt Stufensprung Pläne, da ein festes Verhältnis Paradigma kann schnell auf eine progressive Verhältnis Paradigma, indem einfach ein Ereignis Gangsparameterliste, die die gewünschte Verstärkungsschema enthält umgewandelt werden.

Seinim Großen und Ganzen nützlich, wurde ein generischer Mikroinjektionsverfahren vorgestellt, die breit anwendbar für die Mikroinjektion von nahezu jedem Reagenz zur Zeit zur Verfügung stehen soll. Daher erwarten wir, dass diese Technik wird auch weiterhin von ähnlichen hohen Nutzen in der Zukunft mit geringen Modifikationen sein. Indem nur einige Variablen, kann dieser Ansatz auf eine große Anzahl von Reagenzien angewendet werden. Parameter, die am häufigsten betätigt werden würde, sind die Länge, die der Mikroinjektor ragt aus der Kanüle, Injektionsvolumen und die Geschwindigkeit der Injektion. Beispielsweise kann gewünscht sein, um die Einspritzvorrichtung weiter von der Kanülenspitze vorstehen, um die Glianarbe die typischerweise bildet sich um chronische Implantate zu vermeiden. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, ein größeres Volumen zu injizieren. Für Striatum Virus Mikroinjektionen wird ein Volumen von 1 & mgr; l der Regel verwendet, und dieses Volumen wird in der Regel über einen längeren Zeitraum eingespritzt (häufig 7-10 min plus 3 - 10 min zusätzliche Diffusionszeit) im Vergleich zu dem Einsatzd für die pharmakologische Reagenzien (in der Regel 0,3 bis 0,5 & mgr; l mehr als 2 - 3 Minuten plus 1 - 3 Minuten zusätzliche Diffusionszeit). Der Benutzer sollte die Literatur zu konsultieren und / oder empirisch ermitteln, die am besten für ihre Bedürfnisse Parameter. Unabhängig davon ist der Erfolg dieses Verfahrens kritisch abhängig von 4 Variablen: 1) Kanülenlänge, 2) Mikroinjektor Länge, 3) Qualität der Mikroinjektor Sprühbild, und 4) die Integrität des Systems vor der Injektion. Weil die Mikroinjektion Lage ist abhängig von der Tiefe, die der Mikroinjektor ragt aus der Kanüle, ist es zwingend notwendig, dass beide Kanülen (Schritt 1.2.8) und Mikroinjektor Länge (post-Biege, Schritt 2.2.1) beide genau bekannt und einheitlich zwischen allen Fächern . Dies kann leicht durch leicht Ablehnung jeder implementieren, die nicht die erforderliche Länge an der letzten Nachmessen gesteuert werden. Darüber hinaus kann der Einspritzstelle lediglich vorhergesagt werden kann, wenn sie auftritt unmittelbar unterhalb der Führungskanüle. So jede Mikroinjektor dass does nicht einen langen, feinen Strahl auf Testspray (Schritte 2.4.6) ist abzulehnen. Ein Qualitäts Einspritzung wird auch auf die Integrität des Systems vor der Injektion zusammen. Wenn nach der Abgabe das gesamte Wasser aus dem Injektor (vor dem Füllen mit Reagenz) mehrere Punkte auf dem Lab-wischen beobachtet, dann muss ein Leck behoben werden (Hinweis zu Schritt 2.4.8). Ferner, wenn die Blase (Schritt 2.4.9), die das Medikament aus dem Wasser in dem PE20 Schlauch trennt, ist nicht eine, einzige Blase (nach dem Füllen der Mikroinjektorkopf mit Reagenz), dann wird das Einspritzventil teilweise verstopft. Diese verstopfen könnte entweder verhindern oder umleiten die Injektion. Auch dies kann leicht behoben werden (Hinweis auf Schritt 2.4.8).

Sollte man wünschen, microinject während sich das Tier in den stereotaktischen Rahmen gibt es drei Möglichkeiten. Zunächst könnte man die Länge der Mikroinjektor Kragens, so daß er fest von dem stereotaktischen Manipulator gehalten und erstrecken sich weit genug, um den Anschluss an PE20 Schlauch erlauben erhöhen. Zweitens aufE könnte zeitlich implantieren eine Kanüle und verwenden Sie die Standard Mikroinjektor hier vorgestellt. Drittens, eine gezeichnete und polierten Glaspipetten verwenden. ^16,17

Eine erhebliche Einschränkung der hier vorgestellten Verfahren ist, dass es am besten in gut gehandhabt Ratten, die mit dem Verfahren vertraut sind, durchgeführt. Ratten für den im Ergebnisteil beschriebenen Daten verwendet wird, benötigt keine speziellen Handhabungsverfahren, weil die gleiche Sucher gehandhabt die Ratten täglich für mehr als 2 Monate. Dies beinhaltete tägliche Beobachtung und Manipulation des chirurgischen Implantats für mindestens 2 Wochen. Jedoch können Ratten rasch durch eine Anzahl von Techniken, die vor dem Vorimpuls-Hemmtest verwendet werden, die durch Stress beeinflusst werden kann gewöhnt werden. Diese speziellen Gewöhnung Techniken wurden gut vorher beschrieben. ⁴³ Zusätzlich zu diesen Verfahren ist es ratsam, dass Ratten, die Mikroinjektion Verfahren, bei dem verkürzte Mikroinjektoren verwendet du gewöhnt werdenRing 'Schein' Injektionen. Während dieser Scheininjektionen ist es kritisch, daß der Mikroinjektor, um Gewebeschäden zu begrenzen nicht in das Gewebe hineinragen. Mit anderen Worten sollte der Mikroinjektor nicht mehr als 14 mm gebogen werden. Somit könnte die gründliche Gewöhnung für eine optimale Implementierung dieser Technik benötigt als Einschränkung betrachtet werden.

Während mehrere Verhaltensparadigmen existieren, um die Motivation zu messen, wird der Stufensprung häufig verwendet, um den Aufwand, die Gegenstand bereit ist, auszuüben, um einen Verstärker quantifizieren. Die fortschreitende Verhältnis Paradigma erzeugt eine Maßnahme als Haltepunkt bekannt, die oft als die maximale Anzahl von Hebelpressen in der letzten abgeschlossen Verhältnis definiert ist;.. Dh maximale reagiert, dass generiert einen Verstärker ²¹ der Stufensprung ist es, Stärke Verstärker empfindlich. Beispielsweise höhere Kokain (oder Saccharose) Dosen produzieren eine höhere Haltepunkt und unteren Kokain (oder Saccharose) Dosen ergeben eine niedrigere breakpunkt. ^21,22 Dementsprechend ist Haltepunkt ein routinemäßig verwendet Proxy für die Motivation und / oder Verstärkungs Wirksamkeit. ^21,23-26 Da die Absicht der Haltepunkt ist, um zu bestimmen, wenn das Tier nicht mehr reagiert, ein wichtiger Parameter, der fortschreitenden Verhältnis Paradigma Sitzungslänge. Finite-Sitzung Längen können eine falsche Mütze auf Breakpoint-Werte setzen und dies kann durch Vorbehandlungen, die abnorm die Rate der Selbstverwaltung oder dieser Erhöhung post-Verstärkung Pausieren verringern verstärkt werden. . Dieses verwechseln kann durch eine beliebige Anzahl von Ansätzen überwunden werden;. B. Sitzungen, die beendet wird, wenn das Tier zurückgehalten reagieren mit einem Vielfachen der durchschnittlichen Zwischeninfusionsintervall ^{44 A} häufiger angewendet Variante dieses Ansatzes besteht darin, Sitzungen einmal beenden reagiert hat durch eine empirisch ermittelte Wert, der über Themen konstant gehalten wird einbehalten. Wir haben die Methode, diesen Ansatz in Schritt 4.4.9.11 gelten vorgesehen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cannula Tubing	Amazon Supply/ Small Parts	HTXX-26T-60	26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA
Obturator	Amazon Supply/ Small Parts	GWXX-0080-30-05	33 gauge, Wire S/S 316LVM 0.008 IN
Microinjector Wire	MicroGroup	33RW 304	33 gauge
Super Glue	Loctite	3924AC	Liquid, Non-gel, can be autoclaved
Microinjector Plastic Tubing	Becton Dickson	427406	PE20
Medium Weight Hemostats	World Precision Instruments	501241-G
Ruler	Fisher	09-016	150 mm
#7 Forceps	Stoelting	52100-77	Dumont, Dumostar
Rotary Tool	Dremmel	285	Two-speeds
Cut-off Disc	McMaster Carr	3602	15/16" x 0.025"
Microinjection Pump	Harvard Apparatus	PhD 2000
1 ul Glass Syringe	Hamilton	7001KH	Needle Style: 25s/2.75"/3
Cotton Tipped Applicator	Fisher	23-400-101
Lab Wipes	Kimwipes	34133
Operant Software	Coulbourn	Graphic State
Operant Chambers	Coulborun	Habitest