Immunofluorescence לפקח על הספיגה הסלולארית של לקטופרין האדם והפעילות הקשורה אנטי נגד וירוס הצהבת מסוג C

Summary

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

Abstract

Immunofluorescence הוא טכניקת מעבדה הנפוצה ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה. הוא משמש בדרך כלל כדי להמחיש את ההפצה ו / או לוקליזציה של מולקולת יעד בתאים וברקמות. Immunofluorescence מסתמך על הספציפיות של נוגדנים שכותרתו ניאון נגד אנטיגנים המתאימים בתוך תא. שניהם יכולים לשמש גישות immunofluorescence ישירות ועקיפות הנשענות על השימוש בנוגדנים קשורים עם fluorochrome. immunofluorescence הישיר בתדירות נמוכה יותר בשימוש משום שהוא מספק אות נמוכה, כרוך בעלות גבוהה יותר ופחות גמישות. לעומת זאת, immunofluorescence העקיף הוא יותר נפוץ בגלל הרגישות הגבוהה שלה ומספק אות מוגברת מאז נוגדן אחד או יותר משני יכול לצרף לכל נוגדן ראשוני. בכתב היד הזה, שניהם במיקרוסקופ epifluorescence ומיקרוסקופיה confocal שמשו כדי לפקח על ההפנמה של לקטופרין האנושי, מרכיב חשוב של מערכת החיסוןמערכת, לתאי כבד. יתר על כן, אנו במעקב הפוטנציאל המעכב של HLF על השכפול תאיים של וירוס הצהבת מסוג C באמצעות immunofluorescence. שני היתרונות וחסרונות הקשורים בגישות אלה נדונים.

Introduction

Immunofluorescence is a technique that uses a fluorescence microscope to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in a biological sample. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell¹. It is typically used on tissue sections and cultured cell lines in order to analyze the distribution/localization of various biological molecules such as proteins, nucleic acids and glycans. It should be noted that immunofluorescence is often used in combination with other non-antibody methods of fluorescent staining such as the 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) stains which are typically used to label DNA². Moreover, this technique involves fixation of the cells which allows the analysis of cells at a specific time.

Different types of microscopes can be used to analyze immunofluorescence samples. The simplest is the epifluorescence microscope (Figure 1) for which excitation of the fluorochrome and detection of the fluorescence are done through the same light path³. Because most of the excitation light is transmitted through the sample, only reflected excitatory light can reach the objective together with the emitted light. This approach unfortunately leadsto a frequent high signal to noise ratio.In contrast, confocal microscopy (Figure 2) offers a distinct advantage for increasing optical resolution and contrast by means of adding a spatial pinhole placed at the confocal plane of the lens to eliminate out-of-focus light⁴. This approach allows the reconstruction of three-dimensional structures from the obtained images. However, since an important fraction of the light from the sample is blocked at the pinhole, long exposures are often required.

There are two classes of immunofluorescence techniques, primary (or direct) and secondary (or indirect). Direct immunofluorescence involves a primary antibody linked with a fluorochrome (Figure 3). This method is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility¹. Moreover, such antibodies are generally harder to find commercially. On the other hand, the direct attachment of the fluorochrome to the antibody significantly reduces the number of steps in the procedure, saving time and frequently reducing non-specific background signal. This also limits the possibility of antibody cross-reactivty.

Indirect immunofluorescence involves a primary unlabelled antibody which is specific for the epitope of interest¹. A secondary antibody which carries the fluorochrome then recognizes the primary antibody and binds to it (Figure 3). Although indirect immunofluorescence is more complex and time consuming than direct immunofluorescence, it is frequently used because of its high sensitivity and it also provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In addition, a vast array of commercial secondary antibodies is available at affordable prices.

Hepatitis C virus (HCV) is a major public-health problem with 130-170 million individuals chronically infected worldwide. In order to halt the epidemic, therapy against HCV will need to be both effective and widely available. Studies focusing on safe and affordable natural product active against HCV have revealed the antiviral activity of the human Lactoferrin (hLF) protein which binds and neutralizes the circulating virion⁵. In the current study, investigation of hLF activity on the HCV subgenomic replicon system, which is independent from viral entry and shedding, revealed a distinct antireplicative activity of hLF against HCV. This manuscript presents a study in which immunofluorescence assays were performed to monitor the internalization of hLF, an important component of the immune system⁶, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus (HCV).

Protocol

1. תאי הכנה וטיפול

1. בצלחת 24 גם, לשים כיסוי זכוכית בחלק התחתון של הבארות. לשטוף היטב עם כל בופר פוספט (PBS).
2. תאי זרע הא-7 תומכים replicon subgenomic HCV בכל טוב לצפיפות של 5 × 10 ⁴ תאים / טוב. אם אין טיפול לעשות, יכולים להיות שנזרעו התאים בצפיפות גבוהה. מדיום התרבות הוא הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עובריים בסרום שור (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, פירובט נתרן 1 מ"מ ו -250 מ"ג / מיליליטר G-418 (כדי לשמור על replicon).
3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. למחרת, טיפול בתאים עם 3 מיקרומטר של HLF מטוהר מחלב אנושי.

2. Paraformaldehyde / סוכרוז הכנה (12% סוכרוז PAF ו -12%)

1. שים 500 מיליליטר של PBS בכוס ומחמם אותו בין 20 ° C ו 30 מעלות צלזיוס. ממיסים 60 גרם של סוכרוז בPBS. ממיסים 60 גרם של paraformaldehyde (PAF) בפתרון PBS / סוכרוז. לאט לאט להוסיף NaOH 2N (3 עד 7 מיליליטר) עד פתרון ברור מתקבל.
2. התאם ל- pH 7.4 עם HCl. נפח מלא 500 מיליליטר עם PBS. סנן לפי הכבידה על מסנן Whatman. לפני השימוש, לדלל את הפתרון עם PBS לריכוז סופי של PAF 4% וסוכרוז 4% (אחסון 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע לכל היותר 1).

3. Immunofluorescence

1. בזמן הרצוי (0 שעה, שעה 2 או 24 שעות של טיפול), לשטוף תאים פעמיים (1 דקות) עם PBS ולתקן עם / 4% סוכרוז / 4% PAF PBS במשך 20 דקות ב RT. התאים הם בדרך כלל במפגש 30-40% ו1.5X10 ⁵ תאים משמשים.
2. Permeabilize תאים עם טריטון 0.15% X-100 ב PBS במשך 5 דקות ב RT ולחסום בסרום 10% נורמלים עז (NGS) בPBS במשך 20 דקות.
3. לדלל את הנוגדן הראשוני של החלבון של עניין ב -10% NGS (לדוגמה: נוגדנים נגד HLF עכבר עיקרי בדילול 1: 1,000). החל הנוגדן הראשוני לתאים.
4. לאחר 4 שעות ב RT או O /N ב 4 ° C, לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 10% NGS. כתם התאים עם נוגדנים משני שכותרתו עם fluorochrome המדולל ב 10% NGS (דוגמא: Fluorochrome עם גל עירור של 488 ננומטר קשור לנוגדן אנטי עכבר 1: 1,000) במשך שעה 1 ב RT בחושך.
5. לשטוף את תאי פעם אחת עבור 5 דקות עם PBS ולהכתים את התאים עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 15 דקות ב RT בחושך.
6. לשטוף את התאים פעמיים ל5 דקות עם PBS. הר לכסות משקפיים בהרכבה בינונית SlowFade לפני ההדמיה באמצעות מיקרוסקופ. התאים מוכנים לניתוח על ידי epifluorescence או confocal עכשיו.
7. השתמש בבקרה שונה על מנת להבטיח את הספציפיות של זיהוי. לדוגמא, ניתן להשמיט את כל הנוגדנים כדי לזהות autofluorescence. הנוגדן הראשוני ניתן להשמיט כדי לקבוע את הכתמים שאינם ספציפיים על ידי הנוגדנים משני. לבסוף, אם אפשר, לשלוט תאים או רקמות שלאלבטא גם המולקולה של עניין ניתן להשתמש.
8. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתאים (epifluorescence או confocal) ומערכות סינון מתאים לתווית הניאון משמשת. יכולות גם להיות מאוחסנות שקופיות בתיבת שקופיות ב< -20 ° C לבדיקה מאוחר יותר.

4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי

1. שמור את הדגימות בחושך כדי למנוע photobleaching. הפעל את מקור האור של המיקרוסקופ נבחר (epifluorescence או confocal).
2. הפעל את המיקרוסקופ. הפעל את המצלמה למיקרוסקופ. שים את השקופיות במיקרוסקופ להדמיה. להוסיף שמן טבילה בשקופית להגדיל את הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית.
3. בחר את המסננים המתאימים. התאם את מיקוד ומטרה מתאימה. התאם את התריסים כדי לזהות את fluorochrome המתאים אבל למנוע photobleaching. שמור את האורות מעל למזער אור רקע כאשר מסתכלים על מדגם.
4. ה שינוימסנני דואר לדמיין fluorochromes השונים (למשל DAPI ולגל עירור של 488 ננומטר). לצלם עם המצלמה.

תוצאות

היכולת של הקו הסלולרי כבד הא-7 להפנים HLF אקסוגני מנוהל הייתה פיקוח באמצעות immunofluorescence על miscroscope confocal. HLF התווסף לתקשורת והתרבות וההפנמה הורשה למשך 24 שעות, לאחר ש, HLF תאי נשטף עם PBS וקרום שייר מחויב HLF היה מושפל עם טיפול טריפסין 5 דקות (1 מיליליטר). תאים היו reseeded ויורשו לחזור ל...

Discussion

מגיפת HCV נותרה איום גלובלי, עם 80% מהחולים שנדבקו זה עתה התפתחות זיהום כרוני, לשים אותם בסיכון של שחמת, אי ספיקת כבד או קרצינומה hepatocellular. סוכנים אנטי מיקוד שכפול HCV והתבגרות פועל-ישיר מייצגים סוכנים אנטי HCV ראש, כפי שהודגם לאחרונה על ידי אישור הרגולטורים של שני מעכבי ns3 N-ס...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Wisent	319-005-CL
PAF	BioShop	PAR070.1	Flammable solid, skin irritant, lungs and eyes
PBS	Wisent	311-425-CL	Without Ca2+ & Mg2+
NGS	Wisent	053-150
AlexaFluor 488-labeled anti-mouse	Invitrogen	A11017
AlexaFluor 568-labeled anti-rabbit	Invitrogeb	A21069
Wheat germ agglutinin Alexa Fluor 488 conjugate (WGA)	Invitrogen	W11261	Potentially mutagenic
Anti-NS5A rabbit	Abcam	ab2594
Anti-hLF mouse	Abcam	ab10110
SlowFade	Invitrogen	S36937
Hoechst stain	Life Techn.	H1399	Potentially mutagenic  and carcinogenic
hLF	Sigma	L0520
Nikon Eclipse visible/epifluorescence Microscope	Nikon	TE2000-E
epifluorescence/confocal microscope	Olympus	FV1000